小鼠睪丸不同階段生精上皮細胞的發育形態學研究

吳楓王行明

（1.中國人民解放軍疾病預防控制所 北京 100071；2.中南大學生殖與干細胞研究所 湖南長沙 410078）

小鼠睪丸不同階段生精上皮細胞的發育形態學研究

吳楓1*王行明2

（1.中國人民解放軍疾病預防控制所 北京 100071；2.中南大學生殖與干細胞研究所 湖南長沙 410078）

目的：研究小鼠生精上皮各類細胞發育過程中形體學特征以及異常發育的生精細胞形態 方法： PAS染色正常成年小鼠睪丸，通過光學顯微鏡觀察每種上皮細胞的形態學特征。結果：小鼠生精上皮分為Stage I-XII不同階段，在精子細胞分化、分裂的同時呈現出動態變化，生精上皮中的精子細胞包括精原細胞、減數分裂間期細胞（L、Z、P、D）、次級精母細胞、圓形精子細胞、長形精子細胞。每種細胞都具有明顯形態學特征。結論：根據生精上皮細胞的形態特征可以判斷小鼠不同類型精子發育是否正常，對于利用小鼠動物模型來研究生殖系統功能的研究有重要意義。

生精上皮 PAS染色 形態特征

精子細胞是由睪丸內原始生精細胞連續的有絲分裂和兩次減數分裂而成,接著精子細胞發生形態學的變化最終形成成熟的精子。精子發生過程中生精上皮細胞的形態不斷發生變化,通過顯微鏡觀察睪丸組織某個特定發育階段的生精上皮可以發現含有不同類型的生精細胞。其中原始精原細胞分布在靠近基底膜（basal compartment）的遠腔端,而減數分裂細胞、減數分裂后期細胞分布隨著發育的進度越來越靠近生精上皮的近腔端（adluminal compartment）［1］。本文以小鼠生精上皮作為研究對象,通過不同的形態學特征可以將其分為12個階段,每個階段的生精細胞都具有典型的形態性特征。通過bouin氏固定液固定睪丸組織能夠清楚的觀察核內染色體的形態特征,而通過PAS（過碘酸雪夫氏染色）可以標記發育過程中的頂體,能夠區分每個階段的生精上皮中的圓形精子細胞。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究使用的成年C57BL/6實驗小鼠購自賽業生物科技有限公司。體重35g-50g,全部為正常雄性野生型小鼠。

1.2 方法

主要儀器和試劑光學顯微鏡（Olympus BX51,日本） PAS試劑盒（Promega）。組織形態學觀察睪丸用Bouin＇s液固定,常規脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋,制成5 μm厚切片,進行常規PA S染色（Periodic Acid-Schiff）,并用蘇木素復染,以分析完整的曲細精管形態,中性樹膠封片,光鏡下觀察。

2 結果

2.1 I （圖A）

Stage I中的Step1是由次級精母細胞（secondary spermatocyte）分裂而來,相比次級精母細胞體積小30%-40%,早期的精子細胞核分布不規律、核染色深,不具備可區分的形態學特征。Step1結束后出現早期頂體顆粒（proacrosomal granules）。Step13的頭部形態以及核凝集程度在Stage I呈現多樣性。在同一個Stage I 能看到未凝集的精子細胞,然而Step13頭部在形態上已經接近于釋放出的精子,只是缺少隨后的修飾。這一時期的粗線期精母細胞的核內大部分由“粗條形”和“細繩狀”的染色體組成,染色體之間幾乎沒有空隙,細胞與細胞核大體呈圓形。

2.2 II-III （圖B）

Step3內高爾基器和精子細胞核之間出現的含有頂體顆粒的“小圓圈”區域是這個時相的標志（圖B,箭頭）。通常頂體顆粒染色較淺。Step14頭部變寬縮短,越來越接近成熟的精子頭部形態,頭部頂端“彎鉤”特征明顯（圖B 白箭頭）。在II時相末期,A型精原細胞分裂形成中間型精原細胞,核近似卵圓形且染色均一。

2.3 IV-V （圖C-D）

Stage IV這一階段典型特征是頂體顆粒開始貼著核膜慢慢展平（箭頭）。頂體邊緣與核中心形成40°之內的范圍都是Stage IV。Step15在形態上更加接近精子頭部,但是Step14、Step15和Step16在PAS染色很難區分,電鏡可以通過觀察線粒體鞘的形成判斷精子發生的階段。Stage V末期發生中間型精原細胞向B型精原細胞的分裂,二者在形態上相似。但是B型精原細胞比中間型精原細胞染色質多,與基底膜連接位置較平。這個時相的粗線期精母細胞加快變大并且出現性泡。Step5精子細胞沿核膜的頂體能在PAS染色下清晰可見,且與核中心形成的角度不超過95。

2.4 VI （圖E）

在Stage VI晚期,大部分B型精原細胞分化成為細線前期初級精母細胞,B型精原細胞沿著核包膜呈現出染色質“斑塊”,而PI在胞體和胞核都較小,這也是二者的主要區別。Step6精子細胞的頂體繼續沿核周伸展,大約覆蓋核周三分之一（95-120）。StageVI時期的粗線期初級精母細胞與前面階段不同,可以剛好清楚的發現性顆粒（sex vesicle）（白箭頭）,其形態呈現圓形或卵圓形,核內“板塊”染色有輕有重,染色體間的空隙增大。PAS染色發現Step15與前面兩個階段的Step15無明顯差異。

