表沒食子兒茶素沒食子酸酯抑制白細胞介素17誘導的角質形成細胞增殖和凋亡

付丹丹 胡華 孫敏 李敏 田中偉

453100 河南衛輝，新鄉醫學院第一附屬醫院皮膚性病科

表沒食子兒茶素沒食子酸酯抑制白細胞介素17誘導的角質形成細胞增殖和凋亡

付丹丹 胡華 孫敏 李敏 田中偉

453100 河南衛輝，新鄉醫學院第一附屬醫院皮膚性病科

目的探討表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對白細胞介素17（IL?17）誘導的角質形成細胞損傷的保護作用及其機制。方法實驗分空白對照組、IL?17組、IL?17+EGCG組、IL?17+SP600125組和IL?17+EGCG+茴香霉素組。CCK?8試劑盒檢測細胞增殖；流式細胞儀檢測細胞凋亡；ELISA試劑盒檢測IL?6、IL?23和IL?8的表達；Western印跡檢測JNK和P?JNK的表達。結果IL?17促進HaCaT細胞增殖，且增殖率與IL?17濃度有關，90 μg/L IL?17組的細胞增殖率最高（P＜ 0.05）。60 μmol/L EGCG顯著抑制90 μg/L IL?17誘導的細胞增殖（P＜ 0.05），促進細胞凋亡（P＜ 0.05），降低IL?6、IL?23和 IL?8的表達（P＜ 0.05）。與IL?17組相比，IL?17+EGCG組、IL?17+SP600125組的P?JNK表達顯著下調（P＜ 0.05），細胞增殖率降低（P＜ 0.05），IL?6、IL?23和 IL?8的表達減少（P＜0.05）；與IL?17+EGCG組相比，IL?17+EGCG+茴香霉素組的P?JNK表達顯著上調（P＜ 0.05），細胞增殖率和IL?6、IL?23、IL?8的表達均明顯上升（P＜ 0.05）。結論EGCG對IL?17誘導的HaCaT細胞增殖凋亡、炎癥反應等損傷具有保護作用，其保護作用可能與抑制JNK信號通路有關。

角蛋白細胞；兒茶素；白細胞介素17；細胞增殖；細胞凋亡；表沒食子兒茶素沒食子酸酯

角質形成細胞（KC）具有廣泛的生物學特性，是參與炎癥反應和皮膚免疫的重要細胞［1?2］。白細胞介素17（IL?17）是Th17細胞分泌的特征性細胞因子，能夠促使角質形成細胞表達多種生物活性成分，并參與皮炎的病理過程。HaCaT細胞具有和正常角質形成細胞相似的生物學特征，可作為體外研究藥物及皮膚病的良好模型［3］。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）具有抗氧化、抗炎和抗癌等作用［4］。本研究以IL?17誘導的HaCaT細胞為對象，探討EGCG對角質形成細胞損傷的保護作用及其機制。

材料和方法

一、材料

IL?17（美國Peprotech公司）。EGCG（純度 ≥98%）、JNK抑制劑、Annexin V?FITC試劑盒（江蘇凱基生物公司），JNK激活劑茴香霉素（美國Santa Cruz公司）。DMEM培養液、胎牛血清（FBS）及1%青鏈霉素（美國Gibco Invitrogen公司），CCK?8試劑盒（日本同仁化學研究所）；IL?6、IL?23、IL?8 ELISA試劑盒（武漢博士德公司），HaCaT細胞（美國ATCC細胞庫）。

二、方法

1.HaCaT細胞培養：HaCaT細胞用含10%FBS、1%青霉素、1%鏈霉素的DMEM培養基培養于37℃、5%CO2的培養箱中，2～3 d更換1次培養基，當細胞80%融合時進行傳代。選擇對數生長期HaCaT細胞進行后續實驗。

2.細胞分組：不同濃度IL?17誘導細胞分組：分別用50、70、90 μg/L的IL?17誘導HaCaT細胞，同時設置空白對照組。不同濃度EGCG處理細胞分組：分別用20、40、60 μmol/L的EGCG和90 μg/L IL?17共同誘導HaCaT細胞，同時設置空白對照組和90 μg/L IL?17單獨誘導的IL?17組。JNK激活劑茴香霉素和抑制劑SP600125處理細胞分組：空白對照組、IL?17組、IL?17+EGCG組、IL?17+SP600125組、IL?17+EGCG+茴香霉素組。

