水稻離體葉片抗紋枯病接種方法的研究

馬晨燕，袁正杰，楊海河，曲海艷，何海燕，張 玉，瞿紹洪，*

(1.浙江師范大學 化學與生命科學學院， 浙江 金華 321004； 2.浙江省農業科學院 病毒學與生物技術研究所，浙江 杭州 310021)

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水稻離體葉片抗紋枯病接種方法的研究

馬晨燕1，2，袁正杰2，楊海河1，2，曲海艷1，2，何海燕2，張 玉2，瞿紹洪2，*

(1.浙江師范大學 化學與生命科學學院， 浙江 金華 321004； 2.浙江省農業科學院 病毒學與生物技術研究所，浙江 杭州 310021)

水稻紋枯病是影響水稻生產的重要病害之一。水稻紋枯病抗性屬于數量遺傳性狀，目前尚未發現高抗或免疫的水稻種質材料。為了提高水稻抗紋枯病種質的篩選和研究效率，對水稻離體葉片抗紋枯病接種的實驗條件進行了更精確的控制，并采用了量化的病情調查方法。取紋枯菌接種離體水稻葉片組織進行qRT-PCR分析，水稻病程相關基因呈誘導表達，驗證了紋枯病菌對水稻的侵染。采用離體葉片接種、大田成株期接種、苗期“微室”接種法，對抗紋枯病水稻品種和敏感品種進行測試?？剐云贩N和敏感品種紋枯病病級的統計檢驗呈顯著差異，3種方法的結果表現一致。改進的離體葉片接種方法具有易于操作和重復性好的優點，適用于大規模篩選抗紋枯病水稻種質材料。

水稻；紋枯??；Rhizoctoniasolani；離體葉片法；病程相關基因

水稻紋枯病是水稻的重要病害之一[1-2]，其病原物為立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)，屬于寄主范圍較廣的半腐生性真菌，一般在高溫高濕的環境條件下侵染分蘗期水稻，由靠近水面的葉鞘開始侵染和擴展，也可以危害葉片、莖稈甚至稻穗，引起結實率下降，嚴重的導致植株枯死[3-4]。水稻紋枯病分布于大部分水稻種植區，可以造成高達50%以上的產量損失[3]。隨著矮稈品種推廣、氮肥用量增加以及氣候變化等，水稻紋枯病的危害逐漸加重，成為水稻穩產和高產的嚴重障礙[1]。

水稻對紋枯病的抗性屬于典型的數量性狀[5]。迄今為止，還沒有發現高抗或免疫的主基因抗病水稻材料，開展紋枯病抗病遺傳育種研究難度較大[2]。水稻紋枯病接種和抗性評價方法是篩選抗紋枯病遺傳資源和培育抗病品種的重要前提。水稻紋枯病大田成株期接種方法可靠性和重復性較好，但是田間鑒定的環境可控性差，受季節限制，試驗周期較長[2]。水稻紋枯病苗期接種具有實驗規模小、發病環境可控、鑒定周期短等優點，然而對接種稻苗進行病情調查的時間點不易把握，不同品種的生長勢差異等都會影響鑒定結果[2]。Prasad等[6]建立的離體葉片法，具有取材方便、操作快速簡便等優點，可以滿足大規模水稻材料抗紋枯病鑒定的需求。該方法將水稻離體葉片的正面緊貼濕濾紙，背面接種帶紋枯病菌菌絲的馬鈴薯PDA瓊脂塊，72 h后目測病斑范圍和評定病級。為了提高離體葉片接種方法的穩定性和準確性，本研究利用含有苯并咪唑保鮮劑的水瓊脂培養基代替濕濾紙，舍棄紋枯病病級評定的目測調查方式，改用病斑面積積分換算方法，計算水稻葉片的相對病斑面積，從而將發病程度進行量化，取得了較好的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

