碳點-熒光素熒光共振能量轉移體系在阿司匹林測定中的研究與應用

金文英 ，廖秀芬 ，陶慧林* ，趙　穎 ，劉紹州 ，梁永敏

(1.廣西高校食品安全與檢測重點實驗室，桂林理工大學　化學與生物工程學院，廣西　桂林　541004；2.廣西產品質量檢驗研究院，廣西　南寧　530007)

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碳點-熒光素熒光共振能量轉移體系在阿司匹林測定中的研究與應用

金文英1，廖秀芬2，陶慧林1*，趙穎2，劉紹州2，梁永敏1

(1.廣西高校食品安全與檢測重點實驗室，桂林理工大學化學與生物工程學院，廣西桂林541004；2.廣西產品質量檢驗研究院，廣西南寧530007)

研究了經L-y半胱氨酸修飾后的碳點(CDs)-熒光素(FAM)熒光共振能量轉移體系，并利用該體系建立了測定阿司匹林(ASP)的新方法。結果表明：在λex=330 nm下，于pH 7.0的Tris-HCl緩沖液中，CDs與FAM反應5 min后能發生有效的熒光共振能量轉移，能量供體CDs將能量轉移到受體FAM，使FAM的熒光顯著增強，而ASP的加入可有效猝滅FAM的熒光，且ASP濃度在1.0～150.0 μg/mL范圍內與體系的熒光猝滅值ΔIF呈良好的線性關系(r=0.999 6)，基于此建立了測定ASP的新方法。在最佳實驗條件下，方法的檢出限達0.33 μg/mL(3δ/k,n=11)，回收率為 97.1%～105.3%，相對標準偏差(RSD)不大于4.6%(n=6)。常見的無機離子以及與ASP同類型的藥物對測定影響較小，方法的選擇性較好。

碳點；熒光素；熒光共振能量轉移(FRET)；阿司匹林

阿司匹林(Aspirin，ASP)是從柳樹皮和柳葉中提取的傳統解熱鎮痛藥，現已廣泛用于解熱鎮痛、抗風濕、預防暫時性腦缺血及中風，治療腦血栓，預防心絞痛、心肌梗死[1]。同時，ASP可治療女性痛經，治療腹瀉、膽道蛔蟲，也具有抗腫瘤轉移作用，針對不同的疾病，其用量各不相同。因此尋找阿司匹林含量測定的方法具有重要意義。目前測定ASP含量的方法主要有高效液相色譜法[2-3]、光度法[4-5]、電化學分析法[6-7]、熒光光譜法[8-9]等。

熒光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer，FRET)是兩個熒光基團間的距離小于10 nm時熒光能量由供體向受體轉移的現象[10-11]。由于FRET方法簡單、靈敏度高，在分析檢測領域得到了很大的發展[12-13]。碳點(Carbon dots，CDs)是一種新型的納米材料，具有發光性質穩定、熒光壽命長等特點，且與其他熒光材料相比具有更好的生物安全性，是一種優良的光學材料[14-15]。CDs被引入FRET中，使其應用領域不斷擴大。本文選用CDs 為能量供體，熒光素(Fluorescein,FAM)作為能量受體，構建了一個新型的能量轉移體系，并將所建立的FRET體系應用于阿司匹林腸溶片中阿司匹林含量的測定。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

RF-5301PC 熒光光度計(日本島津公司)，TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)，FA1104電子分析天平(中國江蘇泰興市電子儀器廠)，pHS-3C精密pH計(上海雷磁儀器廠)，JEM-2010透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)。

ASP標準液(250.0 μg/mL)：使用時稀釋至所需濃度；FAM(10 μg/L，廣州化學試劑廠)；三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(Tris-HCl，pH 7.0)：配制0.10 mol/L的Tris母液，然后用0.10 mol/L HCl溶液調至相應的pH值。實驗所用試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

1.2實驗方法

1.2.1水溶性CDs的合成按文獻[16]稍作修改：在反應釜中加入0.2 g檸檬酸鈉、1.5 g碳酸氫銨固體、10 mL水及50 μL 0.1 mol/L的L-y半胱氨酸在 180 ℃下反應 4 h左右，冷卻裝置后，定容至100 mL，于4 ℃冰箱中保存，備用。

1.2.2測定方法于一系列 5 mL 比色管中加入一定量的 CDs，FAM和ASP，用 pH 7.0的Tris-HCl緩沖液定容至刻度，反應 5 min 后，于λex=330 nm處測定相應熒光強度IF。儀器的激發和發射狹縫寬度均為 5 nm。

