大氣細顆粒物吸入動物模型建立及適用性評價

鄧元榮，李泳寧，黃曉敏，徐馴宇

(1.福建衛生職業技術學院，福州　350101；2.福建省立醫院胸外科，福建醫科大學省立臨床醫學院，福州　350001)

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大氣細顆粒物吸入動物模型建立及適用性評價

鄧元榮1，李泳寧1，黃曉敏1，徐馴宇2*

(1.福建衛生職業技術學院，福州350101；2.福建省立醫院胸外科，福建醫科大學省立臨床醫學院，福州350001)

目的 建立大氣細顆粒物(PM2.5)氣溶膠慢性吸入致機體損傷的動物模型。方法 制備PM2.5氣溶膠連續吸入裝置。分別考察不同濃度(100±10 μg/m3、150±10 μg/m3、200±10 μg/m3)、不同時間(1周、2周、4周、8周、12周)、不同方法(非暴露氣管內灌注法和氣溶膠吸入法)和不同動物(Wistar大鼠、BN大鼠和豚鼠)對模型建立的影響。觀察動物一般狀態并計算體重增長率與死亡率；檢測肺功能包括呼吸頻率、用力呼氣量占用力肺活量比值(FEV1/FVC)與動脈氧分壓(PO2)；計數支氣管肺泡灌洗液(BALF)細胞分類；光鏡檢查氣管、肺組織病理。以氣管、肺組織病理可見到肺炎為建立成功模型標準，確定建立模型的影響因素。結果不同濃度PM2.5氣溶膠連續吸入8周，Wistar大鼠出現中毒現象，體重增長緩慢，支氣管肺泡灌洗液(BALF)中白細胞總數和單個核細胞計數增加、巨噬細胞比率上升，肺功能指標中呼吸頻率增高、動脈血 PO2和 FEV1/FVC降低，病理示氣管、肺組織出現炎癥及肺纖維化變化，炎癥變化與染毒濃度呈正相關但高濃度死亡率高。持續不同時間(1周、2周、4周、8周和12周)吸入相同濃度，Wistar大鼠染毒動物氣管肺組織病變8周起顯著但與12周無差異。不同方法(非暴露氣管內灌注法和氣溶膠吸入法) Wistar大鼠連續吸入8周，兩法染毒效果相當但吸入法動物死亡率低。Wistar大鼠、BN大鼠和豚鼠不同動物連續吸入8周，三種動物效果相當但Wistar大鼠死亡率低。結論選用Wistar大鼠吸入濃度為150±10 μg/m3的PM2.5氣溶膠連續8周可建立合適的PM2.5致機體損傷動物模型，研究制備一個與PM2.5損傷機體相似的致病環境，率先建立既適合全國大范圍，同時具有福建地區特點PM2.5致機體損傷動物的模型，將促進PM2.5預防與治療措施研究的開展。

PM2.5；氣溶膠吸入；大鼠；豚鼠；模型

大氣灰霾細顆粒物(airborne fine particulate matter,PM2.5)指大氣總懸浮顆粒物中直徑等于或小于2.5 μm的細顆粒物，來源于人為或自然污染源，其成分復雜而可變[1]。人長期暴露在灰霾環境中可導致呼吸、心血管等多系統疾病，患癌風險增加并可引發早死，其長期效應遠遠高于短期效應[2-4]，近年來相關研究日見增多?，F有一次性、短時間、大濃度暴露法所制建立動物模型，很難動態、系統觀察到PM2.5對機體損傷這一長期慢性疾病的病理發生發展全過程，目前國內外均未見PM2.5損害機體的標準動物模型，缺乏穩定的動物模型成為PM2.5損害機體研究的瓶頸問題，限制其防治措施的研究和應用。因此，建立一個適合的動物模型和研究方法，可為評價PM2.5損害機體研究提供客觀、準確的研究手段，同時為探討機制研究提供新思路。本研究針對①選用動物②染毒途徑③染毒濃度④染毒持續時間四個核心問題，主要以氣管、肺臟組織炎癥病理改變為制模成功的標準，總結其變化特點及趨勢，研究各相關指標間的相關性，篩選出適合評價PM2.5致機體損傷的動物模型。

