3-溴丙酮酸對肝癌Bel7402細胞凋亡及相關蛋白表達的影響

潘　瓊，任　凱，崇殿龍，張智瑞，周　燦，劉　浩，趙素容

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·基礎醫學·

3-溴丙酮酸對肝癌Bel7402細胞凋亡及相關蛋白表達的影響

潘瓊，任凱，崇殿龍，張智瑞，周燦，劉浩，趙素容

目的：觀察糖酵解抑制劑3-溴丙酮酸對肝癌Bel7402細胞凋亡的影響，并探討其作用機制。方法：采用MTT法檢測3-溴丙酮酸對Bel7402細胞的增殖抑制效應，PI單染流式細胞術檢測不同濃度3-溴丙酮酸(0、50、100、200 μmol/L)對Bel7402細胞凋亡的影響，ATP檢測試劑盒分析細胞內ATP水平，Western blot檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax的表達。結果：3-溴丙酮酸可濃度和時間依賴性地抑制Bel7402細胞的增殖(P<0.01)，作用24、48、72 h的IC50值分別為422.9、143.9、85.0 μmol/L。3-溴丙酮酸可誘導Bel7402細胞發生明顯的細胞凋亡，50、100、200 μmol/L 3-溴丙酮酸作用24 h的細胞凋亡率均明顯高于對照組(P<0.01)。ATP水平檢測結果表明，3-溴丙酮酸可明顯降低Bel7402細胞內的ATP水平(P<0.01)。Western blot結果顯示，3-溴丙酮酸可下調凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達，并上調凋亡誘導蛋白Bax的表達。結論：3-溴丙酮酸具有誘導肝癌Bel7402細胞凋亡的作用，其機制可能是通過引起細胞內ATP降低、調節細胞凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達。

肝臟腫瘤；3-溴丙酮酸；細胞凋亡

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，發病率和死亡率高。我國是全球肝癌發病率和病死率最高的國家，肝癌患者約占全球的55%。手術治療是肝癌的首選治療方式，然而，許多患者由于遠處轉移、肝功能不全、健康狀況差等原因而無法手術切除，使藥物治療在降低腫瘤復發、轉移以及延長患者帶瘤生存期等方面起著十分重要的作用。研究[1-4]發現，糖酵解抑制劑3-溴丙酮酸對肝癌、鼻咽癌、乳腺癌等顯示了良好的抗腫瘤效應，對腫瘤細胞有高度的選擇性，且能殺傷耐藥的腫瘤細胞，其作為抗腫瘤新藥的研究引起了廣泛關注。本實驗研究3-溴丙酮酸對肝癌Bel7402細胞凋亡的影響，并探討其作用機制。

1　材料與方法

1.1主要試劑DMEM培養基、胰蛋白酶購自Gibco公司，胎牛血清購自浙江天杭生物科技公司，3-溴丙酮酸、MTT、PI購自Sigma公司，Bcl-2、Bax、β-actin抗體購自Santa Cruz公司，HRP標記的山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG購自博士德生物工程公司，ATP檢測試劑盒購自碧云天公司。

1.2細胞株肝癌細胞株Bel7402由中山大學惠贈。培養于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養基中，置37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中常規培養。

1.3MTT比色法檢測細胞增殖取對數生長期的Bel7402細胞接種于96孔細胞培養板中，每孔8×103個細胞。培養過夜待細胞充分貼壁后換液加入不同濃度的3-溴丙酮酸(25、50、100、200、400 μmol/L)，另設溶劑對照組和空白對照組，每組設3個復孔，培養24、48、72 h后每孔加入15 μL MTT溶液繼續孵育4 h，棄上清液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，振蕩使結晶物充分溶解，用酶標儀測定570 nm波長下的吸光度值(A570 nm)，計算細胞的存活率。細胞存活率(%) =(處理組A570 nm-空白組A570 nm)/(對照組A570 nm-空白組A570 nm)×100%。

1.4PI單染流式細胞術檢測細胞凋亡將Bel7402細胞接種于12孔細胞培養板中，每孔2×105個細胞，待細胞貼壁后換液加入不同濃度的3-溴丙酮酸(50、100、200 μmol/L)處理細胞，同時設溶劑對照組，每組3個復孔。培養48 h后胰酶消化收集細胞，PBS洗1次，加預冷的75%乙醇于4 ℃或-20 ℃固定過夜。檢測前用PBS洗2次，將細胞重懸于含PI(50 μg/mL)和RNase A(100 μg/mL)的PBS中，室溫避光孵育30 min，上機檢測具sub-G0/G1期DNA含量的細胞比例。

