剛毛檉柳Na+/H+逆向轉運蛋白基因的克隆與表達分析

賈園園 張春蕊 王玉成 楊傳平 王 超

(東北林業大學林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040)

剛毛檉柳Na+/H+逆向轉運蛋白基因的克隆與表達分析

賈園園 張春蕊 王玉成 楊傳平 王 超*

(東北林業大學林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040)

通過對剛毛檉柳(Tamarixhispida)轉錄組分析，鑒定獲得一個Na+/H+逆向轉運蛋白基因,命名為ThSOS1。ThSOS1基因cDNA全長3 917 bp，開放閱讀框長3 498 bp，編碼1 165個氨基酸，編碼蛋白相對分子質量128.8 kDa，理論等電點(PI)為6.42。疏水性分析預測ThSOS1基因編碼蛋白N端具有10個跨膜結構域，C端具有一個較長的親水尾部。ThSOS1氨基酸序列與長葉紅砂、藜麥、鹽地堿蓬等植物的SOS1序列同源性較高，分別可達92%，73%，72%。系統發育分析表明ThSOS1為質膜型Na+/H+逆向轉運蛋白，與液泡膜型Na+/H+逆向轉運蛋白屬于不同分支。實時熒光定量RT-PCR分析顯示，該基因受高鹽、干旱誘導上調表達，暗示ThSOS1可能在剛毛檉柳抗旱耐鹽過程中發揮重要作用。

剛毛檉柳；Na+/H+逆向轉運蛋白；脅迫響應；基因表達

土壤鹽漬化是影響農業生產和生態環境的重要因素，鹽害能造成植物體離子失衡和滲透脅迫，是植物最重要的非生物脅迫之一[1]。其中的離子毒害主要是指高濃度的Na+對植物的毒害作用[2]。Na+/H+逆向轉運蛋白是植物耐鹽的關鍵因子[3]，它利用質膜或液泡膜H+-ATPase和H+-PPase建立的跨膜質子梯度為驅動力，將細胞內過多的Na+從質膜向胞外排放或將Na+富集在液泡內區隔化，使細胞質維持著較低的Na+水平，避免了過多的Na+對細胞的毒害作用，同時也維持了細胞的滲透平衡[4～5]。

植物Na+/H+逆向轉運蛋白主要分為兩類：質膜型和液泡膜型。質膜型Na+/H+逆向轉運蛋白參與植物的Na+外排，液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白功能是將Na+運入液泡區隔化以維持細胞質內正常的Na+濃度。植物質膜Na+/H+逆向轉運蛋白首次于1976年在大麥中發現[6]。1985年Blumwald和Poole在紅甜菜的根部貯藏組織中發現了液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白[7]。到目前為止，已經在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[8]、水稻(Oryzasativa)[9]、番茄(Lycopersiconesculentum)[10]和油菜(Brassicanapus)[11]等多種植物中分離得到了Na+/H+逆向轉運蛋白基因。Shi等在擬南芥中克隆出了一個細胞質膜Na+/H+逆向轉運蛋白SOS1，這個基因過量表達后能降低芽中的Na+含量，增強愈傷組織的耐鹽性[12]。隨后的研究又證實了SOS1基因過量表達，可以顯著提高擬南芥對鹽脅迫的耐性[13]。棉花(Gossypiumhirsutum)Na+/H+逆向轉運蛋白基因GhNHX1過量表達能提高轉基因煙草的耐鹽性[14]。這些研究都表明Na+/H+逆向轉運蛋白在植物耐鹽過程中具有重要作用。

目前，對植物中Na+/H+逆向轉運蛋白的研究主要集中在一些模式植物中，對木本植物的研究較少，對鹽生木本植物的研究更少。剛毛檉柳(Tamarixhispida)屬檉柳科(Tamaricaceae)檉柳屬(Tamarix)，灌木，作為優良的防風固沙植物，其耐干旱、鹽堿、貧瘠、風蝕和沙埋[15]，廣泛分布于礫石戈壁、粘土、砂土、流沙及各種不同程度的鹽漬化土壤。這表明剛毛檉柳體內有著一套非常有效的抗逆系統，是研究木本植物耐鹽分子機理、分離重要耐鹽功能基因的理想物種之一。本實驗通過對剛毛檉柳轉錄組測序數據進行分析，克隆獲得了一條Na+/H+逆向轉運蛋白基因(ThSOS1)的全長cDNA序列，并對該序列進行了生物信息學分析。同時，利用實時定量RT-PCR技術分析了其在鹽和干旱脅迫下不同時間點的表達模式，為進一步了解ThSOS1在檉柳非生物脅迫應答中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理方法

