核桃青皮多酚氧化酶的酶學特性*

楊衛民，杜京旗，趙君

(呂梁學院 生命科學系，山西　呂梁 033001)

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核桃青皮多酚氧化酶的酶學特性*

楊衛民，杜京旗，趙君

(呂梁學院 生命科學系，山西呂梁 033001)

以呂梁本地的“中林1號”核桃青皮為材料，采用比色法對影響核桃青皮多酚氧化酶(PPO)活性的因素，如底物、溫度、pH以及激活和抑制作用開展了研究。結果表明，以鄰苯二酚為底物，在其濃度0.05mol/L、溫度20℃、pH6.0下，波長294nm處核桃青皮PPO活性最高；濃度0.5mol/L的MgCl2對PPO激活作用最強，酶活力為32.2U/min；CuSO4次之，為19.1U/min；乙醇的激活作用也很強，6%乙醇酶活力為27.5U/min；蘆丁、Na2SO3和L-半胱氨酸(L-Cys)對PPO活性有較強的抑制作用，且隨濃度的增加其抑制率越來越明顯。

核桃青皮；多酚氧化酶；酶促動力；激活劑；抑制劑

多酚氧化酶(EC1.14.18.1,PPO)是由核基因編碼的銅金屬酶，廣泛存在于植物體的根、莖、葉、花、果實和種子中[1]。在生物和非生物脅迫下，植物細胞中的PPO活性被激活，催化多酚類物質氧化成醌類，醌自聚且與氨基酸生成黑色或褐色色素沉淀。其結果是在增加機體對病原體抗性的同時，導致了果蔬等經濟作物營養丟失和經濟損失[2～3]。

核桃(JuglansregiaL.)青皮含有豐富的多酚類、萘醌類、多糖類等化合物[4]。正常情況下，PPO定位于核桃青皮葉綠體的類囊體和其它質體的基質中，呈無活性狀態，而其酚類底物存在于液泡中，彼此被分隔包裹。而在生物和非生物脅迫下，尤其是當核桃受到外力損傷和凍害時，隨組織中細胞亞結構的破壞，PPO被激活且與其底物發生反應，將單酚羥化為雙酚，再氧化雙酚為醌及衍生物。醌自動集合且與細胞內一些氨基酸基團(如-SH，-NH2)發生反應，產生黑色和褐色物質沉淀，導致組織發生褐變[5]，造成了核桃產量與品質的下降。這是長期影響我國北方地區核桃產業發展的一個重要因素。對于核桃多酚氧化酶研究，主要是利用核桃青皮酶促褐變的原理，研發植物源生物農藥和染發劑等[6～9]。而關于核桃青皮多酚氧化酶的酶學特性未見報道。本文通過研究核桃青皮的PPO的酶學特性，以及對其的激活和抑制作用，不但可以了解核桃果實發生褐變的機制，還可以為核桃青皮產業化再利用提供技術支持。

1　材料與方法

1.1材料采集

核桃青皮于2015年9月25日采集于呂梁本地，樹齡為7年，為中林1號品種。

1.2方法

1.2.1核桃青皮中PPO的提取

將新鮮的青核桃洗凈、晾干后手工剝皮，快速剪碎青皮后加保鮮膜置于冰箱中冷藏，備用。

準確稱取核桃青皮3g，置于研缽中，加12mL預冷的超純水冰浴研磨至勻漿狀。在冰凍條件下，將勻漿物進行超聲波細胞破碎(變幅桿Ф6、超聲時間3s、間隔1s、破碎總時間10min)，于12 000r/min下冷凍離心20min，溫度4℃，重復3次，定容至100mL，獲得PPO粗酶液，4℃保存備用。

1.2.2核桃青皮PPO酶促反應產物的光譜特性測定

參照文獻[10]，略有改動。反應體系中pH為6.0，25℃下保溫6min，波峰掃描為250～700nm。

1.2.3溫度、pH和底物濃度對核桃青皮PPO活

性的影響

參照文獻[10]，略有改動。

(1)溫度對核桃青皮PPO活性的影響反應體系，pH為6.0，在10、25、30、35℃下保溫6min。

(2)pH對核桃青皮PPO活性的影響設置pH為4.8、5.2、5.6、6.0、6.4、6.8、7.2磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液體系，在反應體系20℃下保溫6min。

(3)底物濃度對核桃青皮PPO活性的影響加0.02mol/L、0.03mol/L、0.04mol/L、0.05mol/L、0.06mol/L、0.07mol/L、0.09mol/L的鄰苯二酚溶液2.0mL，在反應體系pH為6.0，20℃下保溫6min。

