基于分子對接技術預測人面子葉中黃酮成分抗菌作用靶點Δ

李 洋，夏厚林，周厚琴，2，陸小華，2，張 璐，2，趙艷玲

(1.成都中醫藥大學藥學院，四川 成都611137； 2.解放軍第302醫院藥學部，北京 100039)

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基于分子對接技術預測人面子葉中黃酮成分抗菌作用靶點Δ

李 洋1，2*，夏厚林1，周厚琴1，2，陸小華1，2，張 璐1，2，趙艷玲2#

(1.成都中醫藥大學藥學院，四川 成都611137； 2.解放軍第302醫院藥學部，北京 100039)

目的：木犀草素、槲皮素、兒茶素、表兒茶素是人面子葉中主要的黃酮成分，研究顯示人面子具有抗菌活性，利用Autodock軟件，模擬并預測黃酮成分的抗菌作用靶點。方法：采用中醫藥化學數據庫和Autodock 4.2軟件進行分子對接。結果：模擬分析得出木犀草素、槲皮素、兒茶素、表兒茶素與青霉素結合蛋白3、青霉素結合蛋白5、DNA聚合酶的對接結果及其功能區域的相互作用關系。結論：木犀草素是人面子葉中潛在活性成分，青霉素結合蛋白5和DNA聚合酶是人面子葉中黃酮成分抗菌的潛在靶點。本研究預測了人面子葉的抗菌作用靶點，為探索其抗菌機制奠定了基礎，也為以木犀草素為先導化合物開發新型藥物提供了理論基礎。

人面子葉； 黃酮； Autodock； 青霉素結合蛋白； DNA聚合酶

人面子(Dracontomelondao)是漆樹科人面子屬常綠大喬木植物，生長于中國臺灣、海南、廣西、廣東、云南等熱帶地區。人面子葉即人面子的干燥葉片，是華南地區民間常用的、傳統的用于治療人體皮膚感染特別是皮膚炎癥和疼痛的中草藥。民國時期蕭步丹所著《嶺南采藥錄》記載：“人面子，……解毒，治偏身風毒痛癢”。文獻報道，人面子葉的乙醇提取物對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌具有抑制作用，人面子葉的乙酸乙酯提取物對大腸埃希菌(Escherichiacoli.)具有較強的抑制作用[1-2]。此外，人面子的揮發油還具有抗腫瘤的作用[2]，人面子葉的提取物具有抗病毒的作用。但是，人面子葉的抗菌作用靶點尚不明確，作用機制有待于進一步研究。計算機輔助藥物設計是以計算機為主要工具，結合化合物、生物蛋白數據庫，利用藥物和相關靶標的知識，通過理論模擬、算法計算，預測藥物與受體生物大分子之間的關系，實現合理藥物設計的現代藥物設計方法。在藥物設計中，分子對接技術處于關鍵性地位[3-6]。分子對接即通過計算機模擬藥物分子產生藥效反應的過程，藥物分子與靶蛋白相互結合，產生相互作用，發揮藥效。通過分子對接技術，可確定復合物中靶點與配體正確的相對位置和取向，了解兩者的相互作用，確定藥物作用機制與設計新藥的基礎[7-8]。青霉素結合蛋白(penicillin binding protein，PBP)是廣泛存在于細菌表面的一種膜蛋白，在異種細菌之間其種類及含量均不相同，但各種菌種的PBP又有許多類似的結構與功能，在細菌生長、繁殖中發揮著重要作用[9-10]。DNA聚合酶是細胞復制DNA的重要作用酶，其以DNA為復制模板，將DNA由5’端點復制至3’端，其主要活性是催化DNA的合成[11]。本研究采用計算機分子對接技術，研究人面子葉中四種主要的黃酮成分槲皮素、兒茶素、表兒茶素、木犀草素與PBP和DNA聚合酶的相互作用關系，探索人面子葉抗菌作用靶點及機制。

1 材料與方法

1.1 材料來源

Autodock 4.2軟件來源于美國斯克利普斯研究所(http://autodock.scripps.edu)，為免費授權的軟件。PBP蛋白和DNA聚合酶蛋白晶體結構來源于蛋白質數據庫(http://www.rcsb.org/pdb)。黃酮化合物結構來源于中醫藥數據庫(http://tcm.cmu.edu.tw)。軟件運行于Linux操作系統平臺下。相關軟件均是已授權或免費授權。

1.2 方法

1.2.1 結構預處理：在蛋白質數據庫中，搜索并下載PBP蛋白和DNA聚合酶蛋白晶體結構文件。DNA聚合酶，基源為大腸桿菌，蛋白號：4ckl；PBP-5蛋白，基源為大腸桿菌，蛋白號：3beb；PBP-3蛋白，基源為大腸桿菌，蛋白號：4bjp。利用對接軟件，去除各蛋白晶體結構中溶劑和相關配體，得到潔凈的DNA聚合酶、PBP-3和PBP-5蛋白結構，并加入電荷和極性氫原子，保存。應用Chem3D軟件，對從中醫藥數據庫下載的槲皮素、木犀草素、兒茶素、表兒茶素的分子結構進行能量優化，保存。