1　材料和方法

1.1實驗動物

清潔級Wistar大鼠200只，體重(160～180) g，2月齡；清潔級BN大鼠30只，體重(160～180) g，2月齡；普通級豚鼠30只，體重(130～160) g，2月齡。以上動物均雌雄各半，購自上海斯萊克實驗動物有限公司[SCXK(滬)2012-0011]。飼養于福建衛生職業技術學院SPF級屏障系統動物實驗室[SYXK(閩)2012-0006]。

1.2實驗儀器

TH-150C大流量 PM2.5 環境采樣器(美國 Thermo 公司)；KQ-100DB型超聲波清洗機(昆山超聲儀器有限公司)；Alpha2-4 型冷凍干燥機 (德國 Christ 公司)； 超細勻漿機(上海洽姆儀器科技有限公司)；日立7080全自動生化分析儀(日本日立公司)；Model J2-21低溫高速離心機(德國貝克曼公司)；RM6240-BD生物信號采集分析系統(成都儀器廠)；yuyuE402AI多功能超聲霧化器(江蘇魚躍醫療設備有限公司)。

1.3實驗方法

1.3.1PM2.5的采集及處理

大流量PM2.5 環境采樣器在福州市市區連續采樣，收集全年所采樣品[5]。將載有細顆粒物的玻璃纖維濾膜濾膜剪成約l cm小塊，浸泡于純化水中，超聲震蕩30 min，共4次，洗脫顆粒物，6層紗布過濾震蕩液，集中濾液于4℃、3000 r/min離心20 min后收集下層懸液。采用減量法計算，用生理鹽水稀釋至所得懸液濃度為555.6 μg/mL，一部分懸液密封，剩余部分懸液置于玻璃平皿中并冷凍真空干燥，均置于低溫冰箱保存備用。

1.3.2Wistar大鼠吸入PM2.5動物模型的建立

1.3.2.1動物分組與染毒

Wistar大鼠50只，隨機分為正常組、空白組、染毒高濃度組、染毒中濃度組和染毒低濃度組5組，每組10只，標記并分籠飼養。正常組不作處理，空白組和染毒各組動物均采用氣溶膠吸入法：用生理鹽水配制PM2.5混懸液并滅菌，多功能霧化器將混懸液以1.8 mL/min流速向自制密封容器(容積約5 L)開始噴霧，容器另一端有一個出口以保證容器內氣霧正常流動，到玻璃容器內全部充滿白色霧為準，氣溶膠達到要求濃度，按實驗前拉丁方方法安排好的順序依次將動物放入吸入裝置中，自然呼吸，接受染毒，每天6 h(9：00～15：00)，每周5 d，連續8周。染毒濃度根據國標大氣中24 h平均濃度必須小于75 μg/m3，取(200±10) μg/m3、(150±10) μg/m3、(100±10) μg/m3分別為高、中、低濃度組?？瞻捉M換成生理鹽水吸入。

1.3.3觀察指標

1.3.3.1一般狀態

每日染毒后觀察動物的精神狀態、飲食情況、活動及死亡變化。計算動物死亡率和實驗結束時體重增長率。

1.3.3.2肺功能檢測

室溫控制于22℃～25℃，動物體溫維持約37℃，采用2%巴比妥鈉(12 mg/kg)腹腔注射麻醉動物。固定動物，RM6240-BD生物信號采集分析系統觀察并記錄大鼠呼吸頻率、幅度；再解剖暴露氣管，檢測動物肺功能包括呼吸頻率、用力呼氣量占用力肺活量比值(FEV1/FVC)；而后暴露腹腔，少許肝素鈉抗凝，行腹主動脈穿刺取血，血氣分析動脈氧分壓(PO2)。