供試水稻材料為紋枯病抗性品種YSBR1[7]、感病品種Lemont[7]和泰粳394[8]。供試紋枯病菌系為YN-7和MH12，由揚州大學潘學彪教授惠贈。

1.2 水稻離體葉片紋枯病接種

1.2.1 水稻種植

將YSBR1、Lemont和泰粳394的種子封裝于羊皮紙袋中進行浸種發芽，發芽第6天挑選長勢基本一致的稻芽點播于育秧田中，25 d后將生長良好的秧苗移栽大田。在水稻分蘗時期(大約移栽后30 d)，選取葉色濃綠、無病蟲害、生長健壯的分蘗，剪取完全展開的倒1葉或倒2葉，進行紋枯菌接種。

1.2.2 紋枯菌培養

用無菌手術刀將帶有紋枯菌菌絲的瓊脂塊切成0.4～0.5 cm小塊，接種到含0.005%四環素(wt·voL)和20 mL馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養基的平板上，封口膜封口，倒置放在28 ℃培養箱中，活化培養2～3 d，培養基表面長滿白色菌絲后拿出。將來自活化培養的菌塊接種到新的PDA培養基，相同條件下進行擴大培養。

1.2.3 紋枯病菌接種

剪取葉片中間4～5 cm長的部分，平鋪于含有苯并咪唑(0.000 1 g·mL-1)的水瓊脂培養基(0.005 g·mL-1agar)上。葉片正面緊貼培養基表面。在含紋枯菌的培養皿相同半徑處，用表面滅菌的打孔器取直徑7 mm帶菌絲的PDA瓊脂塊(圖1-A)，將菌塊置于離體葉片中間部位，帶菌絲的一面緊貼葉片背軸面(圖1-B)。封口膜封口，置28 ℃培養。每個含有水瓊脂的培養皿作為1個接種重復，其中，每個水稻品種取1個離體葉片組織，接種1個帶菌瓊脂塊。用無菌瓊脂塊接種相同水稻材料，作為對照。

1.2.4 水稻離體葉片接種后病情調查及統計

接種紋枯病菌后72 h，利用數字掃描儀，將同一培養皿中不同水稻品種的離體葉片同時進行掃描。利用Photoshop軟件，對掃描照片上的病斑面積進行像素換算，計算相對病斑面積(relative lesion area， RLA)，即單位葉面積的病斑面積，作為衡量病害嚴重程度的評價指標[9]。RLA的計算公式為：RLA=病斑面積/葉片面積=病斑區域像素/葉片區域像素[9]。通過Tukey法進行品種間病級的多重比較，確定不同品種的紋枯病抗性。

A，紋枯菌生長3 d的PDA培養基(左)，掏空圓形部分的菌塊已切出，供紋枯病接種(右)；B，接種紋枯病菌的水稻離體葉片A， Potato dextrose agar (PDA) medium with R. solani growing for 3 d (left)， PDA discs carrying R. solani were excised for inoculation (right); B， Detached rice leaves inoculated with R. solani圖1 利用水稻離體葉片進行抗紋枯病接種鑒定Fig.1 Inoculation of the sheath blight pathogen (R. solani) to rice using detached-leaf method

1.2.5 接種紋枯病菌水稻材料的取樣

在接種24和48 h，于無菌操作臺中打開培養皿，分別從YN-7菌株和無菌對照的水稻材料取樣。剪取以瓊脂塊為中心的菌絲擴展區域(葉片徑向約2 cm長)，5～6塊葉組織混合，迅速置于液氮冷凍，然后于-80 ℃保存備用。

1.2.6 水稻RNA提取及RT-PCR鑒定

用TRIzol試劑(Invitrogen， USA)提取水稻RNA[10]。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量，用NanoDrop紫外—可見光分光光度計(NanoDrop 8000 UV-Vis Spectrophotometer)檢測RNA濃度和純度。RNA反轉錄采用PrimeScriptTM RT reagent Kit試劑盒(TaKaRa公司)并按說明書進行操作。以反轉錄的cDNA為模板，利用水稻病程相關基因的特異引物(表1)進行實時定量RT-PCR分析。設置3次重復，采用SYBR Premix ExTaqⅡ(2x)實時定量試劑盒(TaKaRa公司)的反應體系，以EF-1α為內參基因，采用2-⊿⊿Ct法進行RT-PCR數據分析。

