系統性紅斑狼瘡患者骨髓間充質干細胞的生物學特征及其p27kip1/PTEN蛋白表達

王智琴 彭學標

510515廣州，南方醫科大學附屬南方醫院皮膚科

·論著·

系統性紅斑狼瘡患者骨髓間充質干細胞的生物學特征及其p27kip1/PTEN蛋白表達

王智琴 彭學標

510515廣州，南方醫科大學附屬南方醫院皮膚科

目的 探討系統性紅斑狼瘡（SLE）患者骨髓間充質干細胞（BMSC）的生物學行為，證實SLE患者BMSC是衰老的干細胞，并探討其衰老的可能機制。方法 用密度梯度離心和貼壁分離法對6例SLE患者和8例健康人BMSC進行分離培養。光學顯微鏡觀察BMSC形態學改變及生長狀況并繪制生長曲線，誘導成骨、成脂分化檢測BMSC分化能力，流式細胞儀鑒定BMSC表面標志物及分析細胞凋亡和細胞周期，劃痕試驗檢測BMSC遷移能力，免疫熒光法及蛋白印跡法分析BMSC內p27kip1/PTEN的分布及表達。結果 SLE患者組BMSC形態寬大、扁平、呈多角形，與健康對照組相比，其生長速率、遷移及成骨成脂分化能力均明顯降低。SLE組處于早期（Q2）、中晚期（Q4）凋亡的BMSC細胞比例（17.98%±3.26%，16.80%±9.63%）顯著高于健康對照組（8.23%±3.25%，3.33%±2.21%），差異有統計學意義（tQ2=3.91，PQ2=0.011；tQ4=2.99，PQ4=0.048）。SLE組BMSC阻滯于G0/G1期的細胞百分比顯著高于健康對照組（92.34%±5.80%比78.65%±3.22%，t=3.635，P=0.015），同時其S期所占細胞百分比明顯低于健康對照組（0.86%±1.72%比5.06%±1.874%；t=3.084，P=0.027）。SLE患者BMSC經內參均一化后的p27、PTEN蛋白表達水平（即p27/β肌動蛋白，PTEN/β肌動蛋白）均高于健康對照者，差異有統計學意義（tp27=2.784，PP27=0.039；tPTEN=4.812，PPTEN=0.041）。結論 SLE患者BMSCs表現出衰老特征，可能與細胞內p27kip1/PTEN表達水平升高有關。

紅斑狼瘡，系統性；間質干細胞；衰老；細胞凋亡；p27kip1/PTEN

系統性紅斑狼瘡（SLE）不僅存在造血干細胞異常，骨髓間充質干細胞（BMSC）也存在異常。近年來同種異體BMSC移植治療頑固性難治性SLE取得了進展。Sun等［1］報道了同種異體間充質干細胞（MSC）移植治療4例環磷酰胺或糖皮質激素抵抗的難治性SLE，其療效肯定且無移植相關并發癥發生。但Carrion等［2］報道自體BMSC移植治療2例SLE效果卻不理想。提示SLE患者的BMSC可能存在某些缺陷。本研究旨在分析SLE患者BMSC異常的生物學行為及其細胞周期調控蛋白p27kip1/PTEN表達，從而證實SLE患者BMSC可能是衰老的BMSC。

對象與方法

一、對象

活動期SLE患者6例為2015年1-7月南方醫科大學南方醫院皮膚科住院患者，均符合1997年美國風濕病協會（ACR）修訂的SLE診斷標準，同時參照2012版SLE活動指數評分標準。健康對照組8例系南方醫院職工，均無風濕病史及家族史。SLE組患者年齡（24±3）歲，其中男23～28歲，女17～26歲；健康對照組年齡（25±5）歲，其中男15～28歲，女23～33歲，兩組間年齡差異無統計學意義（t=0.529，P=0.605）。本研究經過南方醫院醫學倫理委員會批準，所有患者和健康對照者均簽署知情同意書，按常規方法獲取骨髓標本。

