適用于雙向電泳的楊樹葉片蛋白質提取方法的研究

嚴 冬 劉殿昆 司冬晶 鄭 密 趙曦陽 曲冠證 李 瑩

(東北林業大學林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040)

適用于雙向電泳的楊樹葉片蛋白質提取方法的研究

嚴 冬 劉殿昆 司冬晶 鄭 密 趙曦陽 曲冠證 李 瑩*

(東北林業大學林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040)

為了獲得分離效果好、清晰度高的楊樹葉片蛋白質雙向電泳圖像，本研究以小黑楊、毛果楊和84K楊葉片為材料，采用三氯乙酸—丙酮沉淀法、Tris-飽和酚法和Tris-三氯乙酸法提取楊樹葉片總蛋白質，分別采用聚丙烯酰胺凝膠電泳和雙向凝膠電泳對蛋白質進行分離，應用Image Master 2D Platinum 6.0軟件對這3種蛋白質提取方法得到的雙向電泳凝膠進行分析。結果表明：Tris-三氯乙酸法最適用于雙向電泳的楊樹葉片蛋白質的提取。利用Tris-三氯乙酸法提取蛋白質得到的鮮樣中總蛋白質平均含量為949.46 μg·g-1，得到的蛋白質點平均數量為567個，所得到的雙向電泳凝膠圖譜分離效果好、清晰度高。

楊樹葉片；Tris-三氯乙酸法，蛋白質提??；雙向凝膠電泳

雙向電泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)技術是蛋白質組學研究中分析和分離復雜蛋白質樣品最有效的手段之一[1]。近年來雙向電泳技術已經廣泛應用于不同植物組織器官中蛋白質的差異研究[2～3]、植物病理學研究[4]，以及植物對逆境反應的分子機理研究等[5～6]。目前關于不同材料的蛋白質樣品的制備研究已有很多報道[7～8]，較常見的全蛋白提取方法有尿素—硫脲提取法、Tris-HCl法、酚法、Tris-丙酮-酚法、Trizol沉淀法和TCA丙酮沉淀法等。植物葉片含有大量的多酚、色素、多糖等次生代謝物質，直接影響蛋白樣品制備的質量，從而導致雙向電泳分離效果不佳[9～10]，因此提取高質量且含量豐富的葉片全蛋白是研究植物葉片蛋白質組學的前提和基礎。

楊樹(Populus)是世界上廣泛栽培的重要造林樹種[11]，是林木研究的模式樹種[12～13]。楊樹基因組計劃的完成使其基因組學研究取得了不斷的進步[14～15]，而蛋白質作為生命活動的主要承擔者[16]，蛋白質組學研究也具有很高的價值。高質量蛋白質樣品的制備是進行蛋白質組學研究的前提，因此建立一種適用于楊樹葉片蛋白質提取的方法是進行楊樹蛋白質組學研究首要解決的問題。本研究以不同派別楊樹的3個無性系(小黑楊(PopulusX)、毛果楊(P.trichocarpaTorr.& Gray)和84K楊(銀腺楊，P.alba×P.glandulosa))為材料，利用三氯乙酸—丙酮沉淀法、Tris-飽和酚法及Tris-三氯乙酸法提取這3個無性系葉片的蛋白質，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和雙向電泳對蛋白質進行分析，比較3種蛋白質提取方法對楊樹葉片蛋白質的提取效果，并得到Tris-三氯乙酸法是適用于雙向電泳的楊樹葉片蛋白提取的最佳方法，該方法可獲得高含量高質量的葉片總蛋白質，可用于楊樹葉片蛋白質組學的研究并為其他木本植物葉片蛋白質樣品的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本實驗所用實驗材料是東北林業大學溫室扦插培養的小黑楊、毛果楊和84K楊，于扦插第3個月采集自莖尖起第3～5片葉片，葉片采摘下后立刻放入液氮速凍處理，放入-80℃冰箱保存。

