前列腺癌患者血清miR—146a與miR—152的表達水平及臨床意義

戴金華 廖于峰 冷江涌 馬建波 李克強

【摘要】目的：分析前列腺癌患者血清miR-146a與miR-152的表達水平及臨床意義。 方法：以2009年1月至2013年4月在我院泌尿外科診治的前列腺癌、良性前列腺增生患者及健康體檢志愿者各46例為研究對象，分析各組患者血清miR-146a與miR-152的表達水平及與臨床病理參數之間的關系。結果：miR-146a在前列腺癌患者血清中的表達水平顯著高于良性前列腺增生及正常組血清，且前列腺良性增生組血清中miR-146a的表達量亦較正常組高，差異均具有統計學意義（P<0.05）；miR-152在前列腺癌患者較良性前列腺增生及正常組血清顯著偏低（P<0.05），但在良性前列腺增生和正常組之間無統計學差異（P>0.05）；血清miR-146a在不同病理分期、臨床分期、有無骨轉移及血清tPSA有關（P<0.05），與年齡無關（P>0.05）；而miR-152與不同病理分期、臨床分期、有無骨轉移有關（P<0.05），與血清tPSA水平無相關性（P>0.05），與年齡無顯著相關性（P>0.05）。 結論：miR-146a與miR-152在前列腺癌患者血清中的表達水平發生了顯著改變，為用于前列腺癌的早期診斷及病程的判斷提供了相關實驗依據。

【關鍵詞】前列腺癌；血清；miR-146a；miR-152

Serum miR-146a and miR-152 expression levels of prostate cancer patients and their clinical significanceDAI Jinhua1， LIAO Yufeng1△， LENG Jiangyong2， MA Jianbo1， LI Keqiang2. 1.Department of Clinical Laboratory， Ningbo Second Hospital， Ningbo 315010， Zhejiang， China； 2.Urology Department，Ningbo Second Hospital， Ningbo 315010， Zhejiang， China

【Abstract】Objectives： To analyze serum circulating miR-146a and miR-152 expression levels of prostate cancer patients and their clinical significance. Methods： Prostate cancer， benign prostatic hyperplasia patients and healthy volunteers from July 2012 to April 2013 in our hospital were recruited for the study， 46 cases in each group. The serum miR-146a， miR-152 expression levels and correlativity with clinic pathological parameters were analyzed. Results： The miR-146a expression levels in the serum of prostate cancer group was significantly higher than these in benign prostatic hyperplasia group and normal group， and miR-146a expression levels in the serum of benign prostatic hyperplasia group was higher than normal group， with statistically significant difference （P< 0.05）； miR-152 in prostate cancer group was decreased significantly compared with benign prostatic hyperplasia group and normal group （P<0.05）， but no significant difference was found between benign prostatic hyperplasia and normal group （P> 0.05 ） ； serum miR-146a was related with different pathological stage， clinical stage， with or without bone metastases （P<0.05）. Serum miR-146a had no relationship with serum tPSA （p>0.05）； whereas miR-152 was related with various pathologic stage， clinical stage， with or without bone metastasis （P<0.05）， but serum tPSA levels had no correlation with miR-152 （P> 0.05）. Conclusion： Serum miR-146a and miR-152 expression levels of prostate cancer patients have significant changes， which provides relevant experimental basis for the early diagnosis of prostate cancer and determine the course.

【Key words】Prostate cancer； Serum； MiR-146a； MiR-152

【中圖分類號】R697+.3【文獻標志碼】A

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是常見的男性生殖系統惡性腫瘤之一，發病率隨著年齡的增長而升高，且呈現出地區差異性。我國前列腺癌的發病率雖較歐美地區低，但隨著人口老齡化進程的加快和飲食結構的改變，其發病率逐年上升，呈現出惡性程度高、預后差等特點[1]。微小RNA（MicroRNA）是一類高度保守內源性非編碼的小核苷酸序列，近年MicroRNA所介導的基因轉錄后調控的研究成果為前列腺癌發病機制及早期診斷的研究開辟了新的思路[2]。研究顯示miR-146a在早期前列腺癌中表達有所升高，可能參與前列腺癌的發生發展過程[3]。針對miR-152的研究表明其在前列腺癌等多種腫瘤組織中表達下調，作為一種腫瘤抑制因子，通過調節轉化生長因子-α（TGF-α）的表達，影響前列腺癌細胞的侵襲和遷移能力[4]。本研究采用RT-PCR檢測前列腺癌、前列腺良性增生及正?；颊哐逯衜iR-146a及miR-152的表達水平，為前列腺癌的早期診斷提供實驗依據。

1資料與方法

1.1臨床資料

以2009年1月至2013年4月在我院泌尿外科診治的前列腺癌、良性前列腺增生患者及健康體檢志愿者中采用隨機數表法各選擇46名作為研究對象，年齡（67.6±8.2）歲，所有前列腺癌及良性前列腺增生患者經穿刺活檢病理學確診且抽血前未經任何治療；排除患有高血壓、急性感染、結核病及糖尿病等疾病的患者。前列腺癌的病理分級依據2003年WHO前列腺癌病理組織學分類標準的Gleason評分，腫瘤分期按Jewett-Whitmore-Prout分期標準（即ABCD分期）。所有患者及家屬簽署知情同意書，并通過了醫院倫理委員會的審批。

1.2主要儀器與試劑

Trizol、RNAisoTMPlus及RT-PCR試劑盒購自日本Takara公司；Taq man MicroRNA Assay 及miRVana TMmiRNA Isolation Kit購自美國Ambion公司；miR-146a、miR-152及U6引物由吉凱基因（上海）提供；DU-730購自美國 BECKMAN 公司；雙穩定時電泳儀DYY-6C購自北京六一公司；ABI PRISM7300 RT-PCR儀購自美國ABI公司。

