黃芩ICS基因部分編碼序列的克隆及其對水楊酸含量影響的研究

蘇 虎 朱友林 李 蓉 吳 超 張 蕓

(1.南昌大學生命科學學院，南昌 330031； 2.江西科技師范大學生命科學學院，南昌 330013)

黃芩ICS基因部分編碼序列的克隆及其對水楊酸含量影響的研究

蘇 虎1,2朱友林1*李 蓉2吳 超2張 蕓2

(1.南昌大學生命科學學院，南昌 330031；2.江西科技師范大學生命科學學院，南昌 330013)

以黃芩為實驗材料，利用PCR克隆了其異分支酸合成酶(Isochorismate synthase,ICS)基因的部分編碼序列，利用該序列構建了病毒誘導的基因沉默(Virus induced gene silence,VIGS)載體pTRV2-VIGSics，對黃芩ICS基因進行了沉默；測定了沉默后ICS基因的表達水平及ICS酶活性，研究了ICS基因沉默對黃芩水楊酸(Salicylic acid,SA)含量的影響，以及干旱脅迫對沉默材料ICS基因表達水平、酶活性和SA含量的影響。結果表明VIGS沉默處理使ICS表達水平顯著降低，為對照組的25%，ICS酶活性未檢測到，黃芩SA含量為對照組的44.4%；干旱脅迫下ICS表達水平和酶活性有所恢復，分別為對照組的87%和4.95%，黃芩SA含量沒有恢復，而是降低至了對照組的13.2%。

黃芩；異分支酸合成酶；水楊酸；病毒誘導的基因沉默

中草藥品質受到自身所合成的藥效成分含量高低的影響，由中草藥次生代謝所產生的一些產物是其主要藥效成分。植物中這些次生代謝產物功能之一是協助其抵御或適應外界不良條件[1]，在該過程中相關防御基因被激活，使得相應次生代謝產物累積水平發生改變。水楊酸(Salicylic acid,SA)能夠激活相關防御基因[2]，通過對依賴于SA的次生代謝途徑進行調控可改變相應次生代謝產物合成水平[3]。在植物體內主要存在兩條SA合成途徑，即PAL(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)途徑和ICS(Isochorismate synthase,ICS)途徑(圖1)。

圖1 植物中SA合成的PAL和ICS途徑Fig.1 The pathway of SA synthesis in plant[4]

其中PAL途徑對SA合成的影響已有眾多報道，將擬南芥中的pal1,pal2,pal3,pal4等4個PAL家族基因全部突變，在脅迫處理后SA含量約為對照組的50%[5]；然而在某些脅迫條件下植物體內SA合成主要依賴于ICS途徑[2]，ICS突變體植株在受到紫外等條件脅迫時不能產生SA或SA含量顯著降低[4,6]。這表明ICS途徑對SA合成有著重要的調控作用，在某些條件下SA合成可能特異性依賴于ICS功能的發揮。

目前對藥用植物中SA的研究多集中于外源SA對藥用植物次生代謝產物的影響，如對虎杖白藜蘆醇和虎杖苷[7]、紅豆杉紫杉醇[8]、丹參丹酚酸[9]等合成的影響，然而，在藥用植物中關于內源SA的合成途徑，影響內源SA水平的因素，尤其是ICS對SA合成水平的影響鮮有報道。

本實驗以黃芩為材料，擬克隆其ICS序列，并研究ICS對SA合成的影響，為進一步深入研究SA對藥用植物有效成分的調控及ICS在該調控過程中的作用機制提供一定依據。

1 材料與方法

1.1 材料與干旱脅迫處理

將黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)種子播種在以蛭石、珍珠巖、黑土(1∶1∶2，V/V)為基質的盆中，于25℃，相對濕度60%，光密度60 μmol·m-2·s-1每日12 h光照進行培養。7天出苗，出苗后10天采用和播種相同的基質移至盆中培養備用。干旱脅迫采用20% PEG6000[10]澆灌，每天每盆澆灌50 mL，連續澆灌3天。

1.2 總RNA的提取與反轉錄

利用QIAGEN公司試劑盒(kit no.74904)提取總RNA，取100 ng總RNA利用QIAGEN反轉錄試劑盒(kit no.205311)進行反轉錄得到cDNA，反轉錄產物稀釋3倍后用作PCR模板。