2　結果與討論

2.1碳點(CDs)的表征

透射電子顯微鏡(TEM)、紫外光譜法、熒光光譜法是對 CDs 進行表征的常見手段。用TEM可對CDs進行直觀的形貌觀察，以獲得其形狀、粒徑大小及分散性等信息。通過CDs的TEM圖(圖1A)可以看出所合成的 CDs 分散性較好，粒子尺寸分布較為集中。CDs的紫外吸收光譜和熒光光譜見圖1B，其最大吸收峰在343 nm，熒光發射峰在443 nm，Stokes位移100 nm。根據參考文獻，用硫酸奎寧作為標準物質(Φs=0.55)[17]，計算得CDs的量子產率Φu為0.65。由此可見，本文所合成的CDs具有分散性好、粒度均勻、熒光量子產率高、峰形窄而對稱等特點。

圖1　CDs的TEM圖(A)以及吸收光譜和熒光光譜(B)Fig.1　TEM image(A),absorption and fluorescence spectra of CDs(B)a.absorption spectrum；b.fluorescence spectrum

2.2FRET體系的構建

供體的熒光發射光譜和受體紫外吸收光譜有相當程度的光譜重疊是分子間發生能量轉移的必要條件之一。對CDs的熒光光譜和FAM的吸收光譜進行分析可知，CDs的熒光峰在443 nm處，FAM的吸收峰在491 nm處，兩者差為48 nm。此外，根據參考文獻[18]，計算得光譜重疊面積J=2.8×10-14J/(cm3·L·mol-1)。說明供體CDs的熒光光譜與受體FAM的紫外吸收有較好的重疊，為二者之間發生能量轉移提供了前提條件。

圖2　CDs(a)、FAM(b)和CDs-FAM(c)的熒光光譜Fig.2　Fluorescence spectra of CDs(a),FAM(b)and CDs-FAM mixture(c)ρCDs=4.0 μg/mL,ρFAM=2.0 μg/mL

圖3　ASP對 CDs-FAM能量轉移體系的影響Fig.3　Effects of ASP on the FRET of CDs-FAMρASP:(a-j):0.0,1.0,4.0,8.0, 16.0,40.0,60.0,80.0,120.0,150.0 μg/mL；ρCDs=4.0 μg/mL；ρFAM=2.0 μg/mL

為了獲得理想的能量轉移效果，用330 nm激發混合體系。同一物質在相同的濃度下分別繪制CDs、FAM和兩者混合物的熒光光譜，結果如圖2所示。由圖2可知，體系中供體CDs發生熒光猝滅，將能量有效地轉移給受體FAM，使FAM的熒光顯著增強，說明在CDs-FAM之間發生了有效的熒光共振能量轉移。

根據 F?rster 非輻射能量轉移機制，影響能量轉移效率的主要因素是供體-受體之間的距離(r)和臨界能量轉移距離(R0)。供體與受體之間的能量轉移效率E為[19]：

式中，F為加入能量給受體后給體的熒光強度；F0為未加入受體時給體的熒光強度；k2為偶極空間取向因子(取k2=2/3)，N為水和有機溶劑的平均折射率(取1.37)，Φ為供體的熒光量子產率，J為光譜重疊程度。根據前文計算結果Φ= 0.55，J=2.8×10-14J/(cm3·L·mol-1)。根據上式計算得E=0.66，R0=3.62 nm，r=3.25 nm，說明CDs與FAM間發生了有效的能量轉移。

圖4　CDs(a)及加入ASP前(b)、后(c)CDs-FAM的紫外吸收圖譜Fig.4　Absorption spectra of CDs(a),and CDs-FAM system before(b)and after(c)addition of ASP ρCDs=4.0 μg/mL,ρFAM=2.0 μg/mL;ρASP=16.0 μg/mL

2.3ASP對CDs-FAM體系的作用

考察了不同濃度ASP對CDs-FAM能量轉移體系的影響，結果如圖3所示。ASP能有效猝滅CDs-FAM體系中FAM的熒光強度，且隨著ASP濃度的增大，FAM的熒光猝滅程度增強。據此可以建立能量轉移熒光猝滅體系體系測定ASP的新方法。

2.4實驗條件的優化

按實驗方法，考察了pH值、反應介質、反應溫度和反應時間等條件對 CDs-FAM-ASP體系的影響。實驗表明，pH 7.0時，ASP對體系的熒光猝滅最靈敏。因此考察了pH 7.0的不同緩沖介質及其用量對體系的影響，發現加入4 mL Tris-HCl 緩沖液時可獲得最佳的猝滅效果。此外，體系在35 ℃下反應5 min可達穩定，并且可穩定1 h以上。