3.CCK?8檢測：CCK?8試劑盒檢測12、24、36和48 h時各組細胞增殖水平。每種處理設置4個復孔，每孔加入10 μl CCK?8試劑，在37 ℃避光孵育2 h。用酶標儀測定450 nm吸光度A值。

4.流式細胞儀檢測：按照不同濃度EGCG誘導細胞組分別進行處理，0.25%胰酶（不含EDTA）消化細胞，PBS洗滌，離心，加入100 μl緩沖液重懸細胞。然后加入5 μl Annexin V?FITC 以及5 μl PI于室溫避光孵育15 min。隨后加入400 μl緩沖液，用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

5.ELISA檢測：將細胞進行處理，根據ELISA試劑盒說明書檢測IL?6、IL?23和IL?8的表達水平。將稀釋的樣品加樣并蓋上封板膜，37℃反應60min。隨后洗板5次，加入顯色液AB，37℃下顯色10 min后加入終止液。在10min之內用酶標儀測定490nm處吸光度A值。

6.Western印跡檢測蛋白表達：按照JNK激活劑和抑制劑處理細胞分組分別進行處理，用RIPA細胞蛋白裂解液提取細胞總蛋白。隨后進行SDS?PAGE凝膠電泳，用半干轉方法轉至PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉1 h，漂洗3次。分別加入JNK、P?JNK和GAPDH一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜，漂洗3次。再加入PVDF膜轉入二抗（1∶1 000），室溫孵育1 h，漂洗4次。經Odyssey紅外激光成像系統掃描，目的蛋白與內參GAPDH灰度值的比值反映蛋白的表達水平。

7.統計學分析：實驗重復3次。用GraphPad Prism 5.0軟件進行統計學處理，計量資料采用±s表示，實驗數據用單因素方差分析進行統計學分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.IL?17促進HaCaT細胞的增殖：如圖1所示，IL?17濃度越高、處理時間越長，細胞增殖率越高。90 μg/L IL?17處理48 h后，細胞增殖率提高64.8%。說明IL?17可以促進HaCaT細胞的增殖，并且與IL?17濃度、處理時間呈正相關。因此，采用90 μg/L IL?17誘導HaCaT細胞。

圖1 不同濃度白細胞介素（IL）17作用不同時間對HaCaT細胞增殖的影響 a：與空白對照組比較，P＜0.05

2.EGCG抑制IL?17誘導HaCaT細胞的增殖：如圖2所示，EGCG抑制IL?17誘導的HaCaT細胞增殖，并且與EGCG濃度、處理時間呈正相關。EGCG濃度越高、處理時間越長，細胞生長抑制率越高。

3.EGCG促進IL?17誘導HaCaT細胞的凋亡：如圖3所示，IL?17處理使HaCaT細胞的凋亡率顯著下降，與空白對照組（17.53%）相比，凋亡率下調至1.32%。與IL?17組相比，EGCG組的細胞凋亡率顯著增加。20 μmol/L EGCG組、40 μmol/L EGCG組和60 μmol/L EGCG組的凋亡率分別為8.6%、13.3%和15.6%。

4.EGCG抑制IL?17誘導HaCaT細胞的炎癥因子產生：如圖4所示，與空白對照組相比，IL?17組的IL?6、IL?23和 IL?8的表達顯著上調（P＜ 0.001）。與IL?17組相比，EGCG 組的IL?6、IL?23和 IL?8的表達顯著下調（P＜0.05），而EGCG濃度越高，炎癥因子的表達水平越低。

圖2 不同濃度表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）作用不同時間對白細胞介素（IL）17誘導HaCaT細胞增殖的影響 a：與白細胞介素17組比較，P＜0.05

圖3 表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對白細胞介素17（IL?17）誘導HaCaT細胞凋亡的影響

圖4 表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對白細胞介素17（IL?17）誘導HaCaT細胞炎癥因子的影響 a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與IL?17組比較，P＜0.05

圖5 60 μmol/L表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對白細胞介素17（IL?17）誘導HaCaT細胞的JNK信號通路的影響 a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與 IL?17組比較，P＜0.05；c：與IL?17+EGCG組比較，P＜0.05。1：空白對照組；2：IL?17組；3：IL?17+EGCG組；4：IL?17+SP600125組；5：IL?17+EGCG+茴香霉素組 5A：Western印跡檢測p?JNK和JNK的蛋白表達水平；5B：5A的統計柱狀圖