將剛毛檉柳的種子播種于V泥炭土∶V沙=2∶1的混合土壤中，在平均溫度24℃，光照時間14 h·d-1，相對濕度為70%～75%的溫室中培養。待幼苗生長至苗高3～4 cm后，選取生長正常且大小一致的幼苗分別用水(對照組)、0.4 mol·L-1的NaCl溶液和20%的PEG6000溶液澆灌，在脅迫處理3、6、9、12、24、48、72、96 h后，取剛毛檉柳的根部組織和地上部組織，用液氮速凍后保存在-80℃冰箱，用于實時熒光定量RT-PCR分析,每個處理重復3次。

1.2 ThSOS1基因的克隆與序列分析

通過對剛毛檉柳轉錄組測序數據的分析，根據Unigenes功能注釋結果查找獲得一條Na+/H+逆向轉運蛋白基因(ThSOS1)，對其全長序列設計引物進行PCR，目的條帶經膠回收純化后，連接到pMD18-T載體上，進一步測序確定所獲得的序列的準確性。

用在線工具ORF Finder程序確定ThSOS1基因序列的開放讀碼框(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf.html)；利用序列處理在線工具包(SMS)將其基因序列翻譯成氨基酸；利用BioEdit軟件進行氨基酸序列的同源性分析；運用MEGA5.1軟件構建系統進化樹；用ProtParam程序進行蛋白質分子質量和等電點的預測(http://www.ncbi.n1m.nih.gov/gorf.htm1)；利用Protscal程序進行蛋白質的疏水性預測分析(http://web.expasy.org/protscale/)；用SOPMA軟件預測ThSOS1的蛋白二級結構；使用在線工具TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED-form.html)和TMHMM server 2.0軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測ThSOS1的編碼蛋白跨膜結構；利用SMART軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)進行蛋白結構域的分析；應用Psort軟件(http://psort.hgc.jp/form.html)進行亞細胞定位預測。

1.3 實時熒光定量RT-PCR表達分析

用CTAB法提取剛毛檉柳根部組織和地上部組織的總RNA，經DNaseⅠ(Promega)消化除去DNA，用Prime ScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)反轉錄合成cDNA，將反應產物稀釋10倍，并作為定量RT-PCR的模板。

根據ThSOS1全長cDNA序列設計定量引物，內參基因分別是β-actin(FJ618517)、α-tubulin(FJ618518)、β-tubulin(FJ618519)，引物序列見表1。利用MJ OpticonTM2實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad,Hercules,CA)對基因的表達模式進行分析，實時熒光定量RT-PCR使用的試劑盒是Trans Start Top Green qPCR Super Mix(Trans Gen)，反應體系是：2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL,上游引物和下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，稀釋后的模板cDNA 2 μL，加滅菌去離子水補足體積至20 μL。反應程序為：94℃預變性30 s；94℃變性12 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，79℃讀板1 s，45個循環。待PCR反應結束后，將反應溫度以0.5℃·s-1的速度從55℃升到99℃。每個樣品重復3次，用2-△△Ct方法進行基因的相對定量分析[16]。

表1 實時定量RT-PCR引物序列

2 結果與分析

2.1 ThSOS1基因全長cDNA的獲得及序列分析

通過對剛毛檉柳轉錄組數據的分析，根據基因功能注釋結果查找獲得一條編碼Na+/H+逆向轉運蛋白基因序列，對其進行重新測序，最終獲得剛毛檉柳Na+/H+逆向轉運蛋白基因全長cDNA序列，命名為ThSOS1。將該基因序列用ORF founder程序進行分析發現它的開放閱讀框長3 498 bp，編碼1 165個氨基酸。5′非編碼區(UTR)長185 bp，3′非編碼區(UTR)長234 bp(圖1)。

