LiCl溶液中基于固態納米孔的DNA檢測

沙菁　 石鴻佼　 徐　冰

(東南大學江蘇省微納生物醫療器械設計與制造重點實驗室, 南京 211189)(東南大學機械工程學院, 南京 211189)

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LiCl溶液中基于固態納米孔的DNA檢測

(東南大學江蘇省微納生物醫療器械設計與制造重點實驗室, 南京 211189)(東南大學機械工程學院, 南京 211189)

采用陽離子體積較小的LiCl溶液作為緩沖液,研究DNA在不同濃度下通過固態納米孔時的行為特征,以探究DNA的過孔機理.實驗結果表明,當LiCl溶液濃度從0.1mol/L變化到1.0mol/L時,由DNA過孔所引起的相對阻塞離子電流信號比值從0.014 42降低至0.002 79,而DNA完全通過納米孔所需時間從0.30ms增加至1.87ms.對比1mol/LKCl,NaCl,LiCl三種溶液中DNA的過孔結果發現,在LiCl溶液中DNA的過孔時間分別為KCl,NaCl溶液中的6.2和5.3倍,說明LiCl溶液能夠有效降低DNA的過孔速度.此外,實驗發現LiCl溶液中DNA主要以線性非折疊和折疊2種形態過孔． 因此,增加LiCl溶液濃度可延長DNA的過孔時間,但會使相對阻塞離子電流信號幅值降低.

納米孔;LiCl溶液;DNA;阻塞離子電流;過孔時間

納米孔測序技術是下一代基因測序技術中最可行的技術方案之一,主要是通過物理方法直接對DNA序列進行讀取.納米孔測序技術的原理可以簡單描述為: 單個生物分子通過充滿離子溶液的納米孔通道時,會引起通道內電學性質的變化,通過分析離子電流的阻塞信號,可實現單分子檢測,甚至是DNA中4種堿基的辨識[1].納米孔測序技術具有結構簡潔、速度快、操作簡便等特點,故而得到了廣泛的關注[2].

目前,固態納米孔大都利用硅及其衍生物制造而成,一般使用離子束或電子束在硅或其他材料薄膜表面加工出納米尺度的孔徑,再進一步對孔的形狀和大小進行修飾.與生物納米孔相比,固態納米孔具有高穩定性、孔徑大小和通道長度可控、可調節的表面特性以及可與設備結合的優勢[3-5].

納米孔測序技術的關鍵在于對DNA穿過納米孔機理的分析,即對DNA通過納米孔所引起的阻塞離子電流信號進行辨識檢測.對過孔信號起主要影響作用的是緩沖溶液中的正離子,目前的實驗研究一般在KCl或NaCl溶液中進行,但K+和Na+的離子半徑較大,與DNA表面的吸附力不強,在DNA通過納米孔時容易脫落[6].為了深入研究納米孔的過孔機理,本文將LiCl溶液作為緩沖液,研究了不同溶液濃度下DNA通過Si3N4納米孔的行為特征.

1　實驗材料和方法

1.1納米孔的制備

本實驗使用了Si3N4固態納米孔.其加工步驟如下: ① 利用低壓化學氣相沉積技術,在2.5mm×2.5mm×0.4mm的硅基底上沉積一層100nm厚的Si3N4薄膜.② 采用光刻技術和反應離子刻蝕的方法,在Si3N4薄膜一側的中心處加工出一個720μm×720μm的正方形窗口.③ 通過濕法刻蝕技術,在硅基底上刻蝕出一個160μm×160μm的深槽,且刻蝕到Si3N4薄膜時停止.此時,該刻蝕部分薄膜下硅基底已被完全腐蝕,薄膜處于懸空狀態.④ 在膜的中心區域1μm×1μm正方形內,利用離子束刻蝕技術將薄膜減薄至10nm左右.⑤ 在減薄區域采用離子束刻蝕技術加工出一個直徑約30nm的納米孔.