1.3 ICS基因部分編碼序列的克隆

采用引物[11]HQICS-F(5′-3′):CTCAGGTTGAGTTTGATGAGCT，HQICS-R(5′-3′):CTCTGGAGTGTTTCCAATGAA。反應體系為10×buffer 2.5 μL，10 μmol·L-1引物各0.5 μL，10 mmol·L-1dNTP 0.2 μL，模板1 μL，5 U·μL-1Taq酶0.2 μL，補水至25 μL。

PCR程序為：95℃ 3 min；94℃ 40 s，51℃ 30 s，72℃ 1 min，35 cycles；72℃ 7 min。擴增完畢后直接進行PCR產物測序。

1.4 VIGS沉默用載體的構建

根據HQICS測序結果設計引物HQICS-VIGS-F(5′-3′)：CCGGAATTCCGGAGCTATGGAGAAG，HQICS-VIGS-R(5′-3′)：CCGCTCGAGTACGTGCAAGGACAAC(目的片段211 bp，該片段命名為VIGSics)，下劃線部分為酶切位點，分別為EcoRⅠ和XhoⅠ。利用上述引物，以cDNA為模板采用與1.3相同的PCR體系和程序進行擴增，擴增產物回收后利用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，同時對pTRV2空載體進行EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，采用takara lingation kit將酶切后的DNA片段和pTRV2連接。連接反應完畢后取10 μL反應液轉化JM109，挑取單菌落劃線，挑取劃線后的單菌落進行菌落PCR驗證，挑取PCR陽性克隆搖菌，提取質粒進行酶切和測序驗證。

1.5 VIGS沉默處理

該部分操作照Ekengren[12]等的方法進行。分別取含有pTRV1和pTRV2載體的農桿菌GV3101于150 mL LB中(含利福平40 mg·L-1,卡那霉素40 mg·L-1)28℃培養過夜，過夜后的菌液于4 000 r·min-1，室溫離心，用浸染buffer(10 mmol·L-1MgCl2,10 mmol·L-1MES[pH5.6]，150 μmol·L-1乙酰丁香酮)重懸沉淀，并稀釋至pTRV1 OD600=0.8，pTRV2 OD600=0.4， 將稀釋后的pTRV1和pTRV2等體積混合即得浸染用混合懸液。將混合懸液于25℃振蕩培養3 h，浸染前加入silwet L-77至終濃度為0.04%，然后進行真空浸染，浸染時間3 min。

1.6 qPCR分析

采用QIAGEN NOVA kit(kit no.208056)進行qPCR，所用儀器為Bio-rad MyIQ2，反應體系及具體步驟參照說明書進行。其中引物為HQICS-QPCR-F(5′-3′):CTCAGGTTGAGTTTGATGAGCT和HQICS-QPCR-R(5′-3′):CTCTGGAGTGTTTCCAATGAA；內參引物根據黃芩5.8S核糖體RNA序列(GenBank:JN853779.1)設計，分別為Internal-F(5′-3′):ATATCTCGGCTCTCGCATCA，Internal-R(5′-3′):CTCGGCCTGATGGCTTCTGG。數據分析參照Pfaffl[13]的方法進行。

1.7 ICS酶活性測定

該部分操作參照Poulsen[14]等的方法利用HITACHI F-2700熒光分光光度計測定。取實驗材料，液氮下充分研磨，按照100 μL/0.01 g加入ICS酶提取液(0.1 mol·L-1Tris-HCl at pH7.5,10% glycerol[v/v],1 mmol·L-1DTT,0.2 mmol·L-1PMSF,1 mmol·L-1EDTA)，12 000 r·min-14℃離心20 min，取上清125與125 μL反應液混合(0.1 min·L-1Tris-HCl,pH7.5,1 mmol·L-1Ba-chorismate,10 mmol·L-1MgCl2)，對照管加入62.5 μL終止液(甲醇∶仲丁醇[1∶1,v/v])，然后于30℃保溫1 h，反應完畢后樣品管中加入62.5 μL終止液。取100 μL反應液與1.4 mL Na-Pi緩沖液(pH7.0)混合均勻，在Ex=302 nm，Em=412 nm處測定FLD值；然后將此混合液于100℃加熱15 min，冷卻至室溫后再次測定FLD值，加熱后FLD值減去加熱前FLD值即ICS酶活性。

