ClassⅠ新城疫病毒BJ 1株微基因組的構建及功能鑒定

程晉龍，劉蒙蒙，胡楠，張國中

（1.中國農業大學動物醫學院，北京海淀100193；2.北京市畜牧總站，北京朝陽100107）

ClassⅠ新城疫病毒BJ 1株微基因組的構建及功能鑒定

程晉龍1，劉蒙蒙1，胡楠2，張國中1

（1.中國農業大學動物醫學院，北京海淀100193；2.北京市畜牧總站，北京朝陽100107）

將以綠色熒光蛋白（EGFP）為報告基因的ClassⅠ類新城疫病毒（NDV）BJ1株微基因組質粒pOK-M和3個輔助蛋白表達質粒pCI-NP、pCI-P、pCI-L共轉染BSR T7/5細胞，轉染24 h即可見到明顯的綠色熒光，表明微基因組及其3種輔助質粒均獲得了表達，并具有各自的生物學功能，為進一步建立該毒株的反向遺傳操作系統奠定了基礎。

新城疫病毒；ClassⅠ；微基因組；反向遺傳；輔助質粒

新城疫病毒（NDV）為副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒亞科（Paramyxovirinae）、禽腮腺炎病毒屬（Rubulavirus）成員，是禽Ⅰ型副黏病毒的代表株。病毒核酸為單股負鏈RNA，根據基因組長度NDV分為ClassⅠ和ClassⅡ兩類［1］，其中ClassⅠ型NDV基因組長15 198 nt［2］，廣泛存在于野鳥和家禽中，多為無致病性或致病性較弱的毒株；ClassⅡ類NDV基因組包括兩種長度：15 186 nt或15 192 nt［3］，其中既包括強毒株也包括弱毒株。因為雞群暴發的致死性新城疫通常是由ClassⅡNDV中的強毒株引起［4-5］，所以人們對ClassⅡNDV研究較早。ClassⅠ類NDV因其通常沒有致病性所以研究較少，但該類病毒在各種鳥類中廣泛存在。有研究表明，ClassⅠ類NDV在傳代過程中毒力有增強的可能性［6］，因此該類NDV對養禽業有潛在的威脅。

NDV的微基因組是包含了病毒全長基因組3′和5′末端UTR（非編碼區）序列，并用反向互補的EGFP（綠色熒光蛋白）替代其間的編碼區序列所構成的一種缺損病毒，因其需要輔助蛋白的幫助才能完成編碼區蛋白（EGFP）的表達，所以人們往往把其作為檢測輔助質粒的重要工具。本研究構建了ClassⅠ類NDV BJ1株的微基因組及其3種輔助質粒，并對他們的功能進行了驗證，為建立該毒株全基因組反向遺傳操作系統和開展功能基因組研究奠定了基礎。

1材料與方法

1.1毒株本研究所用ClassⅠNDV毒株系本實驗室于2014年從北京某活禽市場分離獲得，通過接種SPF雞胚進行病毒傳代。

1.2質粒和細胞真核表達載體pCI-neo，購自英濰捷基（上海）貿易有限公司；表達T7 RNA聚合酶的BSR T7/5細胞由本實驗室保存。含有增強型綠色熒光蛋白（EGFP）基因的質粒pEGFPN1，購自北京六合通經貿有限公司。

1.3分子生物學試劑M-MLV反轉錄酶、T4連接酶，購自Promega公司；dNTP，購自TaKaRa公司；Lipofectamine 2000、限制性內切酶以及TRIZol抽提試劑，購自Invitrogen公司；Plasmid Mini Kit，購自天根生化科技（北京）有限公司；DMEM細胞培養基，購自Gibco公司。

