魚腥藻PCC7120染色體基因對asr0757/alr0758的表達優化及其鑒定

陳 潔， 陳思禮， 吳匯蘭

(中南民族大學 生命科學學院， 武漢 430074)

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魚腥藻PCC7120染色體基因對asr0757/alr0758的表達優化及其鑒定

陳 潔， 陳思禮*， 吳匯蘭

(中南民族大學 生命科學學院， 武漢 430074)

NCBI預測魚腥藻PCC7120染色體上的基因對asr0757/alr0758可能構成一個毒素-抗毒素系統.為研究其是否屬于毒素-抗毒素系統家族，分別構建這兩個基因的表達載體.用1.0 mM IPTG誘導重組菌表達，優化表達條件，并對表達出的蛋白進行純化與western blot檢測.SDS-PAGE結果顯示：asr0757與alr0758在37℃下誘導6 h后，均成功誘導表達出目的蛋白asr0757(13.5 KD)和alr0758(17.9 KD).抗毒素表達量較好，毒素alr0758表達量較少.通過設置誘導時間梯度和IPTG濃度梯度優化毒素基因表達條件，優化結果顯示：毒素基因alr0758在28℃，IPTG濃度為0.4 mM，誘導10 h時有最大表達量.蛋白純化與western blot結果證實誘導表達的蛋白為目的蛋白．

魚腥藻PCC7120；asr0757/alr0758； 表達； 優化； 鑒定

藍藻是一種存在于不同的環境中的古老而又多變的原核生物[1]，這種能存在于不同環境中的特性反映了其對多變與極端環境的強大適應能力[2].魚腥藻PCC7120作為藍藻中的模式生物，其基因組測序工作于2001年由日本Kazusa研究所最早完成[3].當前，對于藍藻的分子生物學研究主要集中在基因克隆，表達及功能鑒定與表達調控分析等方面[4]．

有研究表明魚腥藻染色體上存在大量毒素-抗毒素系統(TAS，toxin-antitoxin system)[5]，TAS的存在有利于魚腥藻更好地適應環境脅迫.TAS由位于同一個操縱子下的具有多個堿基重疊的兩個基因組成，一個編碼穩定的毒素蛋白，另一個編碼不穩定的抗毒素蛋白[6].當前對毒素-抗毒素系統的功能的看法各異，Engelberg-Kulka等[7]通過實驗證明TAS在外界壓力條件下介導細胞程序性死亡，Gerdes等[8]通過對TAS系統在環境脅迫下抑制細胞生長的研究，提出了“生長調節模型”．

目前絕大多數細菌染色體上預測出的TAS基因對尚未經過實驗驗證，asr0757/alr0758是其中之一.本實驗是首次對其進行系統的表達，并對其表達條件進行優化，通過蛋白純化與western blot鑒定表達產物.具體而言，首先通過分子生物學方法成功地分別構建基因對asr0757與alr0758的表達載體，其后使用IPTG的誘導表達出帶有組氨酸標簽的目的蛋白，最后優化誘導表達條件，并對蛋白進行純化以及western blot鑒定.本實驗所構建的生物化學與分子生物學實驗方法，為魚腥藻染色體上潛在TAS基因的研究提供參考，創造較好的研究條件，同時對于完善 TAS系統理論，補充發展其分子機制具有一定的意義．

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗所用藻種，魚腥藻PCC7120(Anabaenasp. PCC7120)購自中國科學院水生物研究所淡水藻種庫(FACHB).宿主菌E.coilDH5α 和E.coilBL21(DE3)為本實驗是保存的菌種.克隆載體pMD18-T購自Takara公司.表達載體pET30a(+)為本實驗室保存.PCR引物合成及測序由南京金斯瑞生物科技有限公司負責.一抗TubaiB Rabbit ployAb(兔源抗His-Tag抗體)；二抗，Goat anti-Rabbit IgG(辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG)購自proteintech公司．