1.2 楊樹葉片蛋白質樣品的制備

取3份1 g保存在-80℃冰箱的楊樹葉片，在預冷研缽中加入液氮研磨，以研磨到淺色粉末狀為最合適。

1.2.1 三氯乙酸—丙酮沉淀法

將粉末轉入到離心管中放在冰上，加入3倍體積預冷的丙酮溶液(10%三氯乙酸和0.07% β-巰基乙醇)，震蕩30 min，在-80℃冰箱保存1 h。將沉淀后的樣品放入低溫高速離心機，12 000 g，4℃，離心20 min，棄上清。將沉淀重懸于3倍體積預冷的丙酮溶液中(0.07% β-巰基乙醇)，顛倒混勻，在-20℃冰箱保存1 h。再將樣品放入低溫高速離心機，12 000 g，4℃，離心20 min，棄上清。將沉淀重懸于3倍體積預冷的丙酮溶液中(0.07% β-巰基乙醇)，顛倒混勻，在-20℃冰箱保存1 h。再將樣品放入低溫高速離心機，12 000 g，4℃，離心20 min，棄上清。將樣品真空干燥后，加入200 μL雙向電泳裂解液(7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，4% CHAPS，1%二硫蘇糖醇)充分溶解蛋白質。12 000 g，室溫下離心20 min，取上清，-80℃冰箱保存。

1.2.2 Tris-飽和酚法

將粉末轉入到離心管中放在冰上，加入3倍體積的蛋白質提取液(0.1 mol·L-1Tris-HCl(pH8.8)，10 mmol·L-1乙二胺四乙酸，0.4% β-巰基乙醇，0.9 mol·L-1蔗糖)震蕩10 min，加入等體積的Tris-飽和酚，冰浴震蕩30 min。再將樣品放入低溫高速離心機，12 000 g，4℃，離心20 min，取酚相(上層液)。余下的沉淀和液體再加入Tris-飽和酚，顛倒混勻。再將樣品放入低溫高速離心機離心20 min，取酚相，并將酚相收集到同一離心管中。向酚相中加入3倍體積的甲醇(0.1 mol·L-1的醋酸銨)溶液，充分混勻，在-20℃沉淀過夜。將樣品放入低溫高速離心機，12 000 g，4℃，離心20 min，棄上清，沉淀用甲醇溶液(0.1 mol·L-1的醋酸銨)洗滌并將樣品放入低溫高速離心機，12 000 g，4℃，離心20 min，棄上清，重復洗沉淀1～2次。將沉淀真空干燥，加入200 μL雙向電泳裂解液(7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，4% CHAPS，1%二硫蘇糖醇)充分溶解蛋白。12 000 g，室溫下離心20 min，取上清，-80℃冰箱保存。

1.2.3 Tris-三氯乙酸法

在預冷研缽中加入0.1 g pvp-40和葉片混合，液氮研磨葉片，將粉末轉入到離心管中放在冰上，并加入3倍體積預冷的丙酮溶液。將樣品放入低溫高速離心機，12 000 g，4℃，離心20 min，棄上清。沉淀中加入1 mL lysis buffer(50 mmol·L-1Tris-HCl(pH8.8)，2 mmol·L-1乙二胺四乙酸，10% Triton X-100，0.1% β-巰基乙醇)，超聲波破碎細胞后，再將樣品放入低溫高速離心機，12 000 g，4℃，離心20 min。蛋白質溶液中加入5倍體積預冷的丙酮溶液(10%三氯乙酸和0.07% β-巰基乙醇)，-80℃保存1 h。將樣品放入低溫高速離心機，12 000 g，4℃，離心20 min，棄上清。使用1 mL預冷的丙酮溶液(0.07% β-巰基乙醇)清洗沉淀，重復1次。將沉淀真空干燥后，使用200 μL雙向電泳裂解液(7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，4% CHAPS，1%二硫蘇糖醇)充分溶解蛋白。12 000 g，室溫下離心20 min，取上清，-80℃冰箱保存。

1.3 蛋白質含量測定

本實驗采用改良的Bradford法簡便快速測定出微量蛋白濃度[17]。

1.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳在Bio-rad Mini-PROTEAN Ⅱ(Bio-rad)上進行，電泳條件為：15 mA，30 min；30 mA至溴酚藍到達膠底部。采用銀染法對聚丙烯酰胺凝膠進行染色。將凝膠置入固定液(40%乙醇，10%冰乙酸)中，于水平搖床上固定30 min。除去固定液，加入致敏液(30%乙醇，0.2%硫代硫酸鈉，6.8%乙酸鈉，0.125%戊二醛)，致敏30 min。除去致敏液，用純水洗滌3次，每次10 min。除去溶液，加入銀染液(0.25%硝酸銀，0.015%甲醛)，染色20 min。除去銀染液，用純水洗滌2次，每次1 min。將膠轉入顯色液(2.5%碳酸鈉，0.0075%甲醛)中，待蛋白點顯色至清晰程度時即可除去顯色液加入終止液(14.6% EDTA-Na2·2H2O)。