1.8 SA含量測定

SA的提取與含量測定參照Dewdney[15]等的方法進行。標準曲線為：

y=0.105x-0.011，R2=0.99

式中：x為SA濃度(μg·mL-1)，y為峰面積比值(As/Ai)。

2 實驗結果

2.1 ICS基因部分編碼序列的PCR克隆

利用PCR擴增得到了約400 bp的黃芩cDNA片段(圖2)。

測序后長度為421 bp，將該片段命名為HQICS，其序列如下：TCTCAGGTTGAGTTTGATGAGCTTGAAGGAAGTTCGATGATGGCTGCAACTG-TTGCATGGGACAAACGCTTGTCACGGAGCTATGG-AGAAGCAATTGCAGCACTTGAGGCAACAATGTG-GCAGGTTTCATCAATTGTCCGGAGATTGAATGGT-CGTACTCRTCATGCTATTATGCTTCACCAGACTCA-TGTTCCTAGCAAGGCATCATGGGACTCAGCTGTC-AATCAAGCTTTGGACTTGATAAATAGGAAAAATT-CATCGCTCATTAAGGTTGTCCTTGCACGTAGTAG-CAGAGTACTAACAACGGTAGAGGTTGATCCTCTT-GAGTGGCTGATGAGCTTGCAGGTCGAAGGGGTTA-ATGCCTACCAGTTTTGTCTtCAGCCTCCTGAATCA-CCAGCATTCATTGGAAACACTCCAGAGA

圖2 利用PCR擴增得到的部分基因編碼序列電泳圖M. DNA marker；1～2.樣品正常擴增組體系的2個重復；3.HQICS-F單引物對照；4.HQICS-R單引物對照Fig.2 The partial gene coding sequence in S.baicalensis Georgi M. DNA marker; 1-2. Normal samples; 3. HQICS-F single primer control; 4. HQICS-R single primer control

2.2 HQICS的BLAST結果

將此序列在NCBI上進行nucleotide blast，以進一步確認基因功能及相關信息。結果表明該序列與長春花(Catharanthusroseus)ICS序列(GenBank:AJ006065.1)有71%的相似性，與煙草(Nicotianatabacum)ICS(GenBank:AY740529.1)有79%的相似性，與推定的蓖麻(Ricinuscommunis)ICS(Reference Sequence:XM_002511480.1)具有83%相似性。對上述物種蛋白質序列進行blastp分析表明該序列屬于分支酸(Chorimate)結合蛋白超基因家族，包含分支酸結合位點(圖3)。

2.3 VIGS沉默用載體pTRV2-VIGSics的構建

2.3.1 VIGSics與pTRV2連接及轉化JM109

分別將VIGSics和pTRV2(GenBank:AF406991)用EcoRⅠ和XhoⅠ進行雙酶切(圖4)，酶切產物進行連接反應，連接后轉化JM109，挑取兩個單克隆進行菌落PCR，結果見圖5。

圖3 HQICS推測蛋白序列的同源比對結果 圖中黑色背景部分為分支酸結合位點。Fig.3 Alignment Results of the predicated protein sequence of HQICS gene The sequence highlighted with black is the chorismate binding site.

圖4 VIGSics，pTRV2的雙酶切驗證 M. DNA marker；1.樣品；a. VIGSics雙酶切；b. pTRV2雙酶切Fig.4 Enzyme digestion of VIGSics，pTRV2 with EcoRⅠ and XhoⅠ M. DNA marker; 1.Samples; a.VIGSics; b. pTRV2

圖5 pTRV2-VIGSics/JM109的菌落PCR驗證M.DNA marker; 1～2. 樣品Fig.5 The colony PCR of pTRV2-VIGSics/JM109 M. DNA marker; 1-2. Samples

2.3.2 pTRV2-VIGSics酶切驗證

挑取菌落PCR驗證為陽性的1#菌落搖菌提取質粒進行酶切(EcoRⅠ/XhoⅠ)驗證，結果見圖6。

圖6 pTRV2-VIGSics酶切產物電泳圖 M. DNA marker； 1～2.樣品Fig.6 The enzyme digestion of pTRV2-VIGSics with EcoRⅠ and XhoⅠ M. DNA marker; 1-2.Samples