1.2.4激活劑和抑制劑對核桃青皮PPO活性的影響

配制不同濃度的激活劑如MgCl2、CuSO4、乙醇和抑制劑如Na2SO3、蘆丁、L-Cys(MgCl2、CuSO4、Na2SO3濃度均為0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L、0.6mol/L；乙醇濃度為2%、4%、6%、8%、10%；蘆丁濃度為2mol/L、3mol/L、4mol/L、6mol/L、8mol/L、10mol/L；L-Cys濃度為0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L)。

反應體系參照文獻[10]。分別加入不同濃度的激活劑或抑制劑lmL，搖勻，20℃下保溫6min，以不加激活劑或抑制劑為對照組，檢測其吸光度，并計算酶活性。

1.3統計與計算

核桃青皮PPO活性單位的表達與計算參照文獻[10]進行。

2　結果與分析

2.1核桃青皮PPO酶促反應產物的光譜特性確定

由鄰苯二酚、檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH6.0)和粗酶液組成的反應體系，在250～700nm范圍內進行了波峰掃描，結果見圖1。

圖1　核桃青皮PPO紫外掃描圖Fig.1　The uv scan of PPO in walnut green husk

從圖1可以看出，光譜掃描圖中只有一個明顯的波峰，無其它雜質干擾。其最大吸收波峰為294nm，吸光值為1.429；1min后再檢測其結果為，吸光值為1.448，OD值之差為0.019，此時PPO活力為28.5U/min。

圖2　溫度對PPO活性的影響Fig.2　The influence of temperature on PPO activity

PPO的底物種類較多，包括鄰苯二酚、愈創木酚、兒茶酚、綠原酸等，不同來源的PPO對不同底物的催化效果有較大的差異，其產物光吸收峰值也差異明顯[11]。

2.2溫度對核桃青皮PPO活性的影響

由圖2可知，溫度對核桃青皮PPO活性的影響差異很大，PPO最適溫度區域為15～25℃，在溫度為20℃時，酶活力最高，為9.1U/min。當溫度在10～20℃范圍內時，隨溫度升高，酶活力隨之增大，酶活性增強；當溫度超過20℃時，隨著溫度的升高，酶活力逐漸降低。

溫度對酶活性的影響很大，不同的酶最適溫度范圍也不同[12]。PPO蛋白具有一般蛋白質的特性，對溫度很敏感，即使在較低溫度(15℃)下也沒有影響酶分子和底物結合以及酶活力；溫度高于20℃后酶活力下降的原因是溫度使得酶的活性部位構象開始發生了變化，與蛋白質變性有關?？梢?，核桃青皮PPO是一種對溫度特別敏感的酶。

圖3　pH對PPO活性的影響Fig.3　The influence of pH on PPO activity

2.3pH對核桃青皮PPO活性的影響

從圖3可以看出，不同pH值對核桃青皮中PPO活力的影響差異很大。PPO最適pH值區域為5.2～6.5，最適pH值為6.0，此時酶活力最大，為49.6U/min。高于或低于pH6.0時酶活力都會下降。

PPO是含銅的酶蛋白，其活性對pH值有嚴格的要求，過酸或偏堿時酶活性都會降低[13]。一般當pH處于4.8～6.5范圍內，蛋白酶逐漸達到其等電點。在偏酸性的環境中，PPO活力增強，活性也逐漸增大。

2.4底物對核桃青皮PPO活性的影響

PPO對底物有嚴格的要求，不同濃度下酶活性差異很大[11～12]。

圖4　底物濃度對PPO活性的影響Fig.4　The influence of substrate on PPO activity

由圖4可知，在不同濃度的鄰苯二酚下，核桃青皮PPO活力差異很大。當鄰苯二酚濃度為0.03～0.07mol/L時PPO活力水平較高，0.05mol/L時PPO酶活力最高，為18U/min。當濃度大于0.05mol/L時，PPO活力隨著底物濃度的增加而下降，酶活性也隨之降低。

較高濃度的底物不但未增加酶活力，反而抑制了酶促反應的進行。其原因可能是與植物褐變組織中PPO自殺性失活和酶促褐變兩種作用維持著平衡有關。即高濃度的鄰苯二酚與PPO的輔基可能發生絡合，改變PPO活性中心的構象，使反應向不利于底物與酶結合的方向進行[14～15]。

綜上所述，核桃青皮PPO活性與其底物濃度、pH值和溫度大小密切相關，可通過控制酶促反應條件，尤其是底物濃度來防止酶促褐變的發生。反之，為了保證酶促反應的進行，生產中除控制溫度和pH值大小外，可適量增加酶用量，或減少底物濃度以防止底物與PPO的輔基可能發生的絡合。

2.5激活劑對核桃青皮PPO活性的影響

2.5.1CuSO4對核桃青皮PPO活性的影響

由圖5可知，CuSO4濃度對核桃青皮PPO活性的影響比較復雜。當CuSO4濃度為0.1～0.2mol/L時，PPO活力隨其濃度增加而減弱，PPO呈現抑制狀態；濃度為0.2～0.5mol/L時PPO活力快速增強，PPO呈現激活狀態；濃度為0.5mol/L時PPO活力達最大值，為19.1U/min，此時酶活性最強；濃度大于0.5mol/L時PPO活力開始下降，PPO活力又被強烈抑制。