1.5 雙向凝膠電泳

第一向等電點聚焦采用24 cm，pH3-10非線性的IPG膠條，上樣體積為450 μL。取300 μg蛋白質樣品加入水化槽中，放入膠條，在膠條上覆蓋2 mL礦物油，蓋上水化槽的蓋子并將水化槽放置于等電聚焦電泳儀中，進行等電聚焦。等電聚焦程序如表1所示，整個過程在20℃下進行。

表1等電聚焦程序

Table1Theprogramofisoelectricfocusingelectrophoresis

步驟Steps電壓Voltage(V)升壓模式Mode時間Time(h)Step150快速StepandHold15Step2500快速StepandHold5Step31000線性Gradient1Step48000線性Gradient3Step58000快速StepandHold3．75

等電聚焦結束后，將IPG膠條放入含有10 mg·mL-1DTT的平衡液(75 mmol·L-1Tris-HCl(pH8.8)，6 mol·L-1尿素，2%二硫蘇糖醇，30%丙三醇，0.002%溴酚藍)平衡30 min，將平衡好的IPG膠條放入含有25 mg·mL-1碘乙酰胺的平衡液中平衡30 min，將平衡好的IPG膠條轉移至14%的聚丙烯酰胺凝膠上，用1%瓊脂糖固定，進行第二向電泳分離。電泳條件：5 W，40 min；15 W至溴酚藍到達凝膠底部，采用銀染對電泳膠進行染色。

1.6 圖像掃描和分析

凝膠染色后，用GE ImageScanner Ⅲ掃描儀對凝膠進行圖像掃描，分辨率為300 dpi。用Image Master 2D Platinum 6.0軟件對圖像進行分析。選取母膠，去除背景，運行自動斑點檢測，得出最終的結果。

1.7 統計分析方法

利用SPSS(Statistical Program for Social Sciences)19.0[18]軟件對3種蛋白質提取方法提取的3種楊樹葉片蛋白質總量進行方差分析，線性模型為:

xij=μ+Ci+Bj+eij

(1)

式中，μ為總體平均值，Ci為樹種效應，Bj為方法效應，eij為環境誤差。

2 結果與分析

2.1 楊樹葉片蛋白質提取總量的分析

用三氯乙酸—丙酮沉淀法、Tris-飽和酚法、Tris-三氯乙酸法分別提取小黑楊、毛果楊和84K楊葉片蛋白質，利用Bradford法測定葉片蛋白質含量(表2)。通過對葉片蛋白質總量的計算表明三氯乙酸—丙酮沉淀法和Tris-三氯乙酸法提取的蛋白質總量高于Tris-飽和酚法。利用SPSS 19.0軟件對所得到的葉片蛋白質總量進行分析，結果表明，不同樹種間(F=41.78**)及不同蛋白質提取方法間(F=37.35**)蛋白質總量差異均達極顯著水平(P<0.01)。利用三氯乙酸—丙酮沉淀法和Tris-三氯乙酸法所提取小黑楊葉片蛋白質總量為Tris-飽和酚法的2倍。利用三氯乙酸—丙酮沉淀法所提取毛果楊葉片蛋白質總量為Tris-飽和酚法的3.5倍，利用Tris-三氯乙酸法所提取毛果楊葉片蛋白質總量為Tris-飽和酚法的2倍。利用三氯乙酸—丙酮沉淀法所提取84K楊葉片蛋白質總量為Tris-飽和酚法的1.9倍，利用Tris-三氯乙酸法所提取84K楊葉片蛋白質總量為Tris-飽和酚法的1.2倍。以上結果說明，三氯乙酸—丙酮沉淀法和Tris-三氯乙酸法能從等量的楊樹葉片中獲得的蛋白質總量更多，更適用于楊樹葉片蛋白質的提取。