表1 水稻病程相關基因的RT-PCR引物

Table 1 Primers for RT-PCR analysis of rice pathogenesis-related genes

基因名稱Genesymbol基因號GeneID引物Primer(5’-3’)參考文獻ReferencesOsPR1bOs01g28450F:GCGTCTTCATCACATGCAACTAR:ACCTGAAACAGAAAGAAACAGAGG[8][11]OsPR3Os06g51060F:GGCGTTCTGGTTCTGGATGACR:CGCCGTTGATGATGTTGGTC[11]PBZ1Os12g36880F:CAAATTCTCGTGGCGTTTGAGTCR:CGGCAGCATTCACAATGATTTTC[8][11]E2F-relatedproteinOs03g13050F:ACGTCACGCACGTTCATTAGCAR:GACCGAATAAATGGCTGCTGGT[8]Pleiotropicdrugresistanceprotein(PDR)Os01g42370F:TGGTGGAGATGGTACTGCTGGAR:ATGATGGCAAAGCCAAAGAGGA[8]EF-1αOs03g08020F:CCACGGGCCATCTGATCTACR:AGTCAATGATGAGCACGGCA[12]

1.3 水稻大田成株期紋枯病接種鑒定

2014年4—10月在揚州大學進行水稻品種YSBR1、Lemont和泰粳394的大田成株期紋枯病接種試驗。水稻種子于5月3～7日發芽，5月9日播種。秧苗于6月9日移栽大田，每個小區栽插3行，每行12個單株。每個品種種植3次重復，隨機區組設計。在水稻分蘗末期(7月27～29日)，取小區第2行(即中間行)的10個植株，每株取3個分蘗，采用嵌入法[13-14]接種紋枯病菌系YN-7。在抽穗后30 d(10月9～12日)，采用Rush等[15]提出的0～9級病情評價體系，評定個體病級，具體方法參照相關文獻[8，14]。

1.4 水稻苗期紋枯病接種鑒定

采用本實驗室優化的紋枯病“微室”接種法[8]，進行水稻苗期抗紋枯病接種鑒定。接種后7～9 d，測量水稻植株病斑高度和葉枕高度，計算單株病級，利用DPS生物統計軟件進行病級數據的方差分析。通過Tukey法進行品種間病級的多重比較。

2 結果與分析

2.1 水稻離體葉片紋枯病菌接種的病級分析

為了檢測水稻品種YSBR1、Lemont、泰粳394對紋枯病菌的抗感程度，剪取分蘗期的水稻植株生理狀態一致的葉片組織，背面朝上緊貼在水瓊脂上，分別接種含有紋枯病菌株YN-7和MH12的PDA瓊脂塊，于28 ℃恒溫箱中培養。在接種第3天時觀察，不同品種的葉片出現面積大小不等的紋枯病病斑(圖2-A，B)。YSBR1葉片大部分保持青綠色，病斑面積較??；Lemont和泰粳394的葉色發黃，病斑蔓延葉片2/3以上。

利用數字掃描儀，對接種3 d的離體葉片進行掃描。用Photoshop軟件將掃描照片上的病斑面積進行像素換算，計算相對病斑面積(RLA)，然后對YSBR1、Lemont和泰粳394的RLA數據進行方差分析(表2)。在YN-7菌株和MH12菌株的接種試驗中，YSBR1和泰粳394的RLA均呈顯著差異(P<0.05)，YSBR1表現抗病，泰粳394感病。Lemont的離體葉片材料，用以上2個菌株進行了6次接種試驗，除了用MH12菌株接種的第3次試驗，在其他5次試驗中，Lemont和YSBR1的RLA數據均表現顯著差異(P<0.05)。

紋枯病菌株YN-7(A)和MH12(B)侵染水稻品種YSBR1、Lemont、泰粳394離體葉片第3天Leaf tissues of rice cultivars YSBR1， Lemont， and Taijing 394 infected with R. solani strains YN-7 (A) and MH12 (B) for 3 days圖2 水稻離體葉片接種紋枯病菌的病斑掃描Fig.2 Digital scanning of the sheath blight lesions on detached rice leaves infected with R. solani