1.2.2 Autodock分子對接：在Linux終端下運行Autodock 4.2軟件，依次加載潔凈蛋白和能量優化后的化合物(配體)，用Autogrid計算格點能量，對接運算采用拉馬克遺傳算法，各化合物與蛋白之間的結合情況用半經驗的自由能評價方法評價。參數設置過程中，將參數“能量最大評價次數”確定為2 500 000，運行次數確定為100，其他參數采用軟件的默認設置。根據相關文獻報道，確定各蛋白活性口袋的氨基酸殘基和中心點坐標(X，Y，Z)：4ckl氨基酸殘基為HIS45、LYS42、LEU41、GLY40、ASN165、LEU98、SER171、ASN169、GLY170、ILE182、PRO184、PRO183、TYR266，坐標為(23.204，-34.491，-23.884)；3beb氨基酸殘基為ASN199、THR214、GLY215、HIS216、TYR222、ASN223、LEU224、GLU249、ARG248、GLY247、THR224、VAL239、GLY242、ARG243、ALA17、ASP16、GLU251，坐標為(41.739，-5.728，26.979)；4bjp氨基酸殘基為PRO425、MET422、SER261、VAL531、GLU304、VAL302、PHE303、SAP301、ARG297、ALA498、ILE512、ASN533、SER259、LYS500、VAL501、LYS499，坐標為(-16.564，32.895，14.509)[12]。

2 結果

經過Autodock軟件的運算分析，得到人面子葉中黃酮類化合物槲皮素、木犀草素、兒茶素、表兒茶素分別與PBP-3、PBP-5、DNA聚合酶蛋白的對接信息。對接信息包括半經驗化的自由能評價評分、抑制常數值(inhibition constant，Ki)、對接模擬溫度。對于多構象的對接結果，選取前10位的對接構象結果。PBP-3蛋白與表兒茶素、槲皮素、木犀草素、兒茶素相互作用，其最佳結合自由能分別為-26.25、-26.16、-27.08、-26.66 kJ/mol，與之相對應的Ki分別為25.38、26.34、18.19、21.46 μmol/L，見表1。通過比較Ki，發現木犀草素對PBP-3蛋白具有較低的抑制常數和較強的抑制作用。

通過Autodock自帶的分析程序，分析得到了PBP-3蛋白和相關黃酮配體的最佳對接構象及其相關作用方式。如圖1(A)所示，表兒茶素與PBP-3蛋白結合的空間構型，對應表1中表兒茶素等級1的對接結果?？梢?，表兒茶素與PBP-3蛋白中GLU258、GLU292、ARG295、THR300的氨基酸殘基有相應的相互作用，結合圖2(A)發現，表兒茶素與ARG295具有氫鍵的相互作用，氫鍵鍵長是2.62 A。此外，還有數個氨基酸殘基與表兒茶素之間具有疏水作用，但尚未形成相關配位鍵或氫鍵。圖1(B)對應表1中槲皮素等級1的對接結果?？梢?，槲皮素與PBP-3蛋白中ILE532、ALA513、GLY502、PRO305的氨基酸殘基有相應的相互作用，結合圖2(B)發現，槲皮素與VAL501、ILE532、ALA513、GLU304具有氫鍵的相互作用，氫鍵鍵長分別是2.62、3.16、2.58、2.64 A。此外，還有數個氨基酸殘基與槲皮素之間具有疏水作用，但尚未形成相關配位鍵或氫鍵。圖1(C)對應表1中木犀草素等級1的對接結果?？梢?，木犀草素與ASN197的氨基酸殘基有相應的相互作用，結合圖2(C)發現，木犀草素與ASN197、TYR183、SER252具有氫鍵的相互作用，其中與ASN197具有多氫鍵交互作用，但仍有數個氨基酸殘基與木犀草素之間具有疏水作用但尚未形成相關配位鍵或氫鍵。圖1(D)對應表1中兒茶素等級1的對接結果?？梢?，兒茶素與PBP-3蛋白中PRO305的氨基酸殘基有相應的相互作用，結合圖2(D)發現，兒茶素與GLU304具有氫鍵的相互作用，氫鍵鍵長是3.04 A。

表1 PBP-3(4bjp)的對接信息

A.表兒茶素；B.槲皮素；C.木犀草素；D.兒茶素A.L-Epicatechin；B.Quercetin；C.Luteolin；D.Cianidanol圖1 PBP-3(4bjp)的對接空間位置示意圖Fig 1 Space position of PBP-3(4bjp) molecular docking

A.表兒茶素；B.槲皮素；C.木犀草素；D.兒茶素A.L-Epicatechin；B.Quercetin；C.Luteolin；D.Cianidanol圖2 PBP-3(4bjp)的對接交互作用二維平面圖Fig 2 2D planar graph of PBP-3 (4bjp) molecular docking interaction

