青藏高原阿旺綿羊線粒體基因組研究

王富強，楊孝樸

（1.甘肅農業大學動物醫學院，蘭州730070；2.中農威特生物科技股份有限公司，蘭州730046）

青藏高原阿旺綿羊線粒體基因組研究

王富強1，2，楊孝樸1

（1.甘肅農業大學動物醫學院，蘭州730070；2.中農威特生物科技股份有限公司，蘭州730046）

利用重測序方法對青藏高原阿旺綿羊線粒體基因組進行測序、組裝，并對基因特點和系統發育進行分析。結果表明：阿旺綿羊線粒體基因組全長16 618 bp，該基因由13個蛋白編碼基因、22個轉運RNA基因、2個核糖體RNA基因和1個非編碼控制區組成；基因特點顯示堿基A含量33.69%、T含量27.40%、C含量25.82%、G含量13.09%，A+T含量（61.09%）比G+C含量（38.91%）高，表現出一定的堿基偏好，轉換多于顛換，表現較高的轉換偏向；基于線粒體基因組構建了31個不同物種的NJ樹，表明阿旺綿羊與綿羊屬親緣關系最近，與牛屬和巖羊屬親緣關系最遠。

阿旺綿羊；基因組；線粒體；系統進化

阿旺綿羊是在青藏高原惡劣氣候和特殊生境條件下，經過長期自然選擇、閉鎖繁育，特別是近十多年的定向系統選育而形成的高原獨特綿羊品種類群。主要分布于青藏高原東南部的唐古拉橫斷山脈北段（即西藏自治區昌都地區貢覺縣境內及周邊地區），目前存欄總數15.08萬只［1］。

高等動物線粒體是共價閉合的環狀雙鏈DNA分子，具有較高的突變率和母系遺傳特征，特別適合種內、種間及種以上分類階元的進化研究［2］。鞏元芳等［3］用mtDNA基因研究了幾個地方綿羊品種線粒體多態性，表明我國地方綿羊品種的起源可能是單一的。管松等［4］研究了中國西南地區5個地方綿羊群體mtDNA遺傳多樣性，得出西藏綿羊有3個母系來源，云南綿羊有2個母系來源。因此，mtDNA基因可以作為一種遺傳標記，用來研究綿羊的起源進化以及親緣關系。本研究以阿旺綿羊為素材，測定了其線粒體基因序列，并進行對比分析，以期為阿旺綿羊品種的起源分化及遺傳親緣關系研究提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料

阿旺綿羊血液采自西藏藏族自治區昌都地區貢覺縣阿旺鎮阿依第三村（N：30°12′101″、E：98°63′98″），所采血樣為6 mL，ACD抗凝，-20℃凍存。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取基因組總DNA的提取按照天根生物有限公司動物組織DNA提取試劑盒說明書操作。

1.2.2引物設計與線粒體DNA基因片段的擴增用DNAMAN進行比對，查出保守序列，利用primer 5設計引物，根據目的基因、pGM-T載體的特點，設計兩端含有限制性內切酶EcoRⅠ酶切位點的引物。

PCR擴增反應體系：阿旺綿羊DNA樣品1 μL（75 ng/μL），10×Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L的dNTP 2 μL， 25 mmol/L MgCl21 μL，正向引物和反向引物（10 μmol/L）各為1 μL，TaqDNA聚合酶0.3 μL（5 U/μL），加滅菌雙蒸水至25 μL。未加DNA樣品為陰性對照。反應程序：94℃，2 min預變性；94℃、60 s，44℃、60 s，72℃、90 s，35個循環；最后72℃延伸5 min。擴增產物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效率。

1.2.3純化與測序用北京百泰克生物技術有限公司回收試劑盒進行純化與回收，將mtDNA的PCR純化產物與pGM-T連接并轉化感受態DH5a，進行藍白斑鑒定，篩選陽性克隆，并命名為PGM-T-mtDNA。對陽性克隆進行PCR和EcoR I酶切鑒定，對鑒定正確的質粒送由上海生工進行測序。

1.2.4序列分析和系統發育樹的構建運用ClustalX軟件將測得序列進行比對，輔以人工校正。利用MEGA5.1軟件對阿旺綿羊mtDNA基因序列進行種內和種間差異評估［5-6］，用鄰接（Neighbour-Joining，NJ）法構建系統發育樹，系統發育樹各分支的置信度由1 000次自舉法（Bootstrap）檢驗。