為了減弱實驗過程中電介質產生的干擾噪聲,將納米孔芯片浸泡在125 ℃的食人魚溶液(V(H2SO4)∶V(H2O2)=3∶1)中30min,并用去離子水清洗3遍;然后,以高純氮氣吹干表面水漬,同時在孔口附近涂上一層薄PDMS[7].

1.2實驗原理與方法

實驗原理示意圖如圖1所示．納米孔將導電的電解質溶液分成2個區域.通過施加外電場,產生通過納米孔的基準離子電流.當生物分子通過納米孔時,離子電流被部分阻塞,根據離子電流的波動便可分析生物分子的信息.在本實驗中,被檢測的生物分子為λDNA,它是一種長度為48.5kbp的雙鏈DNA,直徑為2.2nm,等電位為3.5～4.0．當溶液pH=8.0時,DNA表面帶負電.因此,施加相應電場時,DNA在電場力的驅動下可以通過納米孔.

(a) 電壓驅動DNA過孔

(b) 氮化硅納米孔電鏡圖圖1　DNA過孔實驗原理示意圖

實驗在pH=8.0的LiCl溶液中進行,實驗裝置示意圖如圖2所示.首先,在2個液池中加入LiCl溶液.為了使2個液池間的離子運動只發生在納米孔內,將孔的兩端墊上橡膠墊圈密封,并將其與液池組裝在一起,使各孔中心在一條直線上, 從而保證其密封性. 將λDNA(購于Takara公司) 添加在液池的cis端,2個Ag/AgCl電極插入液池中,并連接到HEKA膜片鉗放大器(HEKAEPC10)上,以100kHz采樣頻率、10kHz低通道濾波頻率來檢

圖2　過孔實驗裝置示意圖

測離子電流.為屏蔽外來電噪聲的影響,實驗在法拉第籠中進行.

2　實驗結果和分析

2.1阻塞離子電流信號幅值

DNA過孔時的阻塞離子電流大小主要由DNA占位體積決定,但壁面電荷、DNA帶電量、溶液濃度梯度等也會對其產生影響[8-10].下面研究LiCl溶液濃度為1.0,0.5,0.1mol/L時DNA過孔導致的阻塞離子電流信號幅值變化.

如圖3(a)所示,當施加電壓V0=1 000mV時,不同LiCl溶液濃度下DNA過孔所造成的阻塞離子電流信號幅值接近,峰值均為650pA左右,從事件百分比上看，無法區分不同濃度的LiCl溶液中DNA過孔情況,而利用相對阻塞離子電流信號則不僅可進行有效區分,還能反映出不同濃度對DNA過孔情況的影響.

(a) 阻塞離子電流信號

(b) 相對阻塞離子電流信號圖3　不同濃度下DNA過孔幅值比較

根據孔內離子電流計算公式[11-12],可以推導出相對阻塞離子電流信號與DNA占位體積的關系,即

I0=GΔV

(1)

(2)

ΔI=ΔGΔV

(3)

ΔI=-[I0Λ/(HeffA)][1+f(dm/Dp,lm/Heff)]≈

-I0Λ/(HeffA)

(4)

式中,I0為基準離子電流;ΔI為阻塞離子電流;ΔV為施加的電壓;G為孔的電導;σ為溶液電導率,在1.0mol/LLiCl溶液中σ=8.98S/m;l為氮化硅納米孔膜厚,此處l=10nm;ΔG為電導的變化量;Λ為DNA在孔內的占位有效體積;Heff為納米孔膜的厚度;A為孔口面積;HeffA為納米孔體積;dm為分子直徑；Dp為納米孔直徑；lm為分子長度；為了簡化計算,一般取 f(dm/Dp,lm/Heff)=0.

由式(3)和(4)可知,阻塞離子電流ΔI的變化量與電導ΔG的變化量、DNA在孔內的占位有效體積Λ呈線性相關.因此,可將ΔI/I0等價于ΔG/G[12].由圖3(b)和表1可以看出,當LiCl濃度為1.0,0.5,0.1mol/L時,由DNA過孔所引起的相對阻塞離子電流信號比值ΔI/I0=0.002 79,0.005 08,0.014 42,即隨LiCl溶液濃度的下降,ΔG/G呈現上升趨勢.