1.3.3.3支氣管肺泡灌洗液(BALF)制備和指標檢測

脫臼處死大鼠，將肺臟完整取出，結扎左側肺葉并分4次共注入12 mL的預冷PBS緩沖液，按摩肺部以盡量回收BALF?；厥找?800 r/min離心10 min，收集底部細胞懸液，取懸液1滴于載玻片上并與預滴1滴的PBS均勻混合，涂血涂片，自然干燥，行吉瑞染色，顯微鏡下觀察，計數白細胞總數、單個核細胞數(主要包括淋巴細胞和單核細胞)。

1.3.3.4支氣管、肺組織處理與病理檢查

將氣管和右側肺組織浸入福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋，常規HE染色，制備5 μm 切片，光鏡下觀察氣管、肺組織病理學形態變化。氣管、肺組織病理改變評價標準：“-”氣管和肺組織未見明顯病變；“+”氣管和肺間質有少量炎癥細胞，氣管粘膜下腺體輕度擴張，肺間質有不多的炎癥細胞浸潤；“++”氣管間質有較多的炎癥細胞浸潤，部分氣管粘膜上皮脫落，固有層腺體中度擴張，肺間質有較多的炎癥細胞浸潤，部分肺泡代償性擴張；“+++”氣管纖毛柱狀上皮增生，間質有大量炎癥細胞浸潤，固有層腺體增生、擴張，肺間質有大量炎癥細胞浸潤，肺泡代償性擴張，部分肺泡融合。

1.3.4不同染毒時間對動物模型建立的影響

Wistar大鼠70只，隨機分為正常組、空白組、染毒大組(1周、2周、4周、8周和12周組)7組，每組10只。采用氣溶膠吸入法，染毒時間分別為1周、2周、4周、8周和12周，濃度均為150±10 μg/m3。觀察指標為死亡率、體重增長率、氣管和肺組織病理變化。

1.3.5不同染毒方法對動物模型建立的影響

Wistar大鼠50只，隨機分為5組，正常組、吸入法大組、灌注法大組，各大組再分別設空白組與染毒組，每組10只。采用氣溶膠吸入法和非暴露氣管內灌注法，染毒時間8周。吸入法濃度(150±10) μg/m3。非暴露氣管內灌注法：采用乙醚麻醉，動物豎立以保持直立體位，將預吸好的PM2.5懸液1 mL迅速經氣管插管注入，左右來回旋轉并按摩雙肺10次，使PM2.5進入肺內并均勻分布，每天1次，每周5 d。觀察指標為死亡率、體重增長率、氣管和肺組織病理變化。

1.3.6不同染毒實驗動物對動物模型建立的影響

Wistar大鼠、BN大鼠和豚鼠各30只，隨機分為Wistar大鼠大組、BN大鼠大組和豚鼠大組，各大組再分別設正常組、空白組與吸入組，每組10只。采用PM2.5氣溶膠吸入持續8周，濃度(150±10) μg/m3。觀察指標為死亡率、體重增長率、氣管和肺組織病理變化。

1.4統計學方法

2　結果

2.1Wistar大鼠PM2.5吸入動物模型的建立

2.1.1一般狀態

適時適度澆水，勿使田間受旱，可減輕紅蜘蛛危害；加強巡查及時施藥，把紅蜘蛛消滅在點片發生階段。藥劑可選20%雙甲脒乳油1500～2000倍液，或75%克螨特乳油1000～1500倍液，或25%滅螨猛可濕粉1000～1500倍液，或45%超微硫磺膠懸劑400倍液，或20%復方瀏陽霉素乳油1000倍液，或5%唑螨酯（霸螨靈）懸浮劑1500～2000倍液，或25%倍樂霸（三唑錫）可濕粉1000倍液。交替噴施2～3次，隔7～10天1次，噴勻噴足。

染毒各組持續吸入 PM2.5氣溶膠共8周，前4周動物表現活動減少、精神稍差、靜伏少動、食量下降，后4周癥狀加重，出現明顯的精神倦怠、活動減少、皮毛無光澤；動物體重均出現增長緩慢，高濃度組與正常組比較有顯著差異性(P< 0.05)；高濃度組動物死亡率10.0%(1/10)。正常組與空白組動物未見明顯異常。(表1)

表1　Wistar大鼠體重與死亡率變化結果

注：*P< 0.05，與正常組比較。

Note.*P< 0.05，compared with the normal group.