1.3RT-PCR檢測血清miR-146a、miR-152的表達

1.3.1血清樣本制備 抽取參與對象外周血3mL于真空采血管，室溫靜置1h后，4℃，3000r/min離心15min，收集上清，保存于-80℃冰箱備用。

1.3.2血清總RNA抽提 采用Trizol法提取血清總RNA，加無水乙醇洗滌后，再加10～50μL DEPC水溶解，核酸純度分析儀分析RNA純度，A260/A280在1.8～2.0之間，DU-730計算RNA濃度，分裝保存于-80℃備用。

1.3.3RT-PCR檢測血清miR-146a、miR-152的表達 分別檢測參與對象的血清miR-146a、miR-152的表達水平。

逆轉錄：取 100ng Total RNA、1μL M-MLV（購自 TAKARA 公司）、1μL（1μM/μL）miRNA 反轉錄引物，總體系為20μL，反轉錄合成 cDNA。先將模板，引物與H2O 混勻后 65℃變性 5min 后置冰上，再加入酶、PCR Buffer 等試劑，逆轉錄參數為 16℃ 30min，37℃ 30min，70℃ 10min，4℃保存。完成后將樣本-80℃保存備用。

擴增：10μLMaster Mix、6.4μL ddH2O、10μM PCR引物、1μL RT產物，共20μL。PCR反應條件：94℃，5min；94℃，30min；59℃，30s；30個循環，最后72℃，8min。每例樣本3重復，ABI7300記錄Ct值，以U6為內參，以N=2-ΔCt計算相對表達量。

1.4統計學分析

應用SPSS19.0統計軟件對統計資料進行分析。計量資料用（±s）表示，兩獨立樣本兩組間均數比較采用t檢驗，多組間比較采用F檢驗。血清中miR-146a、miR-152的表達水平與各臨床病例參數間的關系采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1血清miR-146a、miR-152的表達水平分析

對各組患者血清中miR-146a、miR-152的表達水平進行比較。結果顯示，miR-146a在前列腺癌患者血清中的表達水平較良性前列腺增生及正常組血清顯著升高，且前列腺良性增生組血清中的表達量亦較正常組高，差異均具有統計學意義（P<0.05）。見圖1A。miR-152在前列腺癌患者較良性前列腺增生及正常組血清顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05），但在良性前列腺增生和正常組之間無統計學差異（P>0.05）。見圖1B。

2.2血清miR-146a、miR-152的表達與臨床病理參數的相關性分析單因素方差分析和t檢驗結果顯示，血清miR-146a在不同病理分期、臨床分期、有無骨轉移及血清tPSA有關（P<0.05），在≤60與>60歲組無統計學差異（t=0.48，P<0.05）；而miR-152與不同病理分期、臨床分期、有無骨轉移有關（P<0.05），與血清tPSA水平及年齡分無顯著相關性（P>0.05）。見表1。

3討論

前列腺癌是發生于前列腺腺體的惡性腫瘤，在老年男性人群中并發率高，嚴重威脅患者的生命健康，給家庭和社會帶來了沉重的壓力[5]。隨著研究者對前列腺癌發病機制研究的深入，前列腺癌的診斷方法不斷改進，如酸性磷酸酶的測定、前列腺特異性抗原篩查等為前列腺的早期診斷、早期治療提供了可靠的方法[6，7]。

MicroRNA作為宿主基因在細胞核內轉錄前體轉錄本，在細胞質內通過招募相關蛋白組成沉默復合體RISC與靶microRNA互補結合，降解或抑制mRNA，在轉錄后水平調節靶基因的表達[8]。miR-146a是一個與免疫相關miRNA，雖然miR-146a在腫瘤、炎癥中的作用機制尚未完全清楚，但與細胞因子存在著密切的聯系，研究發現其能夠通過負調控NF-kB通路抑制IL-6、IL-1β及TNF-α等細胞因子的表達[9，10]，還能夠抑制胰腺癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移。已有研究報道顯示轉染miR-146a的PC3細胞形成克隆的大小和數目都要顯著較對照組低，提示miR-146a能夠抑制PC3的體外克隆能力[11]。本研究顯示在前列腺癌患者血清中miR-146a的表達水平要顯著高于良性前列腺病變及健康對照組患者，提示miR-146a可能參與前列腺癌的發生發展過程，為前列腺癌的早期診斷提供相關實驗依據。多項研究表明miR-152在卵巢癌、結腸癌等多種實體腫瘤中的表達下調[12，13]；研究顯示miRNA-152能夠通過調理MMP-3及NRP-2的表達抑制神經膠質瘤細胞的侵襲及血管生成[14]，子宮內膜癌中miRNA-152的水平上調能夠顯著抑制腫瘤的生長[15]，但對于前列腺癌的報道較少。本研究結果顯示在前列腺癌患者血清中miR-152的表達水平顯著降低，miR-152與不同病理分期、臨床分期、有無骨轉移有關（P<0.05），與血清tPSA水平無顯著相關性（P>0.05），隨著病情的加重miR-152的表達水平顯著降低。表明miRNA-152的血清表達水平與前列腺癌的病理分期存在一定的相關性，提示血清miRNA-152可以作為預測前列腺癌進展的生物標志物。

綜上所述，miR-146a與miR-152在前列腺癌患者血清中的表達水平發生了顯著改變，提示其可能在前列腺癌的發生發展過程中有重要的作用，為前列腺癌的早期診斷及病程的判斷提供了相關實驗依據。

參考文獻

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