表2 紋枯菌侵染水稻離體葉片相對病斑面積的統計分析

Table 2 Statistical analysis of the relative lesion area of detached rice leaves infected withR.solani

試驗/菌株Exp./Strain水稻品種Cultivar接種重復Inoculationrepeat12345678910平均Average第1次/YN-7YSBR10.100.120.170.070.070.060.070.010.010.010.069bLemont0.950.270.610.020.530.130.190.400.460.280.384a泰粳3940.270.290.310.370.280.120.300.350.170.190.265a第1次/MH12YSBR10.040.000.040.010.080.000.070.040.100.000.038bLemont0.290.350.560.520.100.240.140.540.170.280.319a泰粳3940.170.170.110.210.570.360.440.700.230.170.313a第2次/YN-7YSBR10.020.140.010.160.670.040.030.290.190.020.157bLemont0.820.270.560.320.560.400.440.290.600.890.515a泰粳3940.360.400.250.670.670.520.220.600.490.190.437a第2次/MH12YSBR10.240.030.000.060.010.170.000.130.150.000.079bLemont0.210.660.890.710.900.380.410.080.380.030.465a泰粳3940.320.260.250.330.170.390.560.610.420.490.380a第3次/YN-7YSBR10.070.060.500.530.020.360.120.080.060.150.195bLemont0.350.680.380.020.010.730.760.520.790.500.474a泰粳3940.750.490.210.720.490.470.640.680.450.840.574a第3次/MH12YSBR10.150.020.350.110.030.020.050.590.080.010.141bLemont0.510.800.390.120.090.120.230.540.420.160.338ab泰粳3940.110.430.150.730.740.710.620.330.590.770.518a

分別用紋枯病菌株YN-7和MH12對每個水稻品種接種3次，每次10個重復(10皿)；掃描紋枯病病斑，通過積分換算方法，計算相對病斑面積。對3個水稻品種的平均相對病斑面積進行方差分析和多重比較，同列數據后無相同小寫字母表明品種平均相對病斑面積具有顯著差異(P<0.05)。

R.solanistrains YN-7 and MH12 were inoculated to each rice cultivar for three times (10 repeats each time). The sheath blight lesions were scanned electronically. The relative lesion area was calculated using the integration method. The average lesion areas of the cultivars were analyzed by ANOVA and multiple comparisons. The average lesion areas labeled with different letters showed significant difference (P<0.05).

在以上離體葉片的接種試驗中，感病品種Lemont和泰粳394的相對病斑面積均無顯著差異(P>0.05)。

2.2 離體葉片接種后水稻病程相關基因的qRT-PCR分析

受到病原菌侵染的植物會啟動一系列復雜高效的保護機制，包括病程相關基因的激活，以抵抗病原菌的侵襲[16]。在接種24和48 h，取紋枯病菌株YN-7侵染和無菌對照的離體葉片材料，對其中水稻病程相關基因OsPR1b[8，11]、OsPR3[11]、PBZ1[8，11]、轉錄因子E2F[8]以及PDR[8]進行實時定量RT-PCR分析。比較接種處理和無菌對照的基因相對表達量，結果表明，以上5個基因在YSBR1和Lemont的24或48 h接種材料中均表現表達上調(接種處理的基因相對表達量顯著或極顯著高于對照的相應表達量，圖3)。OsPR1b、PBZ1和PDR在YSBR1中相對表達量的峰值高于Lemont中的相應峰值。YSBR1中E2F相對表達量的峰值則低于Lemont的相應峰值。OsPR3在YSBR1和Lemont中的表達水平相差不大。根據上述結果，離體葉片材料中水稻病程相關基因呈典型誘導表達，說明紋枯病菌已侵染水稻葉片組織。