1.2 實驗方法

1.2 .1PCC7120 基因組 DNA 提取 本實驗藍藻PCC7120基因組的提取方法請參照文獻[9]．

1.2 .2克隆載體pMD18-T-asr0757 和 pMD18-T-alr0758構建 基因的克隆按照分子生物學操作標準方法進行[10]，設計引物并在引物中添加酶切位點，以魚腥藻PCC7120的DNA為模板，運用Touch-Down PCR擴增得到asr0757目的基因片段和alr0758目的基因片段，PCR引物見表1.PCR反應程序如下：94℃預變性4 min；94℃變性1 min，退火溫度由74℃開始每循環降低0.5℃，退火反應40 s后于72℃延伸40 s，15個循環；94℃變性1 min，退火溫度由74℃開始每循環降低1.0℃，退火反應40 s后于72℃延伸40 s，20 個循環；72℃保持7 min.PCR產物純化后與pMD18-T連接并導入E.coilDH5α中，涂平板藍白斑篩選，陽性克隆經過菌落PCR以及雙酶切鑒定后送測序.測序正確后保存質粒，分別命名為 pMD18-T-asr0757和pMD18-T-alr0758．

表1 PCR引物及序列

注：下劃線為括號內對應限制性內切酶識別的酶切位點序列．

1.2 .3重組表達載體 pET-30a-asr0757，pET-30a-alr0758的構建BamH1和EcoR1雙酶切測序正確的質粒pMD18-T-asr0757、pMD18-T-alr0758以及表達載體pET-30a(+)，回收各自雙酶切目的片段，回收的基因片段asr0757與alr0758分別與經過相同雙酶切的pET-30a(+)連接，轉化E.coilBL21(DE3)，涂于含有50 μg/mL 硫酸卡納霉素的LB 平板篩選陽性克隆，經菌落PCR、質粒雙酶切及測序檢測正確后分別命名為pET-30a-asr0757與pET-30a-alr0758．

1.2 .4目的基因asr0757，alr0758的誘導表達 重組質粒 pET-30a-asr0757與pET-30a-alr0758的BL21菌種分別接種于含50 μg/mL 硫酸卡納霉素的LB 液體培養基中，在37℃搖床培養約3 h至 OD600=0.4～0.6后加入1 mM 的IPTG，于220 rpm轉速下誘導6 h，收集菌體進行SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白的表達．

1.2 .5毒素基因alr0758誘導表達條件的優化

1)最佳誘導時間優化實驗.含重組質粒pET-30a-alr0758的BL21菌37℃培養至OD600=0.4～0.6 時，加入 IPTG，使其終濃度為1.0 mmol/L，于28℃誘導表達，在24 h內每2 h收集一次菌體進行SDS-PAGE檢測．2)最佳 IPTG 濃度優化實驗.含重組質粒pET-30a-alr0758的BL21菌37℃培養至OD600=0.4～0.6時，加入IPTG 的終濃度梯度分別為0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mM，在28℃下誘導最佳時長收集菌體進行SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達情況．

1.2 .6目的蛋白純化與western blot檢測 誘導基因asr0757與alr0758表達，收集菌體進行超聲波破碎處理，上清過Ni-NTA柱，洗脫后得到目標蛋白，將得到的蛋白進行SDS-PAGE電泳，待膠上蛋白電轉至硝酸纖維素膜上用WB封閉液封閉，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉60 min，加入1∶5000稀釋的兔抗6×His的多抗，4℃冰箱孵育過夜.次日取出繼續搖動1～2 h.加入Western洗滌液，在搖床上緩慢搖動洗滌5～10 min.吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌7～10 min.共洗滌3～4次. TBS洗滌后，加入1∶10000稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔多克隆體，室溫反應1.5 h，充分洗滌，加入新鮮配制的二氨基聯苯胺(DAB)顯色液，待顯色條帶清晰后立即用蒸餾水洗滌硝酸纖維素膜，同時設置對照組：BL21菌和含pET30a空載體的BL21轉化菌．

2 結果與分析

2.1 魚腥藻PCC7120總DNA的提取

本實驗基因組DNA的提取主要是SDS裂解法，并對傳統的酚-氯仿法作了改進，總共提取7管總DNA，為后續的PCR，以及菌落PCR檢測提供需要，總DNA提取后瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示所有的條帶在預計目的條帶處均出現較亮的單一條帶，如圖1所示，表明魚腥藻PCC7120總DNA提取成功．