VIGSics僅為211 bp，相對于pTRV2載體片段9 663 bp而言太小，電泳圖中未能清晰呈現VIGSics片段。為保證連接的正確性，實驗中對pTRV2-VIGSics進行了測序驗證(數據未列出)，測序結果驗證了上述推測。

2.4pTRV2-VIGSics、pTRV2空載體及pTRV1轉化農桿菌GV3101

采用凍融法分別將pTRV2-VIGSics，pTRV2空載體及pTRV1(GenBank:AF406990)導入農桿菌GV3101，挑取單菌落劃線，挑取劃線后得到的單菌落進行菌落PCR驗證，菌落PCR結果如圖7，電泳結果顯示擴增分別得到了約211、610和397 bp的目的片段，這表明pTRV2-VIGSics、pTRV2空載體及pTRV1轉化農桿菌GV3101成功。

2.5 ICS基因的VIGS沉默

采用培養21天的黃芩苗進行VIGS沉默處理，沉默處理后9天取樣進行qPCR和酶活性分析，結果表明樣品中ICS表達水平是對照組的25%(圖8)，在樣品中未檢測到ICS酶活性(圖9)。實驗中也觀察了干旱脅迫處理對沉默后ICS表達水平及酶活的影響，結果表明ICS表達水平為對照組的87%(圖8)，酶活性為對照組的4.95%(圖9)。

圖7 pTRV2-VIGSics/GV3101，pTRV2/GV3101及pTRV1/GV3101菌落PCR a. pTRV2-VIGSics/GV3101；b. pTRV2/GV3101；c. pTRV1/GV3101 M. DNA marker；1～3.樣品 pTRV2-VIGSics/GV3101菌落PCR引物采用HQICS-VIGS-F/HQICS-VIGS-R，pTRV2/GV3101菌落PCR引物為V2-forward-ACTACCAAGGCGAACACTGG，V2-reverse-GTTGACACACAAGAACCGCC(目的片段610 bp)，pTRV1/GV3101菌落PCR引物為V1-forward- GAGTCCGGTGAGACCGTTTT和V1-reverse-TTCTCAAATCCTGGTGGCGT(目的片段397 bp)。Fig.7 The colony PCR of pTRV2-VIGSics/GV3101,pTRV2/GV3101and pTRV1/GV3101 a. pTRV2-VIGSics/GV3101; b. pTRV2/GV3101; c. pTRV1/GV3101; M. DNA marker; 1-3. Samples Primers for pTRV2-ICS/GV3101 were HQICS-VIGS-F/HQICS-VIGS-R,primers for pTRV2/GV3101 were V2-forward-ACTACCAAGGCGAACACTGG,V2-reverse-GTTGACACACAAGAACCGCC ,the target is 610 bp; primers for pTRV1/GV3101 were 1-forward- TTCTCAAATCCTGGTGGCGT and V1-reverse-GAGTCCGGTGAGACCGTTTT,the target is 397 bp.

圖8 VIGS處理后黃芩ICS基因表達水平 NC.對照組(采用pTRV1/GV3101和pTRV2空載體/GV3101進行轉化)；NS.未經干旱處理的樣品組(采用pTRV1/GV3101和pTRV2-VIGSics/GV3101進行轉化)；DR.經干旱處理的樣品組(采用pTRV1/GV3101和pTRV2-VIGSics/GV3101進行轉化)a～c. P<0.05，n=8 下同。Fig.8 The relative expression level of ICS gene in S.baicalensis Georgi after VIGS treatment NC. Control(Which was transformated with pTRV1/GV3101 and pTRV2 empty vector/GV3101); NS.Under normal condition culture(Which was transformed with the mixture of pTRV1/GV3101 and pTRV2-VIGSics/GV3101); DR.Under high temperature culture(Which was transformed with the mixture of pTRV1/GV3101 and pTRV2-VIGSics/GV3101) a-c. P<0.05; n=8 The same as below.