2.3 供試水稻品種田間成株期和苗期“微室”法接種驗證

對YSBR1、Lemont和泰粳394進行了大田成株期紋枯病接種試驗。根據Rush等[15]的0～9級病情評價體系，YSBR1、Lemont和泰粳394的平均病級分別為2.85(抗病)、7.60(感病)、4.31(中等感病)，相互之間呈顯著差異(表3)。此外，根據水稻苗期“微室”接種試驗結果，YSBR1、Lemont和泰粳394的苗期平均病級分別為2.98(抗病)、7.65(感病)和6.19(感病)，相互呈顯著差異(表4)。因此，上述結果驗證了抗病和感病品種YSBR1和Lemont之間，以及YSBR1和泰粳394之間的紋枯病病級差異。

Y和L分別表示水稻品種YSBR1和Lemont；24 hpi和48 hpi分別表示接種紋枯病菌之后24和48 h的取樣材料；24h和48h表示未接種水稻材料，作為對照。*和**分別表示處理組與對照組基因相對表達量存在顯著差異(P<0.05)和極顯著差異(P<0.01)Y， the rice cultivar YSBR1; L， the cultivar Lemont; 24 hpi and 48 hpi represent the rice samples at the time points of 24 and 48 hours post inoculation (hpi) of R. solani， respectively; 24h and 48h， the uninoculated rice samples at the 24 hpi and 48 hpi， as negative controls. * and ** indicate significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01)， respectively圖3 離體水稻葉片接種紋枯病菌后病程相關基因的表達量變化Fig.3 Changes of the relative expression levels of rice pathogenesis-related genes in the R.solani-infected detached rice leaves

3 討論

本研究對Prasad等[6]建立的水稻離體葉片紋枯病接種方法進行了改進，對接種條件進行更精確的控制，并采用了量化的病情調查方法。在2個紋枯病菌株的6次重復接種試驗中，有5次試驗取得了抗病和感病品種的相對病斑面積表現顯著差異的結果。大田接種試驗以及苗期“微室”接種試驗進一步驗證了上述結果。改進的離體葉片接種方法具有快速簡便和易于重復的優點，適用于大規模水稻種質材料抗紋枯病性狀的篩選。

根據水稻離體葉片病程相關基因的RT-PCR分析結果，在紋枯病接種條件下，OsPR1b、OsPR3、PBZ1、E2F和PDR呈典型的誘導表達，分每個水稻植株接種3個分蘗，計算分蘗的紋枯病平均病級，作為水稻單株病級。對3個水稻品種的單株病級進行方差分析，平均病級后無相同小寫字母的品種的紋枯病病級具有顯著差異(P<0.05)。下同。

表3 水稻大田成株期紋枯病接種的病級

Table 3 The sheath blight scores of rice adult plants inoculated withR.solanion field

品種Cultivar大田水稻植株的紋枯病病級Sheathblightscoreofriceplantsonfield植株數Plantnum-ber平均病級AverageYSBR12.003.003.003.002.004.003.001.003.003.00202.85c4.003.003.003.002.003.003.003.003.003.00泰粳3944.004.504.004.003.504.504.004.004.004.00474.31b5.004.004.005.004.003.504.004.004.003.504.504.004.004.004.004.504.004.004.004.004.504.004.506.006.005.005.005.004.004.003.005.005.004.005.005.005.00Lemont9.007.009.009.009.007.009.009.009.009.00207.60a9.009.009.006.008.005.005.005.005.005.00

Three tillers of each rice plant were inoculated withR.solani. The disease score of a single plant were rated by calculating the average of the scores of tillers.The disease scores of three rice cultivars were analyzed by ANOVA. The average scores labeled without the same lower letters showed significant difference (P<0.05). The same as the table below.

表4 水稻苗期紋枯病菌“微室”接種的病級

Table 4 The sheath blight scores of rice seedlings inoculated withR.solaniusing micro-chamber method

品種Cultivar苗期水稻植株“微室”接種的紋枯病病級Sheathblightscoreofriceplantsinoculationwiththemicro-chambermethods植株數Plantnumber平均病級AverageYSBR12.062.893.002.274.492.183.323.602.212.342.385.03122.98c泰粳3947.146.024.486.425.179.006.495.606.319.008.257.08246.19b4.763.269.004.996.544.533.308.072.946.934.399.00Lemont7.889.007.548.259.008.249.005.423.848.268.606.72127.65a

每個微室接種4～5個水稻幼苗，作為1次接種重復，然后計算全部植株的平均病級。

For a single experimental repeat， 4-5 rice seedlings were inoculated withR.solaniin a micro-chamber， and the average disease score of the plants was calculated.

