擬南芥同源四倍體減數分裂過程的分子細胞學分析

李云玲 田保明 楊 妍 崔明珠 郝志達 位 芳

(鄭州大學生命科學學院，鄭州 450001)

擬南芥同源四倍體減數分裂過程的分子細胞學分析

李云玲 田保明 楊 妍 崔明珠 郝志達 位 芳*

(鄭州大學生命科學學院，鄭州 450001)

以擬南芥(Columbia生態型)二倍體(AA，2n=10)為材料，經0.2%秋水仙素處理和細胞學鑒定，成功獲得擬南芥同源四倍體(AAAA，2n=20)。以二倍體為對照，通過對擬南芥同源四倍體減數分裂過程染色體行為的觀察，以及減數分裂調控同源染色體聯會與重組相關基因的定量PCR分析，研究結果表明，與二倍體相比，擬南芥同源四倍體葉片表皮細胞間氣孔孔徑顯著增大，莢果變長，但氣孔密度和結實率顯著降低；在減數分裂過程中出現部分單價體和三價體，以及二價體和四價體等染色體配對構型；減數分裂期重組相關基因ZYP1表達水平降低，ASY1、DMC1、MRE11和SPO11-1表達水平均升高。因此，我們推斷，伴隨著多倍體化，與二倍體相比，多倍體植物減數分裂期染色體行為和相關基因表達都有一定改變，影響多倍體植物生殖發育以適應環境。

擬南芥；二倍體；同源四倍體；減數分裂；染色體

與二倍體相比，多倍體植物往往具有較強的生長勢與適應性。在自然界，自發產生的多倍化現象包括同源多倍體(Autopolyploids)和異源多倍體(Allopolyploids)。所謂同源多倍體，是指增加的染色體組來自同一物種，一般由二倍體的染色體直接加倍產生。因此，與二倍體相比，通過0.2%秋水仙素處理加倍，所獲得的多倍體植物除了葉片、花器官等表現巨大外[1]，氣孔保衛細胞的增大尤為明顯[2]，植株育性也有所改變[3]。同源多倍體減數分裂能否產生正常配子，是多倍體植物遺傳多樣性的物質基礎，直接影響著植株育性與繁衍。目前，有關同源多倍體減數分裂染色體行為觀察的報道較多。崔群香等[4]研究了白菜同源四倍體花粉母細胞減數分裂過程，發現終變期有少量三價體和單價體出現，雖然有染色體構型多樣的現象，但減數分裂完成后生成的四分體結構正常；有關鴨茅不同倍性花粉母細胞減數分裂的研究發現四倍體材料中僅出現了少量的四價體，但兩種倍性的鴨茅均能正常減數分裂，沒有染色體滯后或者微核等異?，F象[5]。然而，這些研究大部分只關注了多倍體植物減數分裂過程的基本事件，缺少系統的比較性研究，同時對多倍體植物減數分裂相關基因的研究報道較少。因此，本研究以模式植物擬南芥二倍體為研究材料，通過0.2%秋水仙素處理，經細胞學鑒定和形態觀察，獲得同源多倍體擬南芥，系統觀察了擬南芥同源四倍體減數分裂染色體行為，并進一步利用實時定量PCR技術分析了一些代表性的減數分裂相關基因的表達模式變化，為多倍體植物遺傳多樣性提供必要的分子細胞學證據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

野生型擬南芥為哥倫比亞生態型(Columbia-0)，由鄭州大學植物遺傳育種實驗室提供。培養條件：溫度18～21℃; 相對濕度為60%～70%；16 h光照/8 h黑暗。

1.2 試驗方法

1.2.1 同源四倍體擬南芥的獲得

將擬南芥種子在低溫(4℃)、黑暗條件下處理3～5 d，打破種子休眠。然后，用1%次氯酸鈉溶液對種子進行表面消毒,無菌水沖洗2～3次。將種子點種于MS培養基上，培養2～3周用0.2%的秋水仙素黑暗處理莖尖生長點3～4 h，無菌水沖洗后轉移至營養土中培養至成熟，分株收獲種子，鑒定倍性。