圖5　CuSO4對PPO活性的影響Fig.5　The influence of CuSO4 on PPO activity

PPO是含銅的蛋白質體，金屬(鐵、銅、錫、鋁等)離子是PPO的激活劑，一定濃度的Cu2+對PPO活性有激活效果[16]。Fe3+、Fe2+、Cu2+不僅能和酚類化合物反應形成褐色物質，而且能催化還原酮類的氧化[17]。

2.5.2MgCl2對核桃青皮PPO活性的影響

由圖6可知，MgCl2濃度對核桃青皮PPO活性的影響很大。在其濃度為0.1～0.5mol/L時，核桃青皮PPO活力隨著MgCl2濃度的增加而升高，表現為激活作用；當其濃度為0.5mol/L時酶活力最大，為32.2U/min，此時激活作用也最強；當MgCl2濃度大于0.5mol/L時，PPO活力會隨MgCl2濃度增加而降低，PPO活力逐漸減弱。

圖6　MgCl2對PPO活性的影響Fig.6　The influence of MgCl2 on activity of PPO

MgCl2的存在會穩固PPO結構中Cu2+的2個配位鍵，使PPO酶活性增強[10]。

2.5.3乙醇對核桃青皮PPO活性的影響

由圖7可知，乙醇對核桃青皮PPO活性的影響效果顯著，隨乙醇濃度的增加PPO活力呈現先升高后降低的趨勢，且激活效果顯著。當乙醇濃度為2%～6%時，PPO活力先緩慢升高后急劇增強，濃度為6%時PPO活力達到最高，為27.5U/min，此時激活作用也最強；而在濃度為6%～10%時，PPO活力則急速下降，其中，乙醇濃度為6%～8%時降幅最大，濃度為10%時PPO活力降到最低，為1.7U/min，此時PPO完全處于失活狀態。

圖7　乙醇對PPO活性的影響Fig.7　The influence of ethanol on PPO activity

對PPO而言乙醇也是一種激活劑[17]。同樣具備與MgCl2、CuSO4相同的作用。乙醇是帶有一個羥基的飽和一元醇，具有還原性。過量的乙醇有可能將PPO中的Cu2+還原成為磚紅色Cu2O的沉淀，抑制了PPO活性。

一定濃度的CuSO4、MgCl2和乙醇等3種激活劑，會穩固PPO分子結構中Cu2+的兩個配位鍵，使PPO呈活性狀態，有激活PPO分子活性的作用。

2.6抑制劑對核桃青皮PPO活性的影響

2.6.1蘆丁對核桃青皮PPO活性的影響

由圖8可知，蘆丁對核桃青皮PPO活性有明顯的抑制作用，且隨蘆丁濃度的增加PPO活力呈現快速下降的趨勢。當蘆丁濃度為0.2～0.3mol/L時，PPO活力下降幅度最為明顯，分別為37.4U/min和27.2U/min，濃度在0.3～0.8mol/L范圍內對PPO活力的抑制作用緩慢降低，當其濃度為0.8mol/L時PPO活力最低，為10.2U/min，此時活性也隨之喪失。

黃酮類b環上的羥基的數目和相互位置是其抑制的決定因素，羥基越多抑制一般越強，羥基鄰位比間位更利于抑制作用[18～19]。蘆丁是黃酮類化合物，具有較強的抗氧化能力。蘆丁與酶結合會導致酶活性中心向不利于與底物結合的方向變化，從而降低了酶與底物結合的幾率以及產物生成，導致酶活性降低[20]。

圖8　蘆丁對PPO活性的影響Fig.8　The influence of rutin on PPO activity

2.6.2Na2SO3對核桃青皮PPO活性的影響

由圖9可知，Na2SO3對核桃青皮PPO活力有明顯的抑制作用，且隨濃度的增加PPO活力呈現快速下降的趨勢。當Na2SO3濃度在0.1～0.4mol/L范圍內時，PPO活力幾乎呈直線下降，分別為17U/min、10.2U/min、5.1U/min、1.7U/min，此階段酶活性快速喪失，抑制效果顯著；Na2SO3濃度為0.4～0.6mol/L范圍內時，酶活力最低，為1.7U/min，此階段抑制效果也最好。

圖9　Na2SO3對PPO活性的影響Fig.9　The influence of Na2SO3 on PPO activity

Na2SO3還原性極強，可直接作用于酶本身，降低對單酚和二酚類的催化反應活性，還可與醌類物質發生不可逆的結合，形成無色物質[21]。Na2SO3也會穩固PPO結構中Cu2+的兩個配位鍵，使之難以斷裂。同時，Na2SO3與酶蛋白發生鍵連，修飾了蛋白質結構[22]。