表1　干擾物質對體系的影響Table 1　Effect on the measurement result by interference

2.5工作曲線

按照“1.2.2”方法對不同濃度ASP進行檢測，并繪制工作曲線，結果顯示，體系的熒光猝滅值(ΔIF)與ASP 的濃度(ρ，μg/mL)在 1.0～150.0 μg/mL范圍內呈良好的線性關系，線性方程為ΔIF=11.74ρ+4.34，相關系數(r)為 0.999 6，檢出限(3δ/k)為0.33 μg/mL。

2.6干擾實驗

ASP濃度為16 μg/mL 時，在最優實驗條件下考察了部分共存物質對體系的影響，結果如表1所示。由表1可知，當相對誤差控制在±5%以內時，常見陽離子、陰離子及小分子物質對體系基本沒有影響，說明該體系對ASP具有較高的選擇性。

2.7樣品分析

考察了該 FRET 體系測定ASP的可行性和實用性，對ASP腸溶片(100 mg/粒)中ASP含量進行了檢測。參考文獻[20]進行樣品前處理：取阿司匹林腸溶片1 粒，研碎，加入 3～5 mL乙醇，待溶解后將溶液轉入100 mL容量瓶中，強烈振搖使阿司匹林溶解，再用乙醇定容至刻度。取50 μL 母液，按照實驗方法，定容至5 mL進行檢測，同時進行加標回收實驗。結果測得ASP腸溶片中ASP的含量分別為96.8，98.0，102.1 mg/粒，方法回收率為97.1%～105.3%，相對標準偏差(RSD)不大于4.6%(見表2)。

表2　樣品的分析結果Table 2　Analytical results of samples

3　結　論

本文以CDs作為能量給體，FAM作為能量受體構建了CDs-FAM FRET體系，對 CDs-FAM體系進行探討，計算了能量轉移體系的相關參數，并利用 CDs-FAM體系建立了測定ASP的新方法。在最佳實驗條件下，該方法對ASP的檢測范圍為1.0～150.0 μg/mL，相關系數(r)為 0.999 6，檢出限達 0.33 μg/mL。將方法應用于阿司匹林腸溶片中ASP含量的測定，回收率為97.1%～105.3%,RSD不大于4.6%。該方法靈敏度高、選擇性好、操作簡單、線性范圍寬，同時具有較高的準確度和精密度，具有推廣應用價值。

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Study on Carbon Dots-Fluorescein Fluorescence Resonance Energy Transfer System and Its Application in Aspirin Analysis

JIN Wen-ying1,LIAO Xiu-fen2,TAO Hui-lin1*,ZHAO Ying2,LIU Shao-zhou2,LIANG Yong-min1

(1.Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Food Safety and Detection,College of Chemistry and Bioengineering,Guilin University of Technology,Guilin541004，China;2.Guangxi Zhuang Autonomous Region Testing Institute of Product Quality,Nanning530007,China)

A fluorescence resonance energy transfer(FRET)system between fluorescence carbon dots(CDs,donor)and fluorescein(FAM,acceptor)was constructed,and a novel method for the sensitive and selective determination of aspirin(ASP)was accordingly proposed.It was found that in pH 7.0 Tris-HCl buffer，effective energy transfer from CDs to FAM occurred,which resulted in a great enhancement of the fluorescence intensity of FAM.Upon the addition of ASP,fluorescence quenching of FAM occurred,and the change of FAM fluorescence intensity was in a good linearity(r=0.999 6)with ASP in the concentration range of 1.0-150.0 μg/mL.A novel fluorescence quenching platform for the determination of ASP was constructed.Under the optimum conditions,the detection limit of ASP for this method was 0.33 μg/mL(3δ/k,n=11),and the spiked recoveries ranged from 97.1%to 105.3%with RSD(n=6)not more than 4.6%.The result showed that common relevant substance,cations and anions did not interfere with the detection of ASP.

carbon dots;fluorescein;fluorescence resonance energy transfer(FRET);aspirin

2016-03-14；

2016-04-09

國家自然科學基金資助項目(61264007)；廣西高校食品安全與檢測重點實驗室資助項目

陶慧林，教授，研究方向：光譜分析，Tel:0773-5898551，E-mail：thl@glut.edu.cn

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.013

O657.3；TQ460.72

A

1004-4957(2016)09-1147-05