1.2.2 擬南芥氣孔觀察和育性分析

取二倍體和同源四倍體擬南芥的成熟葉片，用鑷子挑取葉片下表皮放在滴有一滴清水的載玻片上，將其展開并吸去多余的水，蓋上蓋玻片，顯微鏡觀察，每個樣品取5個視野觀察統計，先在顯微鏡下數每一視野中氣孔的數目，而后用物鏡測微尺量得視野的直徑，求視野的面積。由此計算單位面積內氣孔的數量。同時，剪取成熟但尚未開裂的長莢果，放入脫色液(乙醇∶乙酸=3∶1)中，脫色4 h觀察；取生長9周左右的擬南芥植株，不同倍性的材料均取5～10株，每株選10個莢果，用解剖針撥開種皮對種子進行統計分析。

1.2.3 擬南芥減數分裂的細胞學觀察

選生長旺盛的擬南芥幼苗，摘下剛剛漏白的花序，放入卡諾固定液(乙醇∶冰乙酸=3∶1)中，固定3～4 h；檸檬酸緩沖液和無菌水分別清洗2～3次，37℃酶解(酶液成分，纖維素酶∶果膠酶=1∶1)5～6 h，將酶解后的花序轉移至干凈載玻片上，解剖顯微鏡下用解剖針解剖并釋放花粉母細胞，烘干后經50 μg·mL-1的PI染色即可觀察。

1.2.4 擬南芥減數分裂相關基因的定量分析

RNA提取采用CTAB法[6]，反轉錄使用晶彩生物公司的反轉錄試劑盒,獲得的cDNA作為熒光定量PCR的反應模板。RT-PCR檢測所選用的內參基因β-actin及其它目的基因引物序列見表1。PCR反應程序為：94℃預變性2分鐘；94℃ 20秒，55～60℃ 20秒，72℃ 20秒，40個循環；72℃延伸2分鐘。

表1 引物序列

2 結果與分析

2.1 同源四倍體擬南芥的鑒定結果

擬南芥基因組相對較小，二倍體擬南芥有10條染色體(2n=2x=10)(圖1:a)；經秋水仙素處理后，所獲得的同源四倍體擬南芥染色體為20條(2n=4x=20)(圖1:b)。

2.2 擬南芥氣孔觀察和育性分析

研究結果表明，擬南芥二倍體葉片的氣孔體積較小，單位面積內氣孔數量較多(圖2:a)，單位面積內氣孔數量約49.4個·mm-2；然而同源四倍體葉片氣孔體積較大，單位面積內氣孔數量較少(圖2:b)，約為20.8個·mm-2。因此，與二倍體相比，擬南芥同源四倍體的單位面積內氣孔保衛細胞數量明顯減少，二者差異較為顯著。

圖1 擬南芥倍性的細胞學鑒定 a.擬南芥二倍體有絲分裂間期(2n=10)；b.擬南芥同源四倍體有絲分裂間期(2n=20)Fig.1 Mitotic interphase in diploid and autotetraploid Arabidopsis thaliana a.Diploid A.thaliana(2n=10); b.Autotetraploid A.thaliana(2n=20)

圖2 擬南芥二倍體和四倍體氣孔大小比較 a.二倍體葉片氣孔，氣孔體積較小且單位面積密度較高；b.同源四倍體葉片氣孔，體積變大且密度變小Fig.2 Stoma cells in diploid and autotetraploid A.thaliana a.Diploid,stoma is smaller and in high density per unit area; b.Autotetraploid,stoma is larger with low density

圖3 擬南芥二倍體和同源四倍體葉片氣孔密度比較Fig.3 Stoma density in diploid and autotetraploid A.thaliana

此外，與擬南芥二倍體相比，同源四倍體擬南芥的果莢變長、較粗壯，但果夾內種子數量減少，出現了很多敗育現象(圖4)。統計結果表明，擬南芥同源四倍體的結實率約為49.79%，而二倍體擬南芥的結實率約為89.50%，二倍體結實率顯著高于同源四倍體(圖5)。

圖4 擬南芥二倍體和同源四倍體果莢觀察 a.莢果較大且敗育的現象明顯；b.莢果瘦小但結實率較高Fig.4 Fruits in diploid and autotetraploid A.thalianaa.Relatively longer pods with fewer aborted seeds; b.Relatively shorter pods with fully developed seeds