表2　Wistar大鼠肺功能指標檢測結果

注：*P< 0.05，與正常組比較。

Note.*P< 0.05，compared with the normal group.

表3　大鼠氣管肺泡灌洗液(BALF)細胞分類計數檢測結果

注：*P< 0.05，與正常組比較。

Note.*P< 0.05，compared with the normal group.

2.1.2動物肺功能測定

染毒大鼠出現呼吸頻率顯著加快、FEV1/FVC升高、PaO2減小，高、中濃度組與正常組具有顯著性差異(P< 0.05)?？瞻捉M與正常組比較無差異性(P> 0.05)(表2)。

2.1.3氣管肺泡灌洗液(BALF)細胞分類計數

肉眼觀察BALF，正常組與空白組較清，而染毒動物組較混濁，但均無明顯顆粒沉積。BALF細胞計數中，三個染毒濃度組白細胞總數計數和單個核細胞計數均增加，巨噬細胞比率以高、中濃度組上升，均具有顯著性差異(P< 0.05)?？瞻捉M與正常組比較無差異性(P> 0.05)(表3)。

2.1.4氣管、肺組織病理變化

病理光鏡觀察示：正常組與空白組大鼠氣管、肺組織結構較為正常，氣管可見柱狀上皮細胞，肺泡結構完整，細胞排列較整齊，肺間質偶見炎性細胞；染毒部分動物氣管擴張，腔內有炎性細胞和黏性分泌物，柱狀上皮細胞出現增生，嚴重呈假復層狀態，出現明顯的炎癥反應，肺組織肺間質有大量的炎性細胞浸潤，間質瘀血水腫，肺間隔增厚，可見成纖維細胞，呈輕度纖維化，以上病理改變隨濃度的增加而明顯(圖1，2)。

注：(A)正常組；(B)空白組；(C)高劑量組；(D)中劑量組；(E)低劑量組。圖1　各組Wistar大鼠氣管組織病理光鏡觀察(bar=200 μm)Note.(A)normal group；(B)control group；(C)high group；(D)middle group；(E)low group.Fig.1　The pathological changes of bronchial tissues under light microscope

注：(A)正常組；(B)空白組；(C)高劑量組；(D)中劑量組；(E)低劑量組。圖2　各組Wistar大鼠肺組織病理光鏡觀察(bar=200 μm)Note.(A)normal group；(B)control group；(C)high group；(D)middle group；(E)low group.Fig.2　The pathological changes of lung tissues under light microscope

隨染毒時間延長：染毒動物死亡率呈升高，染毒8周死亡率10%，染毒12周死亡率達30%；體重增長率也增長延緩；各組動物氣管組織和肺組織病變發生率呈升高(30%、50%、80%、100%、100%和30%、40%、80%、100%、100%)；均值連續染毒4周起變化顯著，較正常組有顯著差異性(P< 0.05)，且與染毒時間呈一定正相關?？瞻捉M與正常組比較，各指標均無顯著差異性(P> 0.05)。進行各染毒時間組間均值秩和檢驗發現氣管病變無顯著差異性(P> 0.05)，而肺組織病變有顯著差異性(P< 0.05)，結合死亡率考慮染塵時間以8周為佳(表5)。

2.3不同染毒方法對PM2.5吸入動物模型的建立影響

采用不同染毒方法：灌注法與吸入法染毒組動物死亡率分別為30%和10%；兩染毒組氣管和肺組織病變均值都較正常組高且有顯著差異性(P< 0.05)。各空白組與正常組比較，各指標均無顯著差異性(P> 0.05)。進行兩染毒組間均值秩和檢驗發現無顯著差異性(P> 0.05)，考慮兩種方法效果相當，因灌注法死亡率高，可選擇吸入法為佳(表6)。

表4　Wistar大鼠氣管、肺病理變化結果(n=10)

注：*P< 0.05，與正常組比較。

Note.*P< 0.05，compared with the normal group.