當納米孔中充滿電解質溶液時,孔壁和DNA表面會呈現帶電性質,在本文實驗中這兩者都帶負電荷.帶電表面在溶液中會存在電性相反的離子聚集現象,從而形成雙電層[9].雙電層的厚度可用Debye長度κ-1來描述,而Debye長度與溶液濃度c的關系為

(5)

式中,ξ0為電常數;ξr相對靜電介質常數;KB為波爾茲曼常數;T為室內溫度;e為元電荷量.

2.2過孔時間

一般來說,長鏈DNA在電場作用下以線性而非團聚的方式穿過納米孔[13].采用納米孔檢測DNA上堿基的序列,在理論上是可行的.但是,對于目前大多數DNA檢測實驗而言,DNA的過孔速度太快,過孔時間太短,無法達到檢測單堿基的精度要求.因此,對于DNA過孔時間的研究十分必要.

當施加電壓為1 000mV、LiCl溶液濃度為0.1,0.5,1.0mol/L時，DNA的過孔時間見圖4(a).由圖可知,當溶液濃度從0.1mol/L增加到1.0mol/L時,DNA的過孔時間峰值由0.36ms增加到1.87ms,說明隨著LiCl溶液濃度的增加,DNA的過孔時間增大,過孔速度降低.

(a) LiCl溶液

(b) 不同溶液中的DNA過孔時間分布

(c) 不同溶液中的DNA過孔時間峰值圖4　DNA過孔時間分析

在溶液中,DNA的過孔速度與溶液黏度、環境溫度、離子濃度、溶液pH值等因素有關[14-15].改變溶液濃度,會影響吸附在DNA表面的正離子數量[6].當pH=8.0時,DNA表面帶負電荷,LiCl溶液濃度增加,則DNA表面吸附的Li+離子數增加,從而導致DNA的有效凈電荷減少.因此,當DNA在電場力驅動下過孔時,其有效凈電荷下降,驅動力減小,進而導致過孔速度下降,過孔時間變長[6].

另外,對比1.0mol/LLiCl,NaCl,KCl溶液中DNA的過孔時間發現(見圖4(b)和(c)),1.0mol/LLiCl溶液中DNA的過孔時間最長(1.87ms),1.0mol/LNaCl溶液次之(0.35ms),1.0mol/LKCl溶液最短(0.30ms),這與文獻[6]的結論一致.LiCl溶液中DNA的過孔時間分別為KCl和NaCl溶液中的6.2和5.3倍．究其原因在于:這3種陽離子與DNA表面的結合強度不一樣,Li+與DNA結合能力最強,Na+次之,K+最弱[6].DNA過孔時,Li+緊緊吸附在DNA表面,導致DNA的有效凈電荷減少,電場驅動力下降,過孔速度降低; 而K+容易脫落,DNA表面的凈電荷數增加,導致驅動力上升,過孔速度增加.

2.3過孔方式

本實驗中,納米孔直徑為38nm,DNA直徑約2.2nm,即納米孔的直徑明顯大于DNA的直徑.當DNA在電場驅動下過孔時,可能會直接線性非折疊過孔或者折疊過孔,甚至2條DNA同時過孔.

1.0mol/LLiCl溶液中DNA的過孔形態分析結果見圖5．圖5(a)中出現了雙Gauss峰(峰值P1=581pA,P2=819pA).根據納米孔內DNA直徑公式[12],有

ΔG=Gp-GIN=G(d)-G(dIN)

(6)

(7)

式中,d為孔的有效直徑;dIN為DNA在孔內時的等效孔徑.

由式(1)～(3)和式(6)～(7),可以計算出峰值P1對應的DNA直徑d1=2.3nm,該數值接近雙鏈DNA直徑(2.2nm),說明此時DNA以直接線性非折疊線性方式過孔.而峰值P2對應的DNA直徑d2=2.74nm,略大于雙鏈DNA直徑,可判斷為DNA折疊過孔.