1.5細胞內 ATP水平檢測將Bel7402細胞接種于12孔細胞培養板中，每孔2×105個細胞，培養24 h后換液加入終濃度為50、100、200 μmol/L的3-溴丙酮酸處理細胞，同時設溶劑對照組，每組3個復孔。處理4 h后收集細胞。采用ATP檢測試劑盒，根據說明書進行操作，以酶標儀測定化學發光強度值。用實驗組的化學發光強度值與對照組的化學發光強度值的比值確定各組的細胞內ATP水平。

1.6Western blot檢測凋亡相關蛋白Bcl-2及Bax的表達將Bel7402細胞接種于6孔細胞培養板中，每孔5×105個細胞，培養至90%匯合后，換液加入終濃度為50、100、200 μmol/L的3-溴丙酮酸處理細胞。培養24 h后收集細胞，每孔加入50 μL預冷的RIPA蛋白裂解液，冰上裂解30 min，提取細胞總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度。每組取40～50 μg蛋白進行12% SDS-PAGE電泳，轉膜至PVDF膜，室溫封閉2～3 h，一抗4 ℃過夜或室溫孵育2～3 h，TBST 洗膜3次，相應二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜3次，化學發光增強試劑盒顯影，Bio-Rad 凝膠成像儀對膜進行曝光獲取圖像。

1.7統計學方法采用方差分析和q檢驗。

2　結果

2.13-溴丙酮酸對肝癌Bel7402細胞增殖的影響MTT檢測結果表明，3-溴丙酮酸在25～400 μmol/L濃度范圍內對Bel7402細胞的增殖具有明顯的抑制作用(P<0.01)，且具有時間和濃度依賴性，作用24、48、72 h的IC50值分別為422.9、143.9、85.0 μmol/L(見表1)。

q檢驗：與對照組比較**P<0.01；與50 μmol/L比較△P<0.05，△△P<0.01；與100 μmol/L比較#P<0.05，##P<0.01

2.23-溴丙酮酸誘導肝癌細胞凋亡的作用結果表明，與相應對照組比較，50、100、200 μmol/L的3-溴丙酮酸可誘導Bel7402細胞發生顯著的細胞凋亡(P<0.01)，并隨著3-溴丙酮酸濃度增加，其細胞凋亡率亦顯著增高(P<0.01)(見表2、圖1)。

q檢驗：與對照組比較**P<0.01；與50 μmol/L比較△△P<0.01；與100 μmol/L比較##P<0.01

2.33-溴丙酮酸對Bel7402細胞內ATP水平的影響3-溴丙酮酸能特異性抑制糖酵解過程的限速酶己糖激酶Ⅱ的活性，使細胞因ATP供應不足而死亡[5]。與相應對照組比較，50、100、200 μmol/L 3-溴丙酮酸作用4 h均可明顯降低Bel7402細胞內的ATP水平(P<0.01)，并隨著3-溴丙酮酸濃度增加，Bel7402細胞內的ATP水平顯著降低(見表3)。

表3　3-溴丙酮酸對Bel7402細胞內ATP水平的影響

q檢驗：與對照組比較**P<0.01；與50 μmol/L比較△△P<0.01；與100 μmol/L比較##P<0.01

2.43-溴丙酮酸對Bel7402細胞Bcl-2、Bax蛋白表達的影響結果表明，3-溴丙酮酸可下調凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達，同時上調凋亡誘導蛋白Bax的表達(見圖2)。

3　討論

正常細胞主要通過氧化磷酸化過程提供能量，而多數腫瘤細胞即使在有氧條件下也仍以糖酵解作為主要的產能方式，這一現象被稱為Warburg效應。由于糖酵解過程產生的能量比經由氧化磷酸化產生的能量少得多，是一種非常低效的產能方式，故保持高水平的糖酵解活性對腫瘤細胞的存活和生長十分重要。因此靶向有氧糖酵解而選擇性殺傷腫瘤細胞的抗腫瘤策略具有廣泛的臨床開發和應用前景[6-7]。己糖激酶，特別是己糖激酶Ⅱ在維持腫瘤細胞高糖酵解活性方面發揮著關鍵作用。3-溴丙酮酸可抑制己糖激酶Ⅱ的活性，引起細胞內ATP耗竭而導致腫瘤細胞死亡，而對依賴氧化磷酸化供能的正常細胞幾乎無毒性作用，其抗腫瘤作用近年來受到了廣泛關注[8]。本實驗結果顯示，3-溴丙酮酸可明顯降低Bel7402細胞內的ATP水平，導致細胞因能量供應不足而死亡。