二、方法

1.試劑與儀器：成人BMSC專用培養基、成脂及成骨誘導培養基［賽業（廣州）生物科技有限公司］，胰酶、磷酸鹽緩沖液（美國Gbico公司），Ficoll人淋巴細胞提取液（天津TBD公司），一抗兔抗人PTEN IgG抗體（美國Abcam公司），一抗兔抗人p27kip1IgG抗體購自（美國Cell Signaling Technology公司），二抗HRP羊抗兔IgG抗體（美國Millipore公司），一抗兔抗人β肌動蛋白IgG抗體、ripa裂解液、蛋白酶抑制劑（武漢谷歌生物科技有限公司），ECL液、熒光二抗（北京康為世紀生物科技有限公司），BCA蛋白定量試劑盒（上海博彩生物科技有限公司），SDS-PAGE凝膠配膠試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司），Countstar自動細胞計數分析儀（上海睿鈺生物科技有限公司），小動物活體成像儀（美國Kodak公司）。

2.BMSC分離培養及鑒定：密度梯度離心法和貼壁篩選法分離BMSC。方法如下：取肝素抗凝的骨髓10 ml，等體積PBS稀釋，向其中緩慢加入等體積1.077 g/ml Ficoll淋巴細胞分離液，按Ficoll淋巴細胞分離液說明書操作，最后按5×104個/cm2密度接種于25 cm2培養瓶內，置37℃、5%CO2培養箱中培養約10 d，其中每3天換1次液。用含EDTA的0.25%胰酶消化貼壁細胞，按1∶2或1∶3接種傳代。最終取第4代（P4）BMSC行流式細胞儀檢測，鑒定細胞表面標記：制備細胞懸液，與FITC標記的CD29，CD44，CD73，CD105，CD34，CD45，CD14，HLADR避光孵育15 min，洗滌后經流式細胞儀檢測分析。明確所分離細胞為BMSC，再取P4 BMSC進行各項實驗檢測。

3.誘導成骨分化：制備BMSC單細胞懸液，并接種于24孔板，設3個復孔。24 h，換BMSC成骨誘導培養基，每3天換液，共誘導培養15 d。漂洗，固定，茜素紅S溶液染色，再漂洗，光學顯微鏡下觀察細胞的鈣結節數量。

4.誘導成脂分化：制備BMSC單細胞懸液，接種于24孔板，設3個復孔，每3天換液。直到細胞達到90%匯合，換BMSC成脂誘導培養基A，誘導3 d后，換脂誘導培養基B，維持培養2 d后，再次換BMSC誘導培養基A，即為誘導/維持1個循環。如此循環重復3遍后，漂洗，固定，油紅O溶液染色，再漂洗，光學顯微鏡下觀察脂滴數量。

5.生長曲線繪制：制備BMSC單細胞懸液，按5 000個/孔接種于24孔板，設3個復孔，接種當天記為第0天，每3天換液。從第2天起每隔48小時，消化3孔細胞，制備細胞懸液，用Countstar自動細胞計數分析儀計數3個復孔的細胞數，并取其平均值，繪制12 d的細胞生長曲線。

6.流式細胞儀檢測細胞凋亡及細胞周期：①檢測細胞凋亡：制備BMSC單細胞懸液，離心，按細胞凋亡試劑盒說明書操作，避光孵育15 min，立即采用流式細胞儀檢測；②檢測細胞周期：制備BMSC單細胞懸液，離心，70%乙醇固定30 min，離心，PBS漂洗，加入細胞周期試劑300 μl，避光室溫孵育30 min，立即采用流式細胞儀檢測。

7.細胞劃痕試驗：制備BMSC單細胞懸液，接種于6 cm皿。待細胞達到80%～90%融合，在6 cm皿底部畫4條平行標記線。用小槍頭畫與標記線垂直的細胞劃痕，漂洗，換成不含血清的基礎培養基，并立即置于顯微鏡下拍下劃痕情況，并做位置標記；孵育24 h后，在顯微鏡下觀察相同位置的細胞遷移情況。