M:DL5000標準marker；1～7：魚腥藻PCC7120總DNA．圖1 魚腥藻PCC7120 DNA提取Fig.1 DNA extraction of Anabaena sp. PCC7120

2.2 克隆載體pMD18-T-asr0757 和 pMD18-T-alr0758構建

Touch-down PCR擴增的基因alr0758與asr0757的PCR產物經1.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果與預期大小相符：asr0757大小為210 bp和alr0758為342 bp(圖2) .藍白斑篩選陽性克隆雙酶切檢測(圖3)結果顯示在預測大小處有單一的目的條帶，雙酶切檢測中有2條帶，分別為目的條帶與空T載體條帶(2 692 bp).檢測正確的克隆菌送往金斯瑞測序，測序結果與NCBI 所公布的asr0757 和alr0758 序列Blast 比對，結果顯示堿基完全匹配，表明克隆載體pMD18-T-asr0757 和 pMD18-T-alr0758構建成功．

M:DL5000標準marker；1～2:asr0757 PCR 產物；3～4:alr0758 PCR 產物．圖2 PCR電泳檢測圖Fig.2 Examination of PCR products by agar electrophoresis

M:DL5000標準marker；1～2：克隆質粒pMD18-T-asr0757雙酶切產物；3～4：克隆質粒pMD18-T-alr0758雙酶切產物．圖3 pMD18-T-asr0757 和pMD18-T-alr0758雙酶切電泳檢測Fig.3 Examination of pMD18-T-asr0757 and pMD18-T-alr0758 with the double enzyme digestion

2.3 重組表達載體 pET-30a-asr0757，pET-30a-alr0758的構建

選用雙酶切位點BamH1和EcoR1，對重組克隆載體pMD18-T-asr0757 和pMD18-T-alr0758 進行雙酶切回收，連接經相同酶雙酶切后的pET-30a轉化BL21(DE3)，挑取陽性克隆菌落進行PCR檢測(見圖4)以及雙酶切檢測(見圖5)，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示在預測大小處出現目標條帶(asr0757 為210 bp，alr0758為342 bp).雙酶切檢測圖顯示兩條條帶，一條為目的帶另一條為pET-30a空載條帶(5 422 bp)，送金斯瑞公司測序，測序結果比對顯示目的片段完全正確插入，重組表達載體 pET-30a-asr0757與pET-30a-alr0758構建成功．

M:DL5000標準marker；1～2：表達重組菌pET-30a-asr0757菌落PCR產物；3～5：表達重組菌pET-30a-alr0758菌落PCR產物．圖4 表達載體pET-30a-asr0757與pET-30a-alr0758菌落PCR檢測Fig.4 Colony PCR detection of the expression vector pET-30a-asr0757 and pET-30a-alr0758

M:DL5000標準marker；1：重組表達質粒pET-30a-asr0757雙酶切產物；2：重組表達質粒pET-30a-alr0758雙酶切產物圖5 重組表達質粒pET-30a-asr0757，pET-30a-alr0758雙酶切檢測Fig.5 Detection of expression vectors pET-30a-asr0757 and pET-30a-alr0758 with double enzyme digestion

2.4 目的基因asr0757，alr0758的誘導表達

表達菌pET-30a-asr0757與pET-30a-alr0758分別在37℃與28℃下，加入1.0 mM IPTG，220 rpm轉速下誘導表達6 h后進行SDS-PAGE電泳檢測.電泳結果顯示，pET-30a-asr0757與pET-30a-alr0758分別在約13.5 kD(圖6)和17.9 kD(圖7)處有表達條帶，抗毒素表達量較好，毒素表達量則較少.抗毒素基因asr0757與毒素基因alr0758表達的蛋白預測大小分別為8.068 kD，12.533 kD，加上空載體pET-30a自身帶有的組氨酸標簽與酶切位點，產生的融合蛋白大小分別為asr0757(13.5 kD)和alr0758(17.9 kD)，SDS-PAGE膠上顯示的誘導條帶的大小與預測的目的基因誘導后表達的融合蛋白的大小相符合．