ProtParam程序預測ThSOS1編碼蛋白的相對分子質量128.8 kDa，理論等電點(PI)為6.42。疏水性分析發現，ThSOS1的N末端部分有一個很強的疏水性結構，而C末端的親水性較強。按照氨基酸分值越高疏水性越強，分值越低親水性越強的原則，發現整個肽鏈中疏水性氨基酸多于親水性氨基酸，整個多肽鏈表現為疏水性(圖2:A)，因此ThSOS1屬于疏水性蛋白，符合膜蛋白的特性。二級結構預測表明ThSOS1蛋白含有479個α-螺旋(占41.12%)、348個隨意卷曲(占29.87%)、234個延伸鏈(占20.09%)和104個β-轉角(占8.93%)，其中二級結構主要由α-螺旋、隨意卷曲和延伸鏈交錯構成(圖2:C)?？缒そY構預測表明ThSOS1包含有10個完全跨過液泡膜的跨膜結構域(圖2:B)，這與已報道的動植物Na+/H+逆向轉運蛋白的跨膜區域數(10～12)一致。經SMART軟件分析，發現ThSOS1蛋白在第32～448個氨基酸位點處存在典型的“Na+/H+Exchanger”蛋白結構域，E-值1.6e-64，表明ThSOS1屬于Na+/H+逆向轉運蛋白家族成員。

2.2 ThSOS1蛋白的亞細胞定位分析

應用Psort軟件(http://psort.hgc.jp/form.html)對ThSOS1蛋白的亞細胞定位進行預測，結果顯示其可能定位于質膜、內質網、液泡和高爾基體(表2)。ThSOS1定位于質膜的概率最高，為69.6%，定位于內質網、液泡和高爾基體的概率都相對較小，表明ThSOS1可能定位于細胞質膜上，在調控離子跨質膜轉運過程中發揮重要作用。

表2 ThSOS1蛋白亞細胞定位

2.3 同源比對與系統樹構建

將ThSOS1的氨基酸序列與其他植物Na+/H+逆向轉運蛋白的氨基酸序列進行同源性比較，結果顯示ThSOS1與長葉紅砂RtSOS1(Reaumuriatrigyna，AGW30208.1)、藜麥CqSOS1B(Chenopodiumquinoa，ACN66494.1)、鹽地堿蓬SsSOS1(Suaedasalsa，AHJ14584.1)、冰葉日中花McSOS1(Mesembryanthemumcrystallinum，ABN04858.1)、菠菜SoSOS1(Spinaciaoleracea，CDL70805.1)和大葉補血草LgSOS1(Limoniumgmelinii，ACF05808.1)的氨基酸序列都具有較高同源性，與同一科的長葉紅沙Na+/H+逆向轉運蛋白RtSOS1的同源性最高，達92%，和其他植物的質膜Na+/H+逆向轉運蛋白也有較高的同源性，同源性在70%～73%(圖3)。

對不同植物的Na+/H+逆向轉運蛋白之間的遺傳關系進行了系統發育分析(圖4)，結果顯示ThSOS1與質膜型Na+/H+逆向轉運蛋白的親緣關系較近，而與液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白親緣關系較遠，表明ThSOS1為剛毛檉柳的一個質膜型Na+/H+逆向轉運蛋白。

圖1 剛毛檉柳ThSOS1基因cDNA序列及其推測的氨基酸序列Fig.1 ThSOS1 nucleotide sequence and deduced amino acid sequence in T.hispida

圖2 剛毛檉柳ThSOS1蛋白的生物信息學分析 A.疏水性分析；B.跨膜結構分析；C.二級結構預測Fig.2 Bioinformatics analysis of ThSOS1 protein in T.hispida A. Hydrophobicity analysis; B. Transmembrane structure prediction; C. Secondary structure prediction

2.4 ThSOS1基因在脅迫條件下的表達分析

為了進一步了解ThSOS1對逆境脅迫的響應情況，利用實時熒光定量RT-PCR技術對NaCl和PEG脅迫下檉柳ThSOS1的表達模式進行了分析。

在NaCl脅迫下，ThSOS1在根部和地上部組織中的表達模式相似。隨著脅迫時間的延長，ThSOS1的相對表達量都逐漸上升，并在脅迫24 h后達到最高峰，48 h后逐漸下降。其中，ThSOS1在地上部組織中的相對表達量變化較大，在24 h時相對表達量是正常生長狀態下的22倍。

與NaCl脅迫下的表達模式相似，PEG脅迫下ThSOS1在檉柳的根部和地上部都被誘導上調表達。其中，根中的相對表達量在脅迫12 h后達到一個小的峰值，之后略有下降；在脅迫48 h時又逐漸增加，并在72 h時表達量上升到最高水平。ThSOS1在地上部的表達模式與根部相似，在脅迫9 h達到一個小高峰，之后下降，24 h迅速上升，在48 h達到峰值。另外，從圖2中還可以明顯看出高鹽和干旱脅迫下ThSOS1在檉柳的根部和地上部均是上調表達，且在地上部的相對表達量顯著高于根。這些結果表明了ThSOS1可能在剛毛檉柳的耐鹽抗旱機制中具有重要作用，并且主要在葉和莖中發揮功能。