8.細胞免疫熒光檢測p27kip1/PTEN蛋白分布：制備BMSC單細胞懸液，接種于共聚焦皿中，待細胞生長至適當密度，固定，洗滌；0.3%triton透膜，抗p27kip1（1∶200）、PTEN（1 ∶50）抗體孵育，洗滌，熒光二抗（1∶1 000）避光孵育，洗滌，4,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（DAPI）染色，洗滌；用免疫熒光顯微鏡攝片。用Image J圖像分析軟件分析細胞熒光強度。

9.Western印跡法檢測p27kip1/PTEN蛋白表達水平：收集BMSC，提取總蛋白，配分離膠和積層膠，加蛋白樣品，80 V電泳 30 min，120 V電泳至所需時間。轉膜，封閉，孵育一抗 p27kip1（1 ∶1 000），PTEN（1 ∶500），GAPDH（1 ∶3 000），β 肌動蛋白（1∶1 000），洗膜，再孵育HRP標記的二抗（1∶4 000），洗膜后用ECL試劑盒化學發光。結果用Quantity one圖像分析軟件測定條帶灰度值。

三、統計分析

圖1 SLE患者與健康對照骨髓間充質干細胞（BMSC）細胞形態（×100） 健康對照（1A）BMSC細胞細長，呈梭形，而SLE患者（1B）BMSC細胞寬大、扁平，呈多角形

圖2 SLE患者與健康對照骨髓間充質干細胞（BMSC）成骨、成脂分化能力比較（×40） BMSC形成的鈣結節被茜素紅S染成紅色：健康對照（2A）BMSC形成鈣結節數目少，稀疏，且染色淺；SLE患者（2B）BMSC形成的鈣結節數目多，且簇集成團，染色深。BMSC形成的脂滴被油紅O染成紅色：健康對照（2C）BMSC形成脂滴數目少，零散；SLE患者（2D）BMSC形成的脂滴數目多，融合成小片狀

結 果

一、BMSC的鑒定

SLE組和健康對照組BMSC表面抗原標記測定結果顯示，CD29、CD44、CD105、CD73 表達均為陽性，而CD14、CD34、CD45和HLA-DR表達均為陰性，兩組BMSCs表面抗原表達一致。

二、SLE患者BMSC的衰老征象

1.BMSC細胞形態：顯微鏡下觀察SLE患者和健康對照者BMSCs（P4）體外生長形態，健康對照組BMSC呈長梭形，而SLE組BMSCs細胞體積增大、扁平、多角形，呈衰老狀態。見圖1。

2.BMSC成骨、成脂分化能力：SLE患者及健康對照者的BMSC均能向成骨、成脂分化，SLE患者BMSC形成鈣結節數及脂滴數均多于健康對照者，即SLE患者BMSC成骨、成脂分化能力均低于健康對照者。見圖2。

3.BMSC增殖能力：SLE患者與健康對照者的BMSC生長曲線均呈S形，接種后第2天起細胞進入對數生長期，第8天達到高峰，之后進入平臺期。但SLE組BMSC生長速率較健康對照組慢。見圖3。

4.BMSC遷移能力：劃痕試驗后，顯微鏡下觀察SLE組和健康對照組細胞24 h遷移距離，評估兩組BMSC的遷移能力，SLE組BMSC 24 h遷移能力較健康對照組差。見圖4。

圖3 SLE患者與健康對照P4骨髓間充質干細胞生長曲線比較

5.BMSC細胞凋亡：SLE組處于早期（Q2）、中晚期（Q4）凋亡的BMSC細胞比例（17.98%±3.26%，16.80%±9.63%）顯著高于健康對照組（8.23%±3.25%，3.33%±2.21%），差異均有統計學意義（tQ2=3.91，PQ2=0.011；tQ4=2.99，PQ4=0.048）。見圖 5。

6.BMSC細胞周期：SLE組BMSC阻滯于G0/G1期的細胞百分比（92.34%±5.80%）顯著高于健康對照組（78.65%±3.22%），差異有統計學意義（t=3.635，P=0.015）；同時其S期所占細胞百分比（0.86%±1.72%）明顯低于健康對照組（5.06%±1.874%），差異也有統計學意義（t=3.084，P=0.027）。見圖 6。