2.6.3L-Cys對核桃青皮PPO活性的影響

由圖10可知，L-Cys對核桃青皮中PPO有明顯的抑制作用，且隨其濃度的增加PPO活力呈現快速下降的趨勢。L-Cys濃度大于0.3～0.4mol/L時，PPO酶活力分別為5.1U/min和3.4U/min，降幅由快變慢逐漸趨于平緩，PPO活力也處于最低狀態。

圖10　L-Cys對PPO活性的影響Fig.10　The influence of L-Cys on PPO activity

L-Cys可以與醌類化合物生成無色和穩定的化合物，防止醌類化合物結合與氨基酸結合，從而阻止其組織發生褐變[23]。L-Cys又是醌的還原劑，可還原醌成酚[24]。L-Cys中的SH基團可去除PPO活性中心的銅，或取代與活性中心的銅緊密配合的組氨酸殘基[25]?；蛲ㄟ^與PPO的活性部位發生共價結合對活性中心進行結構性修飾，從而使酶活性下降[26]。

L-Cys、蘆丁、Na2SO3等3種抑制劑的作用機制是加快了PPO分子結構中Cu2+配位鍵的斷裂，使PPO處于無活性狀態。

3　結論與討論

核桃酶促褐變的發生需要滿足酶、底物和以氧為氫受體等條件?？刂破渲械娜我庖粋€因素或幾個因素便能夠達到控制酶促褐變的發生。在核桃采摘及加工過程中，嚴格控制PPO活性是防止酶促褐變的重要手段。但在基于核桃青皮生物農藥、藥物中間體和染發劑的研究中，可通過提高PPO活性、控制底物濃度、溫度和增加氧含量來促進酶促褐變的發生。

PPO酶促反應的底物為多酚類物質，常見的底物有兒茶素、綠原酸、苯酚和愈創木酚等[27]。以鄰苯二酚為底物，在濃度0.05mol/L，最適溫度20℃，最適pH6.0下，在294nm處檢測到核桃青皮PPO活力最高。

金屬(鐵、銅、錫、鋁等)離子是多酚氧化酶的激活劑[28]。它們可通過使底物與酶活性部位直接結合，或通過可逆的改變金屬離子的氧化態調節氧化還原反應，或通過靜電穩定或屏蔽負電荷等途徑參加酶的催化反應。其中，Fe3+、Fe2+、Cu2+能促進褐變的主要原因是鐵和銅不僅能催化還原酮類的氧化，還能和酚類化合物反應形成褐色物質，具有雙重效果。朱顯峰等[29]、薛超彬等[30]認為Cu2+能激活菜青蟲(Pierisrapae)中PPO和漆酶的活性，GUO Li等[31]、馬曉春等[32]、段玉權等[33]和Jimenz等[34]認為Mg2+對荔枝(Litchichinensis)、綠豆(Vignaradiata)和葡萄(Vitisvinifera)中的PPO有激活作用。研究發現；MgCl2和CuSO4對核桃青皮PPO激活作用較強，相同的濃度下，MgCl2對核桃青皮PPO激活作用高于CuSO4；乙醇對核桃青皮PPO激活作用較強，6%乙醇激活作用最強，為27.5U/min。

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Enzyme Properties of Polyphenol Oxidase in Green Husks of Walnut(Juglans regia L.)

YANG Wei-min,DU Jing-qi,ZHAO Jun

(Department of life science,Lüliang University,lüliang Shanxi 033001,P.R.China)

By taking the green husk from Walnut Zhonglin 1 as the materials,and based on color-comparison approach,the influence factors of polyphenol oxidase(PPO)activity such as substrate,temperature,pH,and activating and inhibitory were studied.The results showed that catechol as substrate with the concentration of 0.05mol/L,temperature of 20℃,pH of 6.0,the PPO activity in green husk of walnut was strongest at 294nm.The effect of 0.5mol/LMgCl2on PPO activation,32.2 U/min,was the strongest,and CuSO4was second with 19.1U /min.The effect of ethanol on enzyme activity was also strong,27.5 U/min under 6% ethanol.The rutin,Na2SO3and L-cysteine (L-Cys) have strong inhibition on PPO activity,and its inhibition rate increased as concentration increasing.

Green husks of walnut; polyphenol oxidase; enzyme kinetics; activator; inhibitor

10.16473/j.cnki.xblykx1972.2016.05.003

2015-10-23

呂梁學院自然科學校內基金(ZRXN201411)。

楊衛民(1960-)，男，教授，主要從事植物資源開發與利用研究。E-mail yangweimin0318@ sina.com

Q 946.5；TQ 28

A

1672-8246(2016)05-0012-07