2　結果與分析

2.1mtDNA的組成及其變異特點

阿旺綿羊線粒體基因組的組成和注釋詳見表1和圖1所示。阿旺綿羊線粒體基因組全長16 618 bp，該基因由13個蛋白編碼基因、22個轉運RNA基因、2個核糖體RNA基因和1個非編碼控制區組成；基因特點顯示堿基A含量33.69%、T含量27.40%、C含量25.82%、G含量13.09%，阿旺綿羊線粒體基因組的組成和其他哺乳動物的組成是相似的［7-8］。A+T含量（61.09%）比G+C含量（38.91%）高，表現出一定的堿基偏好，轉換多于顛換，表現較高的轉換偏向。13個蛋白編碼基因全長11 402 bp，占整個線粒體基因組全長的68.61%；阿旺綿羊與大多數哺乳動物一樣，線粒體基因組的編碼除了ND6和8個轉運RNA基因是從輕鏈開始編碼之外，其余都是從重鏈開始編碼的；13個蛋白編碼基因的起始密碼子除了ND2、ND3和ND5是ATA之外，其余的起始密碼子都是ATG； 5個蛋白編碼基因（ND1，ND2，COX3，ND3，ND4）的終止密碼子是一個不完整的終止密碼子T（aa），然而細胞色素b基因（Cytb）的終止密碼子由AGA變為TAA，其余7個蛋白編碼基因的終止密碼子是典型的TAA。線粒體基因組控制區（D-Loop）位于tRNA-Phe和tRNA-Pro之間，全長1 181 bp（從15 438 bp到16 618 bp），12S rRNA基因的全長959 bp（從69 bp到1 027 bp），16S rRNA基因的全長1 575 bp（從1 095 bp到2 669 bp）；22 tRNA基因的長度在60 bp到75 bp之間變化。

表1　阿旺綿羊線粒體基因組注釋

續表1

圖1　阿旺綿羊線粒體基因組注釋

2.2阿旺綿羊系統發育樹的構建

利用本實驗測定的阿旺綿羊線粒體基因組序列以及從GenBank數據庫下載的30個不同物種的線粒體基因組序列（登錄號見圖2），通過MEGA 5.1軟件基于Kimura兩參數距離采用鄰位相接法（NJ）（見圖2），構建31個不同品種的系統發育樹。結果表明，阿旺綿羊與綿羊屬親緣關系最近，與牛屬和巖羊屬親緣關系最遠，與其他的研究結果是一致的［9-11］。

圖2　基于線粒體基因組序列構建的31個不同物種的NJ樹

3　結論

本研究對阿旺綿羊線粒體基因組進行克隆測序，對其基因組成和序列變異特點進行注釋和分析，初步構建了31個不同物種的系統進化樹，研究結果表明，阿旺綿羊屬于一個獨立的地方綿羊品種，為了解綿羊線粒體基因組的遺傳特點和綿羊品種的起源、分化及親緣關系提供了理論依據。

［1］ 陳天寶，熊朝瑞，駱佳銳，等.阿旺綿羊種質特性研究［J］.中國草食動物，2011，31（1）：68-70.

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［3］鞏元芳，李祥龍，劉錚鑄，等.幾個地方綿羊品種線粒體DNA（mtDNA）細胞色素b基因多態性研究［J］.中國獸醫學報，2006，26（2）：213-215.

［4］ 管松，何曉紅，浦亞斌.中國西南地區5個地方綿羊群體mtDNA遺傳多樣性及系統進化研究［J］.畜牧獸醫學報，2007，38（3）：219-224.

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［11］ZhongT，Han J L，Guo J，et al.Genetic diversity of Chinese indigenous sheep breeds inferred from microsatellite markers［J］.Small Ruminant Research，2010，90：88-94.

Study and Analysis on Complete Mitochondrial Genome Sequence of Awang Sheep of the Qinghai-Tibetan Plateau

WangFuqiang1，2，YangXiaopu1
（1.College ofVeterinaryMedicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.China Agricultural Veterinarian BiologyScience and TechnologyCo.Ltd，Lanzhou 730046，China）

Awangsheep is a very important local breed of the Qinghai-Tibetan plateau in China.In this experiment，the complete mitochondrial genome sequence of Awang Tibetan sheep were studied for the first time，the results showed that the total length of the mitogenome was 16 618 bp，consisting of 13 protein-coding genes，22 transfer RNA（tRNA）genes，two ribosomal RNA（rRNA）genes，and a non-coding control region（D-loop region）.As in other mammals，its most mitochondrial genes were encoded on the heavystrand.Its overall base composition was A：33.69%，T：27.40%，C：25.82%，and G：13.09%，A+T（61.09%）was higher than G+C（38.91%）.The phylogenetic relationship indicated that the Awang sheep was close with the Ovis aries.

Awangsheep；genome；mitochondrion；phylogenetic

S826.2

A

2095-3887（2016）01-0001-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.01.001

2015-10-20

王富強（1981－），男，實驗師，碩士。

楊孝樸（1962－），男，教授，碩士生導師，主要從事生物化學和分子生物學的教學及研究工作。