3 討論

植物質膜Na+/H+逆向轉運蛋白能夠將細胞質中過多的Na+排出胞外,從而減輕Na+對細胞代謝活動及細胞器的破壞,使植物更好地適應鹽漬生境[17～18]。因此，質膜Na+/H+逆向轉運蛋白在植物耐鹽性方面具有重要作用。已有研究表明，絕大多數植物質膜Na+/H+逆向轉運蛋白基因的開放閱讀框(ORF)長度為3 410～3 500 bp，編碼1 129～1 169個氨基酸殘基，推測分子量均為127 kDa左右[19～21]。本研究首次從剛毛檉柳中克隆到了Na+/H+逆向轉運蛋白基因ThSOS1，預測分析表明其開放閱讀框長3 498 bp，編碼1 165個氨基酸，分子量為128.8 kDa，氨基酸序列包含典型的“Na+/H+Exchanger”結構域，ThSOS1符合Na+/H+逆向轉運蛋白家族成員的序列特征。亞細胞定位分析顯示，ThSOS1蛋白定位于質膜的概率最大，系統進化樹分析也發現ThSOS1與質膜Na+/H+逆向轉運蛋白的親緣關系最近，而與液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白親緣關系較遠，表明ThSOS1為質膜型Na+/H+逆向轉運蛋白，在剛毛檉柳的耐鹽反應中介導Na+的外排來維持細胞內的離子平衡?？缒そY構預測表明ThSOS1包含有10個完全跨膜結構域，與已報道的動植物和微生物的Na+/H+逆向轉運蛋白的跨膜區域數(10～12)一致，跨膜區氨基酸序列與其他植物的Na+/H+逆向轉運蛋白之間存在很高的相似性,表明跨膜區是高度保守的。ThSOS1蛋白的C末端有一個較長的親水性區域，使SOS1能夠與其它逆境相關調控因子發生互作,從而適應鹽漬環境[22]。

圖3 剛毛檉柳ThSOS1與其他植物SOS1同源序列的比較Fig.3 Comparison of ThSOS1 in T.hispida with other plant SOS1 genes

圖4 幾種植物Na+/H+逆向轉運蛋白的系統進化關系分析 CqSOS1B.藜麥(ACN66494.1)；SoSOS1.菠菜(CDL70805.1)；SsSOS1.鹽地堿蓬(AHJ14584.1)；McSOS1.冰葉日中花(ABN04858.1)；SpSOS1.海馬齒(AFX68848.1)；RtSOS1.長葉紅沙(AGW30208.1)；LgSOS1.大葉補血草(ACF05808.1)；AtNHX1.擬南芥(NP_198067.1)；SeNHX1.鹽角草(AAN08157.1)；ZxNHX1.霸王(ABU92562.1)；PeNHX1.胡楊(ABY86892.1)Fig.4 Phylogenetic tree analysis of Na+/H+ antiporters from various plant species CqSOS1B. Chenopodium quinoa(ACN66494.1)；SoSOS1. Spinacia oleracea(CDL70805.1)；SsSOS1. Suaeda salsa(AHJ14584.1)；McSOS1. Mesembryanthemum crystallinum(ABN04858.1)；SpSOS1. Sesuvium portulacastrum(AFX68848.1)；RtSOS1. Reaumuria trigyna(AGW30208.1)；LgSOS1. Limonium gmelinii(ACF05808.1)；AtNHX1. Arabidopsis thaliana(NP_198067.1)；SeNHX1. Salicornia europaea(AAN08157.1)；ZxNHX1. Zygophyllum xanthoxylum(ABU92562.1)；PeNHX1. Populus euphratica(ABY86892.1)

圖5 ThSOS1基因在不同脅迫下的表達模式分析Fig.5 Expression analysis of ThSOS1 gene under several abiotic stresses