表2 3種蛋白質提取方法提取的楊樹葉片蛋白質總量

圖1 3種蛋白質提取方法提取的楊樹葉片蛋白質總量Fig.1 The protein amount of three extracting methods

2.2 楊樹葉片蛋白質提取質量的分析

利用3種方法提取3種楊樹葉片蛋白質，經過聚丙烯酰胺凝膠電泳以及銀染染色，通過圖像掃描得到電泳圖譜。如圖2所示，Tris-三氯乙酸法提取所得到的3種楊樹葉片蛋白條帶豐富清晰，蛋白質主要分布在10～50 kD，50 kD以上的大分子量蛋白清晰分布。三氯乙酸—丙酮沉淀法提取的3種楊樹葉片蛋白均有降解，特別是大分子量蛋白。Tris-飽和酚法提取的小黑楊葉片蛋白質發生降解，同樣方法提取的毛果楊和84K楊蛋白條帶少，分子量分布不均勻?？傊?，Tris/三氯乙酸法所提取的楊樹葉片蛋白質質量最高，電泳圖蛋白條帶最清晰，蛋白質種類最豐富。因此，利用Tris/三氯乙酸法可以獲得更完整的楊樹葉片蛋白質，該方法最適用于雙向電泳的楊樹葉片蛋白質的提取。

圖2 3種蛋白質提取方法提取的楊樹葉片蛋白質的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖 1,4,7. TCA丙酮沉淀法；2,5,8. Tris-飽和酚法；3,6,9. Tris/三氯乙酸法Fig.2 The SDS-PAGE image of the proteins extracted by three extracting methods 1,4,7. TCA/Acetone precipitation; 2,5,8. Tris/saturated phenol; 3,6,9. Tris/TCA

2.3 楊樹葉片蛋白質的雙向電泳結果的分析

利用3種方法提取3種楊樹葉片蛋白質，經過IPG膠條等電聚焦后進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳以及銀染染色，通過圖像掃描得到電泳圖譜如圖3所示。由圖3可見，Tris-三氯乙酸法的背景比三氯乙酸—丙酮沉淀法和Tris-飽和酚法的背景淺，橫向縱向條紋少，得到的蛋白質點也多。通過Image Master 2D Platinum 6.0軟件對蛋白質電泳圖進行分析，得到了3種方法提取的蛋白質點的數量(表3)。在以小黑楊葉片為材料得到的電泳圖中，Tris-三氯乙酸法所得蛋白質點為三氯乙酸—丙酮沉淀法和Tris-飽和酚法的1.5倍。在以毛果楊葉片為材料得到的電泳圖中，Tris-三氯乙酸法所得蛋白質點為三氯乙酸—丙酮沉淀法的2.8倍，是Tris-飽和酚法的3.2倍。在以84K楊葉片為材料得到的電泳圖中，Tris-三氯乙酸法所得蛋白質點為三氯乙酸—丙酮沉淀法的2.4倍，是Tris-飽和酚法的1.9倍。Tris-三氯乙酸法所得的3種楊樹蛋白質的雙向電泳圖譜都非常清晰，分離效果好，且蛋白質點數量多。因此，Tris-三氯乙酸法最適用于楊樹葉片蛋白質的雙向電泳，能夠有效的對楊樹蛋白質組研究提供支持。

圖3 3種蛋白質提取方法提取的楊樹葉片蛋白質的雙向電泳圖 a～c.小黑楊；d～f.毛果楊；g～i. 84K楊 a,d,g. 三氯乙酸—丙酮沉淀法；b,e,h. Tris-飽和酚法；c,f,i. Tris-三氯乙酸法Fig.3 The 2-DE images of the proteins extracted by three extracting methods a-c.Populus X; d-f.P.trichocarpa Torr. & Gray; g-i.P.alba×P.glandulosa a,d,g. TCA/Acetone precipitation; b,e,h. Tris/saturated phenol; c,f,i. Tris/TCA

表33種蛋白質提取方法提取的楊樹葉片蛋白的雙向電泳圖蛋白質點的數量

Table3Thenumberofproteinspotsextractedbythreeextractingmethodsinthe2-DEimages

品種Varieties三氯乙酸—丙酮沉淀法TCA/AcetoneprecipitationmethodTris?飽和酚法Tris/saturatedphenolmethodTris?三氯乙酸法Tris/TCAmethod小黑楊PopulusX296297435毛果楊P．trichocarpaTorr．&Gray20618457384K楊P．Alba×P．glandulosa293360694