5.EGCG抑制IL?17誘導HaCaT細胞的JNK信號通路激活：如圖5所示，空白對照組、IL?17組、IL?17+60 μmol/L EGCG組、IL?17+SP600125組和IL?17+60 μmol/L EGCG+ 茴香霉素組間的JNK表達水平差異無統計學意義（圖5A）。與空白對照組相比，IL?17組P?JNK表達水平顯著上調（P＜0.001）；與IL?17組相比，IL?17+60 μmol/L EGCG組和IL?17+SP600125組P?JNK表達水平下調（P＜0.05）；與 IL?17+60 μmol/L EGCG 組相比，IL?17+60 μmol/L EGCG+茴香霉素組P?JNK表達水平顯著上調（P＜0.05）。

6.JNK信號通路抑制介導60 μmol/L EGCG的抗細胞增殖、抗炎作用：如圖6所示，與空白對照組相比，IL?17組的細胞增殖顯著增加（P＜0.05）。與IL?17組相比，IL?17+60 μmol/L EGCG組和IL?17+SP600125組的細胞增殖下降（P＜0.05）。與IL?17+60 μmol/L EGCG組相比，IL?17+60 μmol/L EGCG+茴香霉素組的細胞增殖率上升（P＜0.05）。與空白對照組相比，IL?17組的IL?6、IL?23和 IL?8表達上調（P＜ 0.05）。與IL?17組相比，IL?17+60 μmol/L EGCG組和IL?17+SP600125組的IL?6、IL?23和 IL?8表達下調（P＜ 0.05）。與IL?17+60 μmol/L EGCG組相比，IL?17+60 μmol/L EGCG+ 茴香霉素組的IL?6、IL?23和 IL?8表達顯著上調（P＜ 0.05）。見表1。

圖6 JNK信號通路的抑制介導60 μmol/L表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）的抗細胞增殖作用 a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與IL?17組比較，P＜0.05；c：與IL?17+EGCG組比較，P＜0.05

表1 JNK信號通路的抑制介導60 μmol/L表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）的抗炎作用（±s，ng/L）

表1 JNK信號通路的抑制介導60 μmol/L表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）的抗炎作用（±s，ng/L）

注：n=3。a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與IL?17組比較，P＜0.05；c：與IL?17+EGCG組比較，P＜0.05。Ani：茴香霉素

組別空白對照組IL?17組IL?17+EGCG組IL?17+SP600125組IL?17+EGCG+Ani組IL?6 101.34±18.35 582.25±35.56a 173.27±25.34b 124.46±27.23b 550.24±50.34c IL?23 103.45±15.35 452.31±34.56a 188.11±26.34b 147.67±23.23b 390.43±33.21c IL?8 1 029.14±90.35 3 657.36±210.56a 1 518.17±162.21b 1 345.83±133.23b 3 125.52±156.56c

討 論

CCK-8試劑盒和流式細胞儀常用于檢測細胞的增殖和凋亡水平。本研究通過ELISA試劑盒檢測炎癥因子水平、Western印跡檢測蛋白水平等方法，探討了EGCG對HaCaT細胞損傷的作用。研究發現，IL?17可能參與了銀屑病等免疫性皮膚疾病的發病過程［5］。綠茶多酚對皮膚有保護作用，可以調節炎癥反應、細胞異常增殖等生物過程［6］。

本研究發現，IL?17濃度越高，HaCaT細胞的增殖率越高，增殖率與IL?17的處理時間呈正比，證明IL?17可以誘導角質形成細胞異常增殖，這一結果與Jia等［7］的結果一致。已有研究證明，EGCG可以抑制前列腺癌細胞DU145［8］、正常人角質形成細胞［9］的過度增殖。本研究發現，EGCG可以抑制IL?17誘導HaCaT的增殖，EGCG濃度越高、處理時間越長，細胞生長抑制率越高。進一步研究發現，EGCG對IL?17誘導的HaCaT凋亡降低有抑制作用。另外，研究證明，在IL?17的作用下，角質形成細胞可能產生一些炎癥細胞因子，這些炎癥因子相互作用可能會誘發和加重銀屑?。?0］。本研究結果顯示，IL?17誘導HaCaT細胞產生炎癥因子，IL?6、IL?23和IL?8的表達顯著上調，而EGCG能夠顯著抑制IL?6、IL?23和IL?8的上調。以上結果提示，EGCG可能在IL?17誘導的角質形成細胞損傷中有保護作用。