2.3擬南芥二倍體和同源四倍體的減數分裂過程分析

減數分裂前期Ⅰ的初期，染色體呈一個較大的染色質團(圖6～7:a)；偶線期時，同源染色體開始相互聯系，五對染色體的著絲粒區域聚合到一起，形成一個染色較深的核心區域(圖6～7:b)；雙線期時，在染色體鋪展范圍的非中心位置會有不聯會區域的出現(圖6～7:c )。至終變期，染色體濃縮，不同的交叉的二價體或多價體出現(圖6～7:d )至第一次減數分裂后期，同源染色體分離(圖6～7:e )，直至第二次減數分裂逐步完成，最終形成四體(圖6～7:f)。通常情況下，減數分裂前期的各個時期的染色體都是以絲狀染色質雜亂相互纏繞的狀態存在的，因此不是太容易把他們區分開來，但是終變期以后染色體濃縮到極致呈短棒狀才得以分辨它們的形態和數量。通過對染色體行為的觀察，我們研究發現，擬南芥同源四倍體的減數分裂過程與二倍體基本一致，但減數分裂終變期至中期階段，出現部分單價體和三價體，以及四價體和二價體，但至減數分裂后期，同源染色體能均勻分向兩極且減數第二次分裂過程也未發現異常分裂。

圖5 擬南芥二倍體和同源四倍體結實率比較Fig.5 Seed-set in diploid and autotetraploid A.thaliana

圖6 擬南芥二倍體減數分裂過程Fig.6 Meiosis in diploid A.thaliana

圖7 擬南芥同源四倍體減數分裂過程Fig.7 Meiosis in autotetraploid A.thaliana

表2擬南芥二倍體和同源四倍體5個減數分裂相關基因表達分析

Table2Expressionoffivemeiosis-relatedgenesindiploidandautotetraploidA.thaliana

基因Genes擬南芥倍性PloidyofA．thaliana相對表達量RelativeexpressiomASY1二倍體Diploid四倍體Tetraploid23±0．7a247±1．5bDMC1二倍體Diploid四倍體Tetraploid50±2．5a122±1．5bZYP1二倍體Diploid四倍體Tetraploid23±0．3b13±0．1aMRE11二倍體Diploid四倍體Tetraploid2．5±0．02a9±0．19bSPO11?1二倍體Diploid四倍體Tetraploid0．1±0．030．15±0．02

注：a和b表示差異顯著性，差異顯著水平0.01。

Note：Letters (a and b) notify difference of significance, and significance level 0.01.

2.4擬南芥部分減數分裂相關基因的熒光定量分析

在減數分裂過程中，ASY1、ZYP1為聯會復合體相關基因；SPO11-1和MRE11是重組過程中DNA雙鏈斷裂相關的基因；DMC1則與雙鏈斷裂的早期修復有關。熒光定量結果表明，，與二倍體相比，同源四倍體減數分裂過程中ASY1、DMC1表達水平明顯升高，MRE11和SPO11-1水平有所提高，但不顯著，ZYP1表達水平有所下將(圖2)。依據各自功能的不同呈現不同的變化，主要功能性強且參與多項功能的上調明顯，功能性相對單一的表現出略微上調。結合前人研究結果[7]，我們推斷，伴隨著基因組倍性的改變，這些基因表達水平的變化很可能影響著同源多倍體重組頻率的改變。

3 討論

近年來，有關同源多倍體植物器官形態的報道較多。例如，與二倍體相比，多倍體植物分枝減少[8]，莖桿長度和粗度增加，葉片面積增大[9]，葉片氣孔變大、密度減小，結實率降低等[10～12]。此外，由于基因組含量倍增，多倍體植物細胞核內容物增多、細胞核變大，細胞體積增大等[13]。減數分裂是否正常是影響結實率的一個重要因素。有關于辣椒棗和金銀花的研究發現染色體的構型從終變期開始出現各種異常行為，從而導致染色體不均衡分離，最終影響育性[14～15]。在本研究中，與二倍體相比，同源四倍體擬南芥結實率也顯著降低。本研究發現，同源四倍體擬南芥的減數分裂過程中出現部分多價體構型，但沒有影響正常四分體的形成，所以推測，可能是正常配子后期發育或者是受精作用出現問題導致的有待進一步研究。