三、p27kip1/PTEN檢測結果

1.免疫熒光法檢測p27kip1/PTEN在BMSC內的分布：SLE組及健康對照組 BMSC內 p27kip1、PTEN蛋白在細胞質及細胞核均有表達，且細胞核內表達均高于細胞質。見圖7。

2.Western印跡法檢測p27kip1/PTEN在BMSC內的表達：通過Quqntity one 軟件對 p27kip1、PTEN、β肌動蛋白蛋白條帶進行灰度值分析，SLE患者BMSC經內參均一化后的p27、PTEN蛋白表達水平（即 p27/β 肌動蛋白，PTEN/β 肌動蛋白）均高于健康對照，差異有統計學意義（tp27=2.784，PP27=0.039；tPTEN=4.812，PPTEN=0.041）。見圖 8。

討 論

MSC是一類中胚層來源的非造血干細胞，主要來源于骨髓、臍帶血、脂肪等組織［3］，是造血微環境的重要成分，具有高度自我更新、體外高度擴增、多向分化、免疫調節及誘導免疫耐受、組織修復再造等特點。本實驗中所提取的BMSC具備細胞貼壁生長；表面標志物CD29、CD44、CD105和CD73表達均陽性，CD14、CD34、CD45和 HLA-DR 表達均陰性；能向成骨、成脂方向分化等特征，基本符合國際細胞治療協會（ISCT）于2006年公布的BMSC鑒定標準［3］。

圖4 SLE患者與健康對照骨髓間充質干細胞（BMSC）遷移能力差異（×40） 通過比較劃痕縮窄程度評估劃痕0 h（4A、4C）～24 h BMSC遷移能力；24 h時（4B），SLE患者BMSC劃痕略有縮窄，部分BMSC向劃痕中間遷移即遷移能力減弱；健康對照（4D）BMSC劃痕縮窄更明顯，BMSC明顯向劃痕中間遷移

圖5 流式細胞儀檢測SLE患者與健康對照骨髓間充質干細胞細胞凋亡差異 Q1：壞死細胞群（細胞碎片）；Q2：中晚期凋亡細胞群；Q3：正常細胞群；Q4：早期凋亡細胞群

圖6 流式細胞儀檢測SLE患者與健康對照骨髓間充質干細胞細胞周期差異 G0/G1：DNA合成前期細胞群；S：DNA合成期細胞群；G2/M：細胞分裂期細胞群

細胞衰老是一種DNA損傷、氧化應激、端?？s短、細胞周期調控蛋白基因表達失衡或其他細胞有害刺激所致的不可逆的生長停滯，是機體退化過程中生理功能下降和紊亂的表現。MSC衰老征象主要表現為［4］：①細胞增殖緩慢，細胞集落數量下降、集落變??；②細胞遷移能力減弱；③分化潛能顯著下降；④MSC出現明顯的不可逆G0/G1期阻滯，細胞凋亡增多；⑤調節細胞生物學行為相關基因的表達變化，如生長調控蛋白（p53、p21、p16等）異常表達。本研究結果顯示，與健康對照組相比，SLE組BMSC增殖能力、遷移能力均明顯減弱，分化為成骨細胞、脂肪細胞比例減少，發生G0/G1期阻滯，早、中晚期凋亡BMSC比例增加，p27Kip1、PTEN蛋白表達增加。我們的研究結果與孟德芳等［5］、Sun 等［6］、Nie等［7］的結果相似，證實SLE患者BMSC是一種衰老的干細胞。