不同脅迫處理下，植物中的SOS1基因的表達模式有所差異。Shi等發現擬南芥AtSOS1在鹽脅迫下表達量明顯提高，而在冷脅迫和外源ABA處理下表達卻沒有顯著變化[11]；與對照組相比，水稻OsNHA1受鹽脅迫誘導顯著表達，而干旱處理則沒有明顯變化[23]；NaCl脅迫處理下，小麥TaSOS1的表達水平顯著增加,但PEG處理無誘導作用[24]。Song等研究發現鹽脅迫可以誘導大島野路菊CcSOS1上調表達，干旱、低溫和ABA處理也對CcSOS1的表達產生了不同程度的影響[25]。本研究中，在NaCl和PEG脅迫處理后，ThSOS1基因在檉柳的根部和地上部的表達量均明顯增加，特別是在地上部組織中，ThSOS1基因在脅迫12 h后持續保持高豐度的表達。ThSOS1基因能對干旱和高鹽脅迫做出響應，表明其可能參與檉柳的抗旱耐鹽過程。ThSOS1在檉柳地上部的表達量明顯高于根部，推測其可能參與檉柳葉片中的Na+通過韌皮部向老葉的轉移，或者能夠促進Na+從其葉片鹽腺中的分泌，但該基因在檉柳抗逆反應中的具體功能及其參與抗逆的調控機制還需要進一步的研究。植物的耐鹽性是一個復雜數量性狀，是多基因相互作用的結果。然而有研究表明，轉單一的Na+/H+逆向轉運蛋白基因能夠明顯地提高作物的耐鹽能力。擬南芥AtSOS基因轉化擬南芥后使其過表達，轉基因株系內的Na+含量明顯降低，耐鹽能力也顯著增強[12]。Yue等發現擬南芥AtSOS1基因轉入番茄后，提高了轉基因植株的耐鹽能力[26]。將星星草基因PtNHA1轉入擬南芥中，PtNHA1過表達后能增強轉基因擬南芥的耐鹽性，還能消除活性氧的毒害作用，提高抗氧化能力[27]。這些研究表明利用轉化SOS1基因提高植物的耐鹽能力，是利用基因工程方法培育耐鹽植物新品種的一種有效途徑[26～28]。迄今為止，對植物中質膜Na+/H+逆向轉運蛋白的研究主要集中在草本植物中，對木本植物的研究較少。木本植物與草本植物在形態結構和生理特性上都有一定的區別[29]，木本植物體與草本植物的質膜Na+/H+逆向轉運蛋白是否具有相似功能尚不清楚。因此，了解ThSOS1的功能將為木本植物的耐鹽機理的研究提供有價值的參考，同時為林木抗逆育種提供有效的基因資源和理論依據。目前，ThSOS1的植物表達載體構建正在進行中，后續將對擬南芥和剛毛檉柳進行遺傳轉化，對ThSOS1的功能及其活性調控機制進行深入研究。

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CloningandExpressionAnalysisofaPlasmaMembraneNa+/H+AntiporterGeneinTamarixhispida

JIA Yuan-Yuan ZHANG Chun-Rui WANG Yu-Cheng YANG Chuan-Ping WANG Chao*

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

A full length cDNA of a Na+/H+antiporter gene (namedThSOS1) gene was isolated from the transcriptome cDNA librarys ofTamarixhispida.ThSOS1 was 3 917 bp in length, including an open reading frame of 3 498 bp which was predicted to encode a polypeptide of 1 165 amino acids. The estimated molecular weight and isoelectric point of the putative protein were 128.8 kDa and 6.42, respectively. By hydrophobic cluster analysis,ThSOS1 contained 10 potential transmembrane domains within the N- terminal protion and a long hydrophilic cytoplasmic tail in the C-terminal protion. By multiple sequence alignment,ThSOS1 show 92%, 73%, and 72% identities in amino acid sequence to plasma membrane Na+/H+antiporter genes fromReaumuriatrigyna,ChenopodiumquinoaandSuaedasalsa. By phylogenetic analysis,ThSOS1 was more related to the plasma membrane-type Na+/H+antiporter and clustered distantly with the vacuolar-typed Na+/H+antiporter. By quantitative real-time PCR assay, the mRNA levels ofThSOS1 was significantly up-regulated inT.hispidaunder NaCl and PEG treatments. Therefore,ThSOS1 might play an important role in salt and drought tolerance ofT.hispida.

Tamarixhispida;Na+/H+antiporter;stress responses;gene expression

國家自然科學基金項目(31300571)；教育部博士點基金資助項目(20130062120012)

賈園園(1988—)，女，碩士研究生，主要從事林木抗逆機理研究。

* 通信作者：E-mail:wzyrgm@163.com

2015-11-13

S793.5

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.03.010