別與徐國娟等[8]和Wang等[11]的結果一致。并且，抗病品種OsPR1b、PBZ1和PDR誘導表達的水平顯著高于感病品種。Wang等[11]對抗紋枯病的OsWRKY4過表達轉基因水稻和未轉化品種進行RT-PCR分析，OsPR1b和PBZ1在紋枯病菌侵染條件下呈誘導表達，并且抗病株系誘導表達的峰值顯著高于未轉化感病品種。因此，水稻病程相關基因表達量的變化，驗證了紋枯病菌對水稻離體葉片組織的侵染。這種在精確控制的環境條件下檢測水稻基因表達的實驗體系，可以運用于水稻和紋枯病菌分子互作的研究。

本研究對水稻離體葉片抗紋枯病接種方法、大田成株期以及苗期接種方法進行了比較。在抗病品種和感病品種的差異顯著性方面，3種方法取得了一致的試驗結果。對于抗感差異較小的中感品種和感病品種，離體葉片接種的相對病斑面積差異性不顯著。因此，在水稻抗紋枯病種質篩選過程中，建議利用離體葉片方法快速簡便的優勢，先用該方法篩選抗性水平較高的水稻材料，再結合其他接種方法，對篩選材料進行驗證，從而滿足大規模水稻抗性種質資源篩選的需求。

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(責任編輯 侯春曉)

Studies on the detached-leaf inoculation method for determination of rice resistance to sheath blight (Rhizoctoniasolani)

MA Chen-yan1，2，YUAN Zheng-jie2，YANG Hai-he1，2，QU Hai-yan1，2，HE Hai-yan2，ZHANG Yu2，QU Shao-hong2，*

(1.CollegeofChemistryandLifeSciences，ZhejiangNormalUniversity，Jinhua321004，China; 2.InstituteofVirologyandBiotechnology，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China)

Rice sheath blight (Rhizoctoniasolani) is one of the important diseases causing large loss to rice production. Rice resistance toR.solanibelongs to quantitative genetic trait. Rice germplasm with high resistance or immunity to sheath blight has not yet been identified. In order to improve the efficiency of screening and characterizing sheath blight-resistant rice germplasm， we made precise control of the experimental conditions for the detached-leaf inoculation method， and developed a quantitative protocol for the evaluation of disease severity. The detached leaf tissues inoculated withR.solaniwere subjected to quantitative reverse-transcription qRT-PCR analysis. The induced expression of rice pathogenesis-related genes verified the infection of the pathogen into rice. A sheath blight-resistant rice cultivar and a sensitive cultivar were tested using the detached-leaf method， the field inoculation method and the micro-chamber inoculation method， respectively. The three methods showed similar results， and disease scores of the resistant and sensitive cultivars were significantly different based on statistical tests. Taken together， the improved detached-leaf inoculation method had the advantages of easy operation and good repeatability， and could be used for large-scale screening of sheath blight-resistant rice germplasm.

rice (Oryzasativa); sheath blight;Rhizoctoniasolani; detached-leaf inoculation; pathogenesis-related gene

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.10.15

2016-03-15

轉基因生物新品種培育重大專項(2012ZX08009001)；浙江省農業科學院科技創新能力提升工程項目(2015CX07)；浙江省農業科學院省部共建國家重點實驗室培育基地開放基金(2010DS700124-KF1210，2010DS700124-KF1406)

馬晨燕(1988—)，女，山東菏澤人，碩士研究生，主要從事水稻生物技術研究。E-mail: mcy1025181205@163.com

*通信作者，瞿紹洪，E-mail: squ@mail.zaas.ac.cn

S511；S41-30

A

1004-1524(2016)10-1730-08

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(10): 1730-1737

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