M：預染蛋白marker；1:pET-30a菌未誘導；2:pET-30a菌誘導表達； 3： 重組菌pET-30a-asr0757未誘導；4：重組菌pET-30a-asr0757誘導表達．圖6 重組菌pET-30a-asr0757誘導表達產物SDS-PAGE檢測Fig.6 Examination of recombinant protein pET-30a-asr0757 by SDS-PAGE

M：預染蛋白marker；1:pET-30a菌未誘導；2:pET-30a菌誘導表達；3：重組菌pET-30a-alr0758未誘導；4：重組菌pET-30a-alr0758誘導表達圖7 重組菌pET-30a-alr0758誘導表達產物SDS-PAGE檢測Fig.7 Examination of recombinant protein pET-30a-alr0758 by SDS-PAGE

2.5 毒素基因alr0758誘導表達條件的優化

由圖7可知，毒素基因表達量較少，為后續蛋白純化的需求，對毒素基因alr0758表達條件進行優化，主要從誘導時間梯度以及IPTG誘導濃度梯度這兩個方面進行優化．

2.5 .1最佳誘導時間優化實驗 圖8為不同誘導時間對重組蛋白表達量的影響. 重組菌pET-30a-alr0758在誘導2 h時即有較明顯的表達，在10 h時有最大表達量，之后延長誘導表達的時間蛋白的誘導表達量基本保持不變或呈減弱趨勢，故重組蛋白pET-30a-alr0758的最佳誘導時間為10 h．

M：預染蛋白marker；1：空載體pET-30a誘導表達；2～14：誘導時間依次為0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24 h的pET-30a-alr0758重組菌圖8 不同誘導時間對重組蛋白pET-30a-alr0758表達量的影響Fig.8 Influence of induction time on protein expression of pET-30a-alr0758

2.5.2最佳 IPTG 濃度優化實驗 IPTG終濃度梯度誘導表達結果如圖9所示，pET-30a-alr0758重組菌于28℃培養10 h，當IPTG誘導終濃度為0.4 mM時有最大的誘導表達量，故pET-30a-alr0758的IPTG最佳誘導濃度為0.4 mM．

M：預染蛋白marker；1：空載體pET-30a誘導表達；2～8:IPTG 誘導濃度依次為0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mM的pET-30a-alr0758重組菌．圖9 不同IPTG 誘導濃度對重組蛋白pET-30a-alr0758表達量的影響Fig.9 Influence of IPTG concentration on protein expression of pET-30a-alr0758

2.6 目的蛋白純化與western blot檢測

重組表達菌在誘導表達過Ni-NTA柱后收集洗脫蛋白進行SDS-PAGE檢驗(設置對照組)，結果顯示在預測大小處出現單一的目標條帶，如圖10(A)所示，asr0757(13.5 kD)和alr0758(17.9 kD)，大小與理論值相符，而實驗對照組BL21和含pET-30a空載體的BL21轉化菌則沒有出現目標條帶，表明純化效果較好.western blot結果如圖10(B)所示，重組菌pET30a-asr0757 與pET-30a-alr0758誘導純化的蛋白分別在約13.5 kD和17.9 kD處出現明顯的特異性條帶而實驗對照組同樣在相同的位置沒有出現特異性條帶，說明純化所得蛋白為目的蛋白．

A) M：預染蛋白marker；1:pET-30a-asr0757重組菌；2:pET-30a-alr0758重組菌；3：含空載pET-30a的BL21菌；4:BL21菌；B) 1:pET-30a-asr0757重組菌；2:pET-30a-alr0758重組菌；3：含空載pET-30a的BL21菌；4:BL21菌．圖10 重組蛋白純化(A)與western blot鑒定(B)Fig.10 Purification of the recombinant proteins(A) and identification by western blot(B)