1.4微型基因組的構建微基因組包括4部分：T7啟動子和cDNA的3′UTR、EGFP、cDNA的5′UTR、核酶序列和T7終止子，分別命名為M1、M2、M3、M4。大小分別為211 bp、720 bp、121 bp和136 bp。設計引物（表1）PCR擴增得到4個目的片段，再使用融合PCR的方法得到完整的微基因組片段。用限制性內切酶EcoRⅠ和PstⅠ對微基因組和pOK進行酶切，電泳鑒定后進行膠回收純化，然后進行連接轉化，挑取菌落做菌液PCR鑒定，將陽性克隆送北京擎科新業生物技術有限公司測序鑒定，得到陽性質粒pOK-M。

表1用于擴增微基因組片段的引物

1.5輔助質粒的構建設計引物（表2）利用PCR方法獲得3種輔助蛋白NP、P、L的目的片段，用特定的限制性內切酶對目的片段和表達載體pCI-neo進行酶切，酶切后對目的片段進行膠回收純化，然后將相應的目的片段與載體進行連接轉化，挑取菌落做菌液PCR鑒定，將陽性克隆進行測序鑒定。其中對NP、P和pCI-neo載體用XholⅠ和EcoRⅠ進行酶切。由于L基因組較長，采用了分段克隆的方式進行拼接并轉移到pCI載體中。將得到陽性質粒分別命名為pCI-NP、pCI-P和 pCI-L。

1.6輔助質粒功能的鑒定采用Lipofectamine 2 000轉染試劑盒說明書方法，將pOK-M、pCINP、pCI-P和pCI-L 4種質粒共2 μg按照2∶2∶1∶1轉染培養于6孔板的BSR T7/5細胞，設置缺少pCI-L轉染的陰性對照，37℃下作用5 h，更換含有10%胎牛血清的DMEM。37℃、5%CO2條件下繼續培養24 h，在熒光顯微鏡下觀察報告基因的表達情況。

表2用于擴增NP、P、L的引物

2結果

2.1微型基因組的構建NDV的微基因組分為四部分，其中M1片段包括EcoRⅠ酶切位點、T7啟動子和cDNA的3′UTR，M2為反向互補的EGFP，M3為cDNA的5′UTR，M4包含核酶序列、T7終止子和PstⅠ酶切位點，M為上述4個片段經融合PCR后的產物，PCR產物經膠回收測序比對后，序列正確，PCR擴增結果如圖1所示。

圖1微基因組4部分及融合PCR產物的電泳鑒定

2.2輔助質粒的構建PCR擴增得到的NP、P、L1、L2、L3基因片段大小分別為1.5 kb、1.2 kb、1.5 kb、2.2 kb和2.8 kb，PCR產物膠回收后測序，與原測序結果比對，序列正確，無突變，電泳鑒定結果如圖2所示。采用常規連接轉化的方法克隆到pCI-neo載體中，經測序鑒定后得到3種輔助質粒，命名為pCI-NP、pCI-P、pCI-L。

圖2NP、P和L基因PCR產物的電泳鑒定

2.3輔助質粒功能的鑒定pOK-M、pCI-NP、pCIP和pCI-L 4種質粒共轉染BSR T7/5細胞24 h后，通過倒置熒光顯微鏡觀察，在轉染的細胞中可觀察到明顯的特異性綠色熒光（圖3A），表明報告基因EGFP得到表達，說明輔助質粒的表達產物具有功能活性，可以啟動微基因組的復制和轉錄。而在陰性對照組中未觀察到熒光（圖3B）。

圖3轉染BSR T7/5細胞24 h后特異性熒光的觀察結果

3討論

ClassⅠ型NDV毒株多是弱毒株或無致病性的毒株，主要存在于野生鳥或水禽中。近年來，在我國大陸、香港、臺灣等活禽市場中均能分離到ClassⅠ型NDV毒株，而Yu等的研究證明，某些ClassⅠ型弱毒株在雞體內經過傳代會發生毒力增強的現象［7］，可能造成ND的流行。由于該類病毒在各種鳥類中廣泛存在，不同毒株混合感染還可能會造成不同毒株的重組，使得ND的防治變得更加復雜。