3 討論

植物蛋白質提取技術一直是植物蛋白質組學研究中需要解決的關鍵問題，不同的植物組織結構及成分不同，適用的蛋白質提取方法也不相同。本研究利用三氯乙酸法—丙酮沉淀法、Tris-飽和酚法和Tris-三氯乙酸法分別提取小黑楊、毛果楊和84K楊葉片總蛋白質，結果表明，不同方法提取的相同質量楊樹葉片的總量有很大差異，所得樣品的電泳結果差異很明顯。

三氯乙酸—丙酮沉淀法在動物、植物蛋白提取上有廣泛應用，是常用的植物葉片提取方法，但是難以清除樣品當中的酚類、醛類物質，使得電泳圖像上產生縱向條帶，從而掩蓋部分蛋白質點與條帶，導致電泳時蛋白點與條帶缺失較多[19]。在本實驗中，此方法耗時較長，提取的得到的蛋白質發生降解，并且在雙向電泳圖像上產生嚴重的橫向和縱向條帶，蛋白質分離效果差。Tris-飽和酚法的實驗步驟相對復雜，所得蛋白總量少，對葉片蛋白的提取效果差。Tris-三氯乙酸法法實驗步驟簡單，耗時較少，提取蛋白條帶豐富清晰，雙向電泳的蛋白質點數量最多也最清晰。

同時，相對于三氯乙酸法—丙酮沉淀法和Tris-飽和酚法，Tris-三氯乙酸法在研磨葉片時加入了pvp-40，其可以絡合多酚類物質，防止多酚類物質氧化成醌類物質，具有一定的抗氧化作用，也有報道認為pvp在去除多糖方面有一定功效[20～21]。之后應用了超聲波破碎的技術對樣品粉末進行了處理，使樣品粉末更加細致，使樣品可以與溶液更充分的接觸，從而提高了樣品的提取質量。在先前，Islam等人發現，提取成熟水稻葉片蛋白質時，使用超聲處理可以改善樣品質量和雙向電泳的分離效果[22]。該方法與趙相濤、袁坤等人使用的改良三氯乙酸法相比[23～24]，先使用了蛋白裂解液溶解蛋白，能更好的保護蛋白，防止蛋白損失。以上研究結果表明，Tris-三氯乙酸法可以有效去除干擾電泳效果的各類雜質，從而從相同質量的葉片樣品中提取出品質更優于其他兩種方法的蛋白質，是最適合楊樹葉片雙向電泳蛋白質提取的方法，可用于楊樹葉片蛋白質組學的研究并為其他木本植物葉片蛋白質樣品的制備提供參考。

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Fund program of science fund project of returned overseas of Heilongjiang(LC2013C09);Research Funds for the Central Universities(DL13BA09)

introduction：YAN Dong(1991—),male,Master,major in proteomics of poplar and tamarix chinensis.

date:2015-12-03

OptionalProteinExtractingMethodsofPoplarLeavesforTwo-dimensionalGelElectrophoresis

YAN Dong LIU Dian-Kun SI Dong-Jing ZHENG Mi ZHAO Xi-Yang QU Guan-Zheng LI Ying*

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding,Northeast Forestry University,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

In order to obtain the two-dimensional gel electrophoresis images with better separation and definition of poplar leaves, thePopulusX,P.trichocarpaTorr. & Gray andP.alba×P.glandulosawere selected to study the optional extracting methods of poplar leaves for two-dimensional gel electrophoresis by using TCA/acetone precipitation, Tris/saturated phenol and Tris/TCA method, respectively. The proteins of poplar leaves were separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and two-dimensional gel electrophoresis respectively and the images of two-dimensional gel electrophoresis were analyzed by Image Master 2D Platinum 6.0. Tris/TCA method was more appropriate for the protein extraction of poplar leaves for two-dimensional gel electrophoresis. The average protein content of the fresh sample extracted by Tris/TCA method was 949.46 μg·g-1and the average quantity of protein spots was 567 in the two-dimensional gel electrophoresis images which had better separation and definition.

poplar leaves;protein extraction;Tris/TCA method;two-dimensional gel electrophoresis

黑龍江省留學歸國科學基金項目(LC2013C09)；中央高?；究蒲袠I務費(DL13BA09)

嚴冬(1991—)，男，碩士研究生，主要從事楊樹、檉柳蛋白組學研究工作。

* 通信作者：E-mail:xlbtdl@163.com

2015-12-03

* Corresponding author：E-mail:xlbtdl@163.com

S792.11

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.03.022