表5　不同染毒時間對PM2.5吸入動物模型建立影響結果(n=10)

注：*P< 0.05，與正常組比較。

Note.*P< 0.05，compared with the normal group.

表6　不同染毒方法對PM2.5吸入動物模型的建立影響結果(n=10)

注：*P< 0.05，與正常組比較。

Note.*P< 0.05，compared with the normal group.

2.4不同染毒實驗動物對PM2.5吸入動物模型的建立影響

選用Wistar大鼠、BN大鼠和豚鼠作為實驗動物吸入染毒結果：死亡率分別為0%、20%、60%；BN大鼠和豚鼠體重增長率較??；氣管和肺組織病變發生率分別為80%、80%、90%和90%、80%、90%。各染毒組間的氣管與肺組織病變均值進行組間秩和檢驗發現無著差異性(P> 0.05)，考慮三種動物效果相當，綜合動物死亡率情況，考慮選擇Wistar大鼠。各空白組與正常組比較，各指標均無顯著差異性(P> 0.05)(表7)。

表7　不同染毒實驗動物對PM2.5吸入動物模型的建立影響結果(n=10)

注：*P< 0.05，與正常組比較。

Note.*P< 0.05，compared with the normal group.

3　討論

PM2.5可對機體產生多器官、多靶點的損傷，是一個慢性、長期的病理變化過程，呼吸系統是主要的靶器官，近年來有關于其損傷研究多以肺組織病理可見到肺炎為標準[6-8]，損傷機理主要考慮與氧化應激損傷、炎性反應、體液免疫應答和局部粘膜免疫有關。本研究采用PM2.5氣溶膠吸入法，結果發現Wistar大鼠經吸入染毒后，出現全身中毒表現，BALF中白細胞總數計數、單個核細胞計數和巨噬細胞比率上升，氣管、肺組織病理學檢查結果顯示出現明顯炎癥反應和肺間質出現纖維化病變，病理學改變與肺功能相關性發現隨著肺泡炎及肺纖維化程度的加重，動物呼吸頻率增高，FEV1/FVC和動脈血 PO2降低，此結果也反映肺部病理變化與肺功能改變的一致性，并進一步證實PM2.5吸入同時引起限制性通氣障礙和(或)阻塞性通氣障礙、通氣/血流比失調及肺間質纖維化肺泡-毛細血管膜增厚而致彌散功能障礙如慢性氣管炎、肺氣腫等。以氣管、肺組織出現炎癥病理改變為建立動物模型標準，結果表明PM2.5氣溶膠吸入染毒法可引起明顯炎癥病理改變，動物模型建立合適。

研究考察不同吸入濃度、不同染毒時間、不同品系動物和不同方法對模型的影響。結果吸入濃度與動物病變嚴重程度、死亡情況呈正相關，高、中濃度動物病變明顯且相似，但高濃度動物死亡率較高?？疾觳煌径緯r間實驗中，連續染毒8周起動物死亡率和氣管、肺組織病變變化顯著，但與12周無差異，而染毒12周死亡率達30%。選用目前常用的動物，Wistar大鼠是使用最廣泛的大鼠品系之一，其生活習性繁殖規律容易受到外界的氣溫、氣壓、濕度、噪聲等方面的影響，BN大鼠血清中IgE表達水平較高，更容易模擬過敏的生理狀態，在I型超敏反應研究中應用較多，豚鼠有IgG和IgE兩種類型的變態反應抗體，適于研究遲發型過敏性和速發型過敏反應，是最常用的評價藥物過敏反應的動物模型，結果發現三種動物的氣管與肺組織病變相當，但死亡率豚鼠最高，Wistar大鼠最低，考慮豚鼠對PM2.5過于敏感，BN大鼠死亡率較高，以選用Wistar大鼠建模為佳?，F有研究的染毒途徑主要采用PM2.5懸液經暴露氣管注入法或非氣管暴露氣管內灌注，前者會對動物產生有創損傷，后者則動物可有麻醉過深、氣管粘膜損傷出血、混懸液窒息、縱隔血腫、肺部感染等，且兩者的死亡率高，也難以模擬實際的病理過程，若采用PM2.5氣溶膠吸入法，與實際引起的損傷病理過程更為類同，死亡率也可大大降低，實驗比較非氣管暴露氣管內灌注和慢性氣溶膠吸入法，發現氣管、肺組織病變率相似，故認為兩者效果相似，吸入法較灌注法動物死亡率低，且可更真實的反映病理過程，更適合用于建立模型。