3 討論

盡管毒素-抗毒素系統廣泛地存在于細菌中，且不同來源的毒素-抗毒素基因的同源性各不相同或者相差很大，但已有的生物學分析顯示其遺傳結構以及功能非常的相似[11].TAS根據毒素性質的不同，可以分為3種類型：Ⅰ型、Ⅱ型與Ⅲ型.Ⅱ型TAS分布最為廣泛，研究較多，比較常見的Ⅱ型 TAS有MazF和RelE，本文研究的基因隸屬MazEF家族，大腸桿菌染色體上的MazEF是研究最為清楚的II型TAS之一，其中的毒素蛋白MazF是具有序列特異性的核酸內切酶[12]，當細胞遭遇外界環境脅迫時，不穩定的的抗毒素蛋白MazE被降解，穩定的毒素蛋白游離出來作用于細胞，使細胞生長抑制或死亡[13]．

本文研究的基因對asr0757/alr0758通過前期NCBI Blast比對得知其與大腸桿菌中的TAS系統MazEF具有較高的同源性，且遺傳結構相同，asr0757和alr0758具有14個堿基的重疊區域，通過這對基因誘導表達產物的研究以及在染色體上遺傳結構特征，初步判定基因asr0757/alr0758也具有TAS基因功能構成TA系統．

成功構建的表達載體誘導表達后經SDS-PAGE檢測，結果顯示，基因對asr0757與alr0758均成功表達，但是毒素基因alr0758表達量較小，含有毒素基因alr0758的重組菌pET-30a-alr0758在37℃下，220 rpm時生長非常緩慢且誘導后幾乎沒有目的蛋白的產生，但是在28℃，160 rpm誘導條件下目的蛋白表達量明顯增多，與含抗毒素基因的重組菌pET-30a-asr0757相比較，無論是活化階段還是誘導階段，pET-30a-alr0758明顯比pET-30a-asr0757長勢緩慢，這也在一定程度上顯示了毒素基因alr0758的毒性作用，同時加入IPTG誘導的實驗組菌株比未加入IPTG的對照組長勢慢，說明IPTG對細胞生長也具有一定的毒性作用，pET-30a-alr0758在28℃，160 rpm，蛋白表達量較為可觀，表明低溫低速時誘導可以增加可溶性蛋白量[14]，但是溫度若過低時藻類生長速度緩慢，蛋白的誘導表達困難或不表達.由于藍藻體內存在的大量TAS使其應對環境脅迫時更加有利，本實驗的結果是對TAS家族基因的一個補充，具有一定的理論以及實際意義，期望能夠為后續染色體上其它可能的TAS基因的探究提供一定的實驗參考．

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Optimized expression of chromosomal genepairasr0757/alr0758 inAnabaenasp. PCC 7120 and its identification

CHEN Jie， CHEN Sili， WU Huilan

(College of Life Science， South-Central University for Nationalities， Wuhan 430074)

Chromosomal gene pairasr0757/alr0758 inAnabaenasp. PCC 7120 was predicted to belong to the toxin-antitoxin system (TAS) with homology analysis by software NCBI. To verify this， expression vectors were constructed for the above two genes， respectively. The vectors were induced by 1.0 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG).Then， the inducing conditions were optimized， after which the proteins were purified and identified through western blot. Result of SDS-PAGE revealed that proteins of genesasr0757/alr0758 were expressed successfully after induced for 6 h at 37℃. The expression level ofasr0757(13.5 kD) appeared to be higher than that ofalr0758(17.9 kD). Therefore， induction time gradient and IPTG concentration were optimized to improve the expression level ofalr0758. Results showed that genealr0758 obtained relatively large expression quantity after 10 h induction at 37℃ with 0.4 mM IPTG. Protein purification and western blot results showed that the expression proteins were the target proteins.

Anabaenasp.PCC7120;asr0757/alr0758; expression; optimization; identification

2015-11-04.

國家自然科學基金項目(31001099/C190101)；中央高校自然科學基金項目(CJSl3003，CJS13004)；中南民族大學微生物與生物轉化重點實驗室項目(XJS09002)；“十二五”國家級中南民族大學民族藥學實驗教學中心建設項目.

1000-1190(2016)02-0263-06

Q812

A

*通訊聯系人. E-mail: sili.chen@163.com．