同時，本研究還深入分析了一些代表性的減數分裂相關基因。ASY1是聯會復合體側組分相關蛋白,是同源染色體聯會和重組所必需的重要組分[16～17]。在染色體識別和聯會交叉方面也發揮重要作用。同時有研究指出，ASY1介導擬南芥減數分裂中DMC1依賴型的同源重組過程[18]，因此它與DMC1有相似的變化趨勢。有關AtDMC1突變體的研究發現，AtDMC1更傾向于同源染色體之間的修復[19～20]。DMC1基因同時還參與DNA配對和交叉組裝過程，并與DNA的代謝過程有關，因此加倍后它的變化較為顯著；ZYP1是擬南芥中聯會復合體的橫向細絲蛋白，也是高等植物上所分離的第一個聯會復合體蛋白。擬南芥中對ZYP1進行干擾發現ZYP1的缺失對重組的整體水平只有有限的影響[21～22]，但是關于橫向細絲蛋白在早期重組中發揮作用的報道普遍認為，橫向細絲蛋白是重組相關蛋白程序性消耗必需的[23]，當重組相關蛋白普遍提高消耗過多時它的含量就會下降，因此在不同的倍性中它的差異相對較小且本身表達量不高；擬南芥中，MRE11參與MRN復合物(植物的雙鏈斷裂修復蛋白,包括MRE11、RAD50和NBS1)的形成，是雙鏈斷裂推進所必需的，在雙鏈斷裂的修復過程中發揮直接作用，另外它還參與DNA檢測、信號匹配、端粒保護和修復DNA雙鏈斷裂的過程[24～25]，從它的這些功能推斷他的表達量要高于功能單一的基因，比如SPO11-1。它在DNA檢測、DSB修復以及信號匹配等方面的作用決定著加倍后它的相對表達量略微提高。變化趨勢介于ASY1和SPO11-1之間。減數分裂的重組起始于雙鏈斷裂的形成，SPO11蛋白催化產生雙鏈斷裂，SPO11-2也發揮類似的功能，但是二者并不冗余,形成多聚異構體，共同催化DNA雙鏈缺口(DSB) 形成。與二倍體相比，同源四倍體中SPO11表達水平有所提高，但并不顯著，說明在誘導DNA雙鏈斷裂方面，不受基因組倍性影響。因此，綜合這些基因的功能及其表達水平變化，我們可以初步推斷，伴隨著基因組倍性增加，減數分裂相關基因表達水平變化很可能是調控減數分裂期同源重組頻率改變的重要原因。

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MolecularandCytologicalanalysisofMeiosisinAutotetraploidArabidopsisthaliana

LI Yun-Ling TIAN Bao-Ming YANG Yan CUI Ming-Zhu HAO Zhi-Da WEI Fang*

(School of Life Sciences,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001)

The diploidArabidopsisthaliana(Columbia-0, 2n=10) was used to obtain autotetraploid plants(2n=20) after 0.2% colchicine treatment and cytological identification. Meiotic chromosome behaviors were comparatively observed in diploid and autotetraploidA.thaliana, and the meiosis-related genes were relatively quantified by Real-time PCR. The autotetraploidA.thalianaproduced relatively larger stoma and fruits, but the stomatal density and the seed-set were significantly reduced. Some chromosomal configurations were also observed during meiosis involving the trivalents, univalents, bivalents and quadrivalents in autotetraploid plants. The expression of several meiosis-related genes includingASY1,DMC1,MRE11 andSPO11-1 were up-regulated in autotetraploids. Therefore, as autopolyploidization proceeds, plants may adapt themselves into environment by accompanying with phenotype changes owing to the altered chromosomal behaviors and gene expressions.

Arabidopsisthaliana;diploid;autotetraploid;meiosis;chromosome

NSFC-河南人才培養聯合基金(U1204308)；河南省教育廳高等學校重點科研項目(13A180437)

李云玲(1989—)，女，碩士研究生，主要從事植物分子細胞遺傳學方面的研究。

* 通信作者：E-mail:fangwei@zzu.edu.cn

2015-10-23

Q943

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.03.006