圖7 免疫熒光法檢測SLE患者和健康對照骨髓間充質干細胞p27、PTEN蛋白分布（×200） 綠色表示p27蛋白，紅色表示PTEN蛋白，藍色表示核區

圖8 Western印跡法檢測SLE患者和健康對照骨髓間充質干細胞p27、PTEN蛋白表達的差異

細胞周期的失調控被認為在細胞衰老中具有關鍵作用，而細胞衰老的調控蛋白主要包括 p53/p21Cip1、p16INK4a/Rb、p27Kip1/PTEN 等 。 目 前 p53/p21Cip1、p16INK4a/Rb在國內外已有相關研究報道，Gu 等［8-9］和 Shibata 等［10］先后發現SLE患者BMSC內p16INK4a、p53/p21Cip1表達均明顯增高，p16INK4a的下游基因如p-Rb表達降低。然而，對p27Kip1/PTEN的研究較少。p27Kip1是一種重要的細胞周期負性調節因子，其在細胞內表達水平及分布受多種機制調控。PTEN是一種抑癌基因，負性調控細胞周期，PTEN在許多衰老細胞內被活化，而后通過抑制AKT磷酸化，使p27Kip1表達上調，最終使細胞阻滯于G0/G1期，參與調控細胞衰老進程。此外，Sun 等［11］研究發現 p27Kip1/PTEN蛋白參與調控鼠聽覺祖細胞的增殖和分化。我們發現，SLE患者BMSC高表達p27Kip1/PTEN，且發生G0/G1期阻滯，增殖、成骨、成脂分化能力差，表明SLE患者BMSC中高表達p27Kip1/PTEN可促使G1期阻滯及抑制細胞增殖和分化，促進細胞衰老。衰老的BMSC增殖、分化、遷移等修復能力減弱，致使其免疫調節、免疫耐受異常，可能與SLE的發生發展密切相關。

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Biological characteristics of and protein expressions of p27kip1/PTEN in bone marrow mesenchymal stem cells from patients with systemic lupus erythematosus

Wang Zhiqin,Peng Xuebiao

Department of Dermatology,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China

Objective To evaluate biological behaviors of bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）from patients with systemic lupus erythematosus （SLE）,to confirm that the BMSCs are aging stems cells,and to explore mechanisms underlying their aging.Methods BMSCs were isolated from bone marrow of 6 patients with SLE（patient group）and 8 healthy human controls （control group）by density-gradient centrifugation and plastic adherence,and culturedin vitro.Optical microscopy was conducted to observe morphological changes and growth of BMSCs,and growth curves were drawn.The differentiation ability of BMSCs was evaluated through culture of them with adipogenic and osteogenic induction medium.Flow cytometry was performed to identify cellular surface markers and to analyze cell cycle and apoptosis,and scratch assay to assess the migration ability of BMSCs.Immunofluorescence assay and Western blot analysis were carried out to analyze the distribution and expression of p27kip1/PTEN in BMSCs respectively.Results Patient-derived BMSCs,which had a broad,flat and polygonal shape,showed decreased growth rate,migration activity as well as adipogenic and osteogenic ability compared with those from the controls.There was a significant increase in the proportion of BMSCs in early stage（17.98% ±3.26%vs.8.23%±3.25%,t=3.91,P=0.011）as well as in middle to late stages（16.80% ±9.63%vs.3.33% ±2.21%,t=2.99,P=0.048）of apoptosis in the patient group compared with the control group.Moreover,compared with the control group,the patient group showed a significantly higher proportion of BMSCs arrested in the G0/G1 phase（92.34% ±5.80%vs.78.65% ±3.22%,t=3.635,P=0.015）,but a lower proportion in the S phase（0.86% ±1.72%vs.5.06% ±1.874%,t=3.084,P=0.027）.The protein expressions of p27 and PTEN were significantly higher in the patient group than in the control group（p27/β-actin:t=2.784,P=0.039;PTEN/β-actin:t=4.812,P=0.041）.Conclusion The BMSCs from SLE patients exhibit senescence-related features,which may be associated with elevated expression levels of p27kip1/PTEN.

Lupus erythematosus,systemic;Mesenchymal stem cells;Aging;Apoptosis;p27kip1/PTEN

Peng Xuebiao,Email:pengxuebiao@126.com

彭學標，Email：pengxuebiao@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.06.008

廣東省自然科學基金（2014A030313317）

Fund program:Natural Science Foundation of Guangdong Province of China（2014A030313317）

2015-08-26）

（本文編輯：吳曉初）