有研究報道，EGCG可以調控不同種類細胞的MAPK信號通路［11］。本實驗表明，EGCG可以抑制IL?17誘導HaCaT細胞的JNK信號通路的激活。我們用JNK的抑制劑處理IL?17誘導的細胞，發現EGCG和JNK抑制劑有相似的作用，抑制IL?17誘導HaCaT細胞的炎癥因子IL?6、IL?23和IL?8的表達，抑制細胞增殖，說明EGCG可能是通過抑制JNK信號通路發揮保護作用。為進一步確定EGCG對JNK信號通路的抑制作用，我們進行JNK激活劑茴香霉素處理，發現EGCG的保護作用消失，炎癥因子IL?6、IL?23、IL?8的表達和HaCaT細胞的增殖速率與IL?17+EGCG組相比顯著提高，說明EGCG能夠通過抑制JNK信號通路來抑制炎癥因子的產生，降低細胞增殖。

綜上所述，IL?17會引起HaCaT細胞的異常增殖、炎癥反應，并激活JNK通路；而EGCG可以通過抑制JNK信號通路減少炎癥因子的產生，降低HaCaT細胞的增殖，表明EGCG可通過抑制JNK信號通路保護IL?17誘導的角質形成細胞損傷。

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Epigallocatechin gallate inhibits the proliferation and apoptosis of keratinocytes induced by interleukin?17

Fu Dandan,Hu Hua,Sun Min,Li Min,Tian Zhongwei
Department of Dermatology and Venereology,The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University,Weihui 453100,Henan,China

ObjectiveTo evaluate the protective effect of epigallocatechin gallate（EGCG）against interleukin（IL）?17?induced injury to keratinocytes,and to explore its mechanism.MethodsSome cultured HaCaT cells were divided into 3 groups to be treated with IL ?17 alone at concentrations of 50,70,90 μg/L,respectively,with those receiving no treatment as the blank control group.Some HaCaT cells were divided into 5 groups:IL?17 group treated with 90 μg/L IL?17 alone,IL?17+EGCG group treated with 90 μg/L IL?17 and 60 μmol/L EGCG,IL?17+SP600125 group treated with 90 μg/L IL?17 and SP600125（a JAK signaling pathway inhibitor）,IL?17+EGCG+anisomycin group treated with 90 μg/L IL?17,60 μmol/L EGCG and anisomycin（a Janus kinase signaling pathway activator）,and blank control group receiving no treatment.After different durations of treatment,CCK?8 assay was performed to evaluate cellular proliferative activity,flow cytometry to detect cell apoptosis,enzyme?linked immunosorbent assay（ELISA）to measure expression levels of IL?6,IL?23 and IL?8,and Western?blot analysis to determine protein expressions of c?Jun N?terminal kinase（JNK）and phosphorylated JNK（P?JNK）.ResultsIL?17 promoted cellular proliferation of HaCaT cells,and the proliferation rate,which was correlated with the concentration of IL?17,reached the maximum in the 90?μg/L IL?17 group（P＜ 0.05）.EGCG at 60 μmol/L significantly inhibited cellular proliferation of,promoted apoptosis in,and reduced IL?6,IL?23 and IL?8 expressions in,HaCaT cells induced by 90 μg/L IL?17（allP＜0.05）.Compared with the IL?17 group,the IL?17+EGCG group and IL?17+SP600125 group both showed significantly decreased P?JNK expression,cell proliferation rate and IL?6,IL?23 and IL?8 expression levels（allP＜ 0.05）.However,compared with the IL?17+EGCG group,the IL?17+EGCG+anisomycin group showed significantly increased protein expression of P?JNK,cell proliferation rate and IL?6,IL?23 and IL?8 expression levels（allP＜ 0.05）.ConclusionEGCG protected against IL?17?induced injury to HaCaT cells,such as abnormal cell proliferation,apoptosis and inflammatory response,likely by inhibiting the JNK signaling pathway.

Keratinocytes;Catechin;Interleukin?17;Cell proliferation;Apoptosis;Epigallo?catechin gallate

Tian Zhongwei,Email:zhonwt@163.com

2015?11?25）

（本文編輯：吳曉初）

田中偉，Email：zhonwt@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.09.007

河南省教育廳科學技術研究重點項目（13A320852）；河南省中青年衛生科技創新人才工程（201004159）；河南省醫學科技攻關計劃項目（201502016）；新鄉市科技發展計劃項目（15SF26）

Fund programs:Key Program for Science and Technology of Henan Educational Committee（13A320852）;Henan Health Science and Technology Innovation Youth Talent Project（201004159）;Medical Science and Technology Foundation of Henan Province（201502016）;Science and Technology Development Program of Xinxiang City（15SF26）