圖9 VIGS沉默處理后黃芩ICS酶活性 ND.未檢測到活性Fig.9 The activity of ICS in S.baicalensis Georgi after VIGS treatment ND.None detected

圖10 ICS沉默對黃芩SA含量的影響 a，c. P<0.05；b. P<0.01，n=8Fig.10 SA content in S.baicalensis Georgi after VIGS treatment a，c. P<0.05；b. P<0.01，n=8

2.6 ICS沉默對SA含量的影響

ICS沉默后黃芩水楊酸含量降低。對照組SA含量為1.42 μg·g-1，NS組含量為0.63 μg·g-1，為對照組的44.4%，干旱脅迫處理后SA含量進一步降低為0.19 μg·g-1，是NC組的13.2%(圖10)。

3 討論

本實驗利用PCR克隆了黃芩ICS基因部分編碼序列，利用VIGS沉默載體pTRV2構建了ICS沉默載體pTRV2-VIGSics，通過pTRV2-VIGSics/GV3101和pTRV1/GV3101的共轉染實現了黃芩ICS基因的沉默，研究了ICS沉默后的表達水平、酶活性，以及ICS沉默對黃芩SA含量的影響，結果表明ICS沉默導致其表達水平及酶活性顯著降低，干旱處理使得二者略有恢復，但仍低于對照組。ICS沉默后SA含量亦明顯降低，而干旱脅迫處理使得SA含量進一步降低。這表明ICS基因對黃芩SA含量有著顯著影響，而干旱脅迫后SA含量的進一步降低反映了植物代謝調控系統的復雜性。

SA是植物的一種重要的信號分子物質，直接使用SA處理可調節植物某些次生代謝產物合成水平[16～17]，同時SA也可能是其它對植物次生代謝調控起著關鍵作用的小分子信號物質賴以發揮作用的介導物質[18]。ICS途徑是植物SA合成的途徑之一，利用VIGS特異性的抑制ICS基因表達使得煙草SA累積迅速降低[6]；在低光照條件下，當葛根SA的PAL合成途徑受到抑制后ICS酶活性顯著增高，且SA含量明顯高于對照組[19]；PAL突變體擬南芥在脅迫條件下SA含量為對照組的50%，而ICS突變體擬南芥sid-2的SA含量為對照組的4%[5,15]；這表明PAL途徑可能非SA合成的限速步驟[5]，而ICS對植物SA合成起著更加重要的調控作用。

中草藥次生代謝產生的一些天然產物是其主要藥效成分，這些代謝產物的累積水平受到一系列信號分子的調控，研究該調控過程的特點與機理，可為進一步明確次生代謝途徑中的關鍵調控點，進而調控其藥效物質代謝水平、提高中藥材品質提供理論支持。本研究選取我國傳統藥用植物黃芩為實驗材料，利用PCR克隆了其ICS基因部分編碼序列，采用病毒誘導的基因沉默技術對黃芩ICS基因進行了沉默，研究了ICS對SA合成的影響，為進一步深入研究SA對藥用植物有效成分的調控及ICS在該調控過程中的作用機制提供了一定依據。

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CloningthePartialCodingSequenceofICSGeneandtheInfluenceofICSGeneontheSAContentinScutellariabaicalensisGeorgi

SU Hu1,2ZHU You-Lin1*LI Rong2WU Chao2ZHANG Yun2

(1.Nanchang University,Nanchang 330031；2.Jiangxi Science and Technology Normal University,Nanchang 330031)

We cloned partial coding sequences of isochorismate synthase(ICS) gene inScutellariabaicalensisGeorgi, and constructed the virus induced gene silence(VIGS) vector, pTRV2-VIGSics.ICSgene was silenced by VIGS technique. We analyzed theICSactivity, expression level, and salicylic acid content of the silenced seedlings.ICSsilence resulted in the drastically reduction of the expression level, enzyme activity and salicylic acid content inS.baicalensisGeorgi. The enzyme activity was not detected, the expression level was reduced to 25%, and salicylic acid content was reduced to 44.4%. While, drought stress caused the expression level and enzyme activity recovered to 87% and 4.95%, respectively. Instead of recovery, the salicylic acid content was further reduced to 13.2% of the wild type level under drought stress.

ScutellariabaicalensisGeorgi;isochorismate synthase;salicylic acid;virus induced gene silence

國家自然科學基金項目(81102803)；江西省研究生創新基金項目(YC2014-B013)

蘇虎(1978—)，男，博士研究生，主要從事植物次生代謝研究。

* 通信作者：E-mail:ylzhu1999@aliyun.com

2015-10-23

Q946.82+8.3

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.03.016