由圖5(b)可知,實驗中還存在2條DNA同時過孔的情況,但是數量較少.

圖5(c)為過孔形態示意圖.圖中,過孔形態1為雙鏈DNA直接線性非折疊過孔,過孔形態2為DNA鏈折疊過孔,過孔形態3表示折疊和非折疊的DNA鏈同時過孔.如圖5(d)所示,3種過孔形態所對應的阻塞離子電流信號幅值分別約為600,800,1 200pA.

3　結語

本文研究了DNA在不同濃度LiCl溶液中的過孔行為特征.結果表明,在高濃度Li+環境下,DNA表面雙電層對阻塞離子電流信號幅值的影響可以忽略,但是在低濃度Li+環境下時,雙電層的影響會使得相對阻塞離子電流信號幅值增大.當LiCl溶液濃度由0.1mol/L增加到1.0mol/L時,DNA過孔時間隨之增加,這與DNA表面吸附的陽離子數量有關.因此,增加LiCl溶液濃度可延長DNA的過孔時間,但會使相對阻塞離子電流信號幅值降低.另外,通過比較1.0mol/LLiCl,NaCl,KCl溶液的實驗結果后發現,DNA的過孔時間與陽離子和DNA表面吸附強度有關.最后,對1.0mol/LLiCl溶液中DNA的過孔方式進行了分析,當納米孔的直徑明顯大于DNA直徑時,DNA主要以直接線性非折疊和線性折疊2種方式通過納米孔.

(a) 雙Gauss峰值擬合的DNA阻塞離子電流信號幅值曲線

(b) 阻塞離子電流信號

(c) 過孔形態示意圖

(d) 局部放大阻塞離子電流信號圖5　1.0 mol/L LiCl溶液中DNA過孔形態分析

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DetectionofDNAbasedonsolid-statenanoporeinLiClsolution

ShaJingjieShiHongjiaoXuBing

(JiangsuKeyLaboratoryforDesignandManufactureofMicro-NanoBiomedicalInstruments,SoutheastUniversity,Nanjing211189,China) (SchoolofMechanicalEngineering,SoutheastUniversity,Nanjing211189,China)

ThebehaviorsofDNAtranslocationthroughsolid-statenanoporesinthesolutionswithdifferentconcentrationsarestudiedbyusingtheLiClsolutionwithsmallvolumeofcationsasthebuffersolution,andthemechanismofDNAtranslocationisinvestigated.TheresultsshowthatwhentheconcentrationoftheLiClsolutionincreasesfrom0.1to1.0mol/L,therelativeionicblockagecurrentratiocausedbyDNApassingthoughporesdeclinesfrom0.014 42to0.002 79andthetimeofDNApassingthroughtheporesincreasesfrom0.30to1.87ms.Thecomparisonresultsfor1mol/LKCl,NaClandLiClsolutiondemonstratethatthedwelltimeofDNAintheLiClsolutionis6.2and5.3timesofthoseinKClandNaClsolutions,respectively,indicatingthatthedwellvelocitycanbeeffectivelyreducedbytheLiClsolution.Moreover,DNAisdriventhroughnanoporesinunfoldedandfoldedstatesintheLiClsolution.Therefore,theincreaseoftheLiClconcentrationcanprolongthedwelltimeofDNA,butreducetheamplitudeoftherelativeionicblockagecurrent.

nanopore;LiClsolution;DNA;ionicblockagecurrent;dwelltime

10.3969/j.issn.1001-0505.2016.05.014

2016-02-16.作者簡介:沙菁(1980—)，女，博士，副教授，major212@seu.edu.cn.

國家自然科學基金資助項目(51375092,51675101)、東南大學優秀青年教師教學科研資助項目(2242015R30002).

:10.3969/j.issn.1001-0505.2016.05.014.

TH113;Q78

A

1001-0505(2016)05-0982-05