2.5 VII （圖F）

PI要比B型精母細胞小,核更圓。PI的核膜周分布著“圓圈狀”的染色體,染色體厚度不均一。在VII后階段PI向細線期精母細胞（L）轉化,從基底膜向近腔端位移。Step7頂體延伸的角度超過120-150,核位于細胞中心處。而Step16更加靠近官腔。StageVII 的P在體積上明顯變大且染色體形態不規則,性顆粒和高爾基復合器變得明顯且增大。

2.6 VIII （圖G）

圖A-K 分別代表小鼠不同的生精上皮階段Stage I-XII，As， A型精原干細胞；B，B型精原干細胞；PI，減數分裂細線前期細胞；L，細線期初級精母細胞；Z，偶線期初級精母細胞；P，粗線期初級精母細胞；D，雙線期初級精母細胞；M-I，減數分裂期細胞I；M-II，減數分裂期細胞II；2？，次級精母細胞；Step1-16，1-16階段的單倍體精子細胞，Ser，支持細胞；Bar，20 μm。

StageVII晚期,就發生了PI向L細胞轉化。PI核內成團的染色體逐漸消失,有“斑點”狀的核物質出現,最后“斑點”消失后細線狀的染色體出現在胞核內。這個階段的粗線期精母細胞體積上繼續增大,核內染色體染色比VII稍重。Step8精子細胞頂體與胞核表面接觸,頂體延伸達到170°到180°胞核和頂體對向生精上皮的基底膜。高爾基復合體移動到細胞尾端,此時的Step8細胞開始慢慢延長,胞核慢慢成錐形移向末端。很多Step16精子細胞在Stage VIII早期釋放到生精管墻內。

2.7 IX-X （圖H、I）

Stage IX中Step9胞核頂端慢慢變平,細胞整體延長。此階段L中出現幾個“小斑點”,而P中核內物質染色較輕。Stage X的標志性特征是Step10頭部腹側“彎鉤”,PAS染色發現Step10頭部“腹角”（ventral angle）更加明顯。這時期的P相比胞核和性顆粒比染色輕,體積持續增大。此外L正向Z發生轉變,染色體變厚變粗,胞體和胞核呈現圓形。

2.9 XI-XII （圖J-K）

Step11頭部背角在StageX-XI過程中形成,且Step11染色加深,形態上比Step10長。D體積大與前面階段的初級精母細胞,高爾基符合體明顯,胞核不規則染色。Stage X中2°要比I實相的Step1在體積上大三分之一。在這個實相中,減數分裂實相細胞（M）所占比例大, M-II比M-I體積上大60%到70%。此外,Z到P的轉變,由于二者體積性太相似,無法從形態上區分。Step12的核輪廓長且細,頂體染色后呈現出“鈍角”。

3 討論

本文同過系統描述小鼠生精上皮細胞的形態特征以及它們在發育過程中的變化,更加清晰的展示出生精上皮細胞的分化過程,有助于清楚辨別不同生精上皮細胞的發育階段。傳統的方法是在普通HE染色或蘇木精復染標本上對精子發生周期進行簡單劃分的方法。趙杰［2］等人采用PAS染色法與普通HE染色法相對照,對比觀察小鼠睪丸各級生精上皮在精子發生不同時期的形態學變化特點。低倍鏡下,通過頂體的染色可以清楚的分辨出不同階段的生精上皮（StageI-XII）,高倍鏡下,頂體特征更加明顯如“點狀”StageII-III,“平狀”Stage IV,“彎曲狀”StageVI,在研究中這些分子標志物的使用有利于分析突變小鼠精子發生功能是否異常。此外,除了可以用形態學的方式辨別生精上皮細胞的類型,很多生精細胞表達特異性的結構蛋白。例如Pou5f1/Oct4等都可以作為生精上皮精原細胞的標記分子［3］。SCP3是生殖細胞減數分裂中聯會復合體形成必需的組成,可以用來標記減數分裂［4］。部分SP-10特異性表達在精子細胞的頂體,通過免疫顯色反應發現Sp-10清晰的表達在頂體［5］。本研究細描述了每一類生精上皮細胞的形態學特征,為今后小鼠生殖系統基因的相關功能研究提供形態學基礎。

［1］De Kretser D M，Loveland K L， Meinhardt A，et al. Spermatogenesis.［J］.Hum Reprod，1998，13 Suppl 1：1-8

［2］趙潔，侯武剛，張遠強.小鼠生精周期判定方法的改進［J］.中國組織化學與細胞化學雜志，2006（2）：130-134.

［3］王洪，李澤惠，邱學德.精原干細胞標志物的研究進展［J］.醫學綜述，2010，16（7）：982-985.

［4］侯越，吳應積，羅奮華，等.絨山羊Scp3基因的克隆及睪丸中第一輪減數分裂的發生［J］.動物學研究，2009，30（3）：341-344.

［5］Kurth B E，Klotz K，Flickinger C J，et al.Localization of sperm antigen SP-10 during the six stages of the cycle of the seminiferous epithelium in man.［J］.Biology of Reproduction， 1991，44（5）：814-21.

Q2

A

1674-2060（2016）03-0003-02

吳楓