本研究制備一個與自然條件相似的致病環境進行PM2.5氣溶膠吸入，結果表明選用Wistar大鼠吸入濃度為(150±10) μg/m3的PM2.5氣溶膠持續8周可建立合適的PM2.5致機體損傷動物模型。模型可適合全國大范圍使用，同時PM2.5成分因不同地區的有所不同，采用本地區來源的PM2.5建模具有地區特色，為本地區PM2.5的預防和治療方法開展研究奠定基礎。PM2.5致機體損傷是多靶器官的，除呼吸系統外其它的靶器官確立及其損傷機理研究均有待后續研究。

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Establishment and evaluation of animal model induced by inhalation injury of airborne fine particulate matter

DENG Yuan-rong1，LI Yong-lin1，HUANG Xiao-min1，XU Xun-yu2*

(1. Fujian Health College, Fuzhou 350101, China; 2. Department of Thoracic Surgery, Fujian Provincial Hospital;Provincial Clinical Medical College of Fujian Medical University, Fuzhou 350001, China;)

Objective To establish and evaluate the animal model induced by inhalation injury of airborne fine particulate matter (PM2.5). Methods We manufactured equipment for rats aerosol inhalation with PM2.5. The effects of several facters such as concentrations(100±10 μg/m3、150±10 μg/m3、200±10 μg/m3)、time(1w、2w、4w、8w、12w)、method (non-exposed intratracheal instillation method and aerosol inhalation) and animals (Wistar rats, BN rats and guinea pigs) were investigated to establish the model. The respiratory rate, forced vital capacity ratio of forced expiratory volume (FEV1/FVC) and arterial partial pressure of oxygen (PO2) were measured, the pathological changes of bronchial and lung tissues under light microscope were observed. The success animal model was builded as the pneumonia was observed from the pathological changes of lung tissue. ResultsThe Wistar rats exposed to PM2.5 aerosol inhalation for 8 weeks, we can see that the weight growth rate of rat decreased, WBC count and mononuclear cells countincreased, the macrophages ratio decreased in BALF, the respiratory rate of lung increased while arterial PO2and FEV1/FVC decreased, inflammation and pulmonary fibrosis changes were observed by bronch and pulmonary pathology, inflammatory changes with a dose-response relationship were observed. Exposed to PM2.5 aerosol inhalation for different time(1 w、2 w、4 w、8 w、12 w)with same dose, the score issue lesions of lung and bronchus in Wistar rats increased and the 8w group is obvious. The Wistar rats exposed to PM2.5 with different method (aerosol inhalation and non-exposed intratracheal instillation method) for 8w, the aerosol inhalation worked as effectively as perfusion while mortality rate of aerosol inhalation is lower. Different animals (Wistar rats, BN rats and guinea pigs) exposed to PM2.5 aerosol inhalation for 8w, the same results were observed with three method respectively while mortality rate of Wistar rats lower. ConclusionsThe optional conditions that the Wistar rats were continuously inhaled for 8w PM2.5 with a dose of 150±10 μg/m3were established. The animal model could be used on a national scale, especially in Fujian province. The results would be useful for the development of the research of the prevention and countermeasures of PM2.5 pollution.

PM2.5; Aerosol inhalation; Rat; Guinea pigs; Model

福建省實驗動物研究科技計劃重點項目(2013Y0085)；福建省科技計劃引導性項目(2015Y0004)。

鄧元榮(1979-)男，碩士，副教授，專業：新藥藥理研究。E-mail: dyr777@163.com。

徐馴宇(1968-)男，博士，主任醫師，副教授，專業：心胸外科。E-mail: xunyux@126.com。

研究報告

R-332

A

1671-7856(2016)09-0042-08

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.09.008

2016-04-01