Bcl-2家族蛋白是細胞凋亡的重要調控因子，包括凋亡抑制蛋白和凋亡誘導蛋白，前者主要有Bcl-2、Mcl-1、Bcl-XL等，后者主要為Bax、Bak、Bad等[9]。凋亡抑制蛋白保護線粒體膜的完整性，而凋亡誘導蛋白促使凋亡因子如細胞色素C、細胞凋亡誘導因子、第二線粒體衍生的半胱氨酸蛋白酶激活劑等的釋放，最終通過激活caspase激酶而導致細胞凋亡[10]。本實驗中觀察到，50、100、200 μmol/L 3-溴丙酮酸處理Bel7402細胞24 h，可下調凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達，而上調凋亡誘導蛋白Bax的表達，從而使線粒體膜的通透性增加以及凋亡因子的釋放增多而誘導細胞凋亡。

本實驗觀察了3-溴丙酮酸對肝癌Bel7402細胞增殖及凋亡的影響，結果表明，3-溴丙酮酸對Bel7402細胞的增殖具有顯著的抑制作用，并能誘導細胞凋亡。其促凋亡作用可能與藥物引起細胞內ATP降低、調節細胞凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達相關。

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(本文編輯劉夢楠)

Effects of 3-bromopyruvate on apoptosis and the expression of apoptosis-related proteins in liver carcinoma Bel7402 cells

PAN Qiong,REN Kai,CHONG Dian-long,ZHANG Zhi-rui,ZHOU Can,LIU Hao,ZHAO Su-rong

(FacultyofPharmacy,BengbuMedicalCollege,AnhuiEngineeringTechnologyResearchCenterofBiochemicalPharmaceuticals,BengbuAnhui233030,China)

Objective:To investigate the effect of 3-bromopyruvate on the apoptosis of liver carcinoma cells,and its underlying mechanisms.Methods:The proliferative inhibition of Bel7402 cells treated with 3-bromopyruvate was measured by MTT assay.The cells were treated with different concentrations of 3-bromopyruvate( 0,50,100,200 μmol/L ),and apoptosis was analyzed by flow cytometry with PI staining.The intracellular ATP level was detected by commercial kit.The expression of Bcl-2 and Bax protein was analyzed by Western blot.Results:3-bromopyruvate inhibited the proliferation of Bel7402 cells in a time and concentration dependent manner,with an IC50value of 422.9,143.9,85.0 μmol/L at 24,48 and 72 h,respectively.3-Bromopyruvate also induced obvious apoptosis in Bel7402 cells.The apoptotic rate of 50,100,200 μmol/L of 3-bromopyruvate treatment for 24 h was significantly different from that of the control group(P<0.01).At the same time,3-bromopyruvate significantly decreased the intracellular ATP level(P<0.01).The result of Western blot showed that 3-bromopyruvate down-regulated the expression of antiapoptotic protein Bcl-2,and up-regulated the expression of proapoptotic protein Bax in Bel7402 cells.Conclusions:3-bromopyruvate can induce apoptosis in Bel7402 cells,which may be correlated to the inadequate ATP supply,down-regulation of Bcl-2,and up-regulation of Bax.

liver neoplasms;3-bromopyruvate;apoptosis

2015-08-20

國家自然科學基金項目(81372899)；安徽省高校自然科學研究重大項目(KJ2016A486)；安徽省大學生創新創業訓練項目(201510367035)；蚌埠醫學院科研基金項目(BYKY1408ZD)

單位] 蚌埠醫學院 藥學系，安徽省生化藥物工程技術研究中心，安徽 蚌埠 233030

[作者簡介] 潘瓊(1991-)，女，2010級本科生，2015級碩士研究生.

趙素容，博士，碩士研究生導師，副教授.E-mail：inwindangel@qq.com

1000-2200(2016)09-1129-04

R 735.7

ADOI:10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.09.003