反向遺傳技術已經成為NDV研究不可或缺的技術平臺，也被稱為“病毒拯救”［7］。NDV的拯救首先要構建3種輔助質粒，分別為表達NP、P、L蛋白的質粒，這3種質粒對NDV的復制、轉錄起著重要作用，而微基因組一般作為檢測輔助質粒生物活性的工具。本研究通過PCR技術擴增出NP、P、L基因，并分別成功克隆到pCI-neo載體上，經測序鑒定，擴增的目的片段序列正確。其中L片段分3段進行克隆。為了檢測這3種輔助質粒的活性，本研究又構建了NDV的微基因組。NDV的微基因組是包含了病毒全長基因組3′和5′末端UTR（非編碼區）序列，并用反向互補的EGFP（綠色熒光蛋白）替代其間的編碼區序列所構成的一種缺損病毒，需要輔助蛋白的幫助才能完成編碼區蛋白（EGFP）的表達。因此，微基因組中EGFP的表達可以說明構建的輔助質粒具有表達活性。

本研究利用構建的微基因組質粒pOK-M對構建的3個輔助質?；钚赃M行鑒定。結果表明，共轉染的BSR T7/5細胞中可觀察到特異性熒光，說明3個輔助質粒均有表達活性，為進一步建立該病毒的反向遺傳操作平臺奠定了基礎。

［1］Czegledi A，Ujvari D，Somogyi E，et al.Third genome size category of avian paramyxovirus serotype 1（Newcastle disease virus）and evolutionary implications［J］.Virus Res，2006，120：36-48.

［2］Locke D P，Sellers H S，Crawford J M，et al.Newcastle disease virus phosphoprotein gene analysis and transcriptional editing in avian cells［J］.Virus Res，2000，69：55-68.

［3］Krishnamurthy S，Samal S K.Nucleotide sequences of the trailer: nucleocapsid protein gene and intergenic regions of NDV strain Beaudette C and completion of the entire genome sequence［J］.J GenVirol，1998，79：2419-2424.

［4］Ganar K，Das M，Sinha S，et al.Newcastle disease virus:current status and our understanding［J］.Virus Res，2014，184：71-81.

［5］Alexander D J，Wilson G W C，Russell P H，et al.Newcastle disease outbreaks in fowl in Great Britain during 1984［J］.Vet Rec，1985，117：429-434.

［6］Shengqing Y，Kishida N，Ito H，et al.Generation of velogenic Newcastle disease viruses from a nonpathogenic waterfowl isolate by passaging in chickens［J］.Virology，2002，301（2）：206-211.

［7］趙長光，宋松林，趙繼勛，等.新城疫病毒反向遺傳技術研究進展［J］.中國獸醫雜志，2011，47（10）：56-59.

Construction and Identification of Mini-genomeof ClassⅠNewcastleDiseaseVirus Strain BJ 1

CHENG Jin-long1，LIU Meng-meng1，HU Nan2，ZHANG Guo-zhong1
（1.College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China；2.Beijing Animal Husbandry Station，Beijing 100107，China）

To examine the efficiency of the mini-genome rescue system，BSR-T7/5 cells were co-transfected with pOK-M，pCI-NP，pCI-P，pCI-L.The results showed that the green fluorescence was observed in the co-transfected group，but there was no green fluorescence in the control groups in 24 h.The result indicated that the NP，P and L proteins were all expressed.In conclusion，we established a mini-genome system that could be applied to the recovery of NDV BJ1 strain.

NDV；ClassⅠ；Mini-genome；Reverse genetics；Helper plasmids

ZHANG Guo-zhong

S852.65+9.5

A

0529-6005（2016）08-0009-03

2015-05-05

現代農業產業技術體系北京市家禽創新團隊專項資金（CARS-PSTP）

程晉龍（1993-），男，本科生，就讀于預防獸醫學專業，E-mail：15611528256@163.com

張國中，E-mail：zhanggz@cau.edu.cn