PBP-5蛋白與表兒茶素、槲皮素、木犀草素、兒茶素相互作用，其最佳結合自由能分別為-35.62、-31.94、-31.69、-33.49 kJ/mol，與之相對應的Ki分別為0.58、2.55、2.80、1.36 μmol/L，見表2。通過比較Ki發現，這4種黃酮對PBP-5蛋白具有較強的抑制作用，特別是表兒茶素的Ki為582 nmol/L，說明表兒茶素能較強抑制PBP-5蛋白，這可能是人面子葉抑菌作用潛在靶點。

表2 PBP-5(3beb)的對接信息

圖3—4對應表2中各黃酮類物質等級為1的對接結果。如圖3(A)表兒茶素與PBP-5蛋白結合的空間構型可見，表兒茶素與PBP-5蛋白中ASN197、LEU201、ILE212、VAL225、ARG198的氨基酸殘基有相應的相互作用，結合圖4(A)發現，表兒茶素與ASN223、LYS213、GLY211、ILE212、ASN197具有氫鍵的相互作用，氫鍵鍵長分別是2.65、3.13、2.94、2.92、2.97 A。此外，還有數個氨基酸殘基與表兒茶素之間具有疏水作用但尚未形成相關配位鍵或氫鍵。由圖3(B)可見，槲皮素與PBP-5蛋白中TYR183、ASN197的氨基酸殘基有相應的相互作用，結合圖4(B)發現，槲皮素與ILE212具有氫鍵的相互作用，氫鍵鍵長為3.07 A。此外，還有數個氨基酸殘基與槲皮素之間具有疏水作用，但尚未形成相關配位鍵或氫鍵。由圖3(C)可見，木犀草素與ASN197的氨基酸殘基有相應的相互作用，結合圖4(C)發現，木犀草素與ASN197、TYR183、SER252具有氫鍵的相互作用，其中與ASN197具有多氫鍵交互作用。由圖3(D)可見，兒茶素與PBP-5蛋白中ASN197、ARG198的氨基酸殘基有相應的相互作用，結合圖4(D)發現，兒茶素與TYR183具有氫鍵的相互作用，氫鍵鍵長為3.24 A。此外，ASN197是4種黃酮類化合物共同作用的氨基酸殘基，說明這是潛在的抗菌作用靶點。木犀草素對PBP-3和PBP-5的作用位點均相同，表明木犀草素的作用位點較為穩定，值得進一步探索。

A.表兒茶素；B.槲皮素；C.木犀草素；D.兒茶素A.L-Epicatechin；B.Quercetin；C.Luteolin；D.Cianidanol圖3 PBP-5(3beb)的對接空間位置示意圖Fig 3 Space position of PBP-5(3beb) molecular docking

A.表兒茶素；B.槲皮素；C.木犀草素；D.兒茶素A.L-Epicatechin；B.Quercetin；C.Luteolin；D.Cianidanol圖4 PBP-5蛋白(3beb)的對接交互作用二維平面圖Fig 4 2D planar graph of PBP-5(3beb) molecular docking interaction

DNA聚合酶蛋白與表兒茶素、槲皮素、木犀草素、兒茶素相互作用，其最佳結合自由能分別是-31.23、-30.31、-31.81、-26.83 kJ/mol，與之相對應的Ki分別為3.40、4.96、2.69、20.18 μmol/L，見表3。通過比較Ki發現，表兒茶素、槲皮素、木犀草素對DNA聚合酶蛋白具有較強的抑制作用，特別是木犀草素的Ki為2.69 μmol/L，說明木犀草素能較強抑制DNA聚合酶，這可能是人面子葉抑菌作用潛在靶點。

表3 DNA聚合酶蛋白(4ckl)的對接信息

圖5—6對應表3中各黃酮類物質等級為1的對接結果。由圖5(A)表兒茶素與DNA聚合酶結合的空間構型可見，表兒茶素與DNA聚合酶中ARG46、ASP39、ILE89的氨基酸殘基有相應的相互作用，結合圖6(A)發現，表兒茶素與ARG39和ARG42具有氫鍵的相互作用，鍵長分別為2.67、3.11 A。由圖5(B)可見，槲皮素與DNA聚合酶中SER97、ARG91、ARG99的氨基酸殘基有相應的相互作用，結合圖6(B)發現，槲皮素與ARG91和ARG99具有氫鍵的相互作用，氫鍵鍵長分別是2.73、3.15 A。由圖5(C)可見，木犀草素與SER172、GLY170、PHE96、THR219的氨基酸殘基有相應的相互作用，結合圖6(C)發現，木犀草素與GLY170、TYR219、SER172具有氫鍵的相互作用，其中與GLY170具有多氫鍵交互作用，但仍有數個氨基酸殘基與木犀草素之間具有疏水作用但尚未形成相關配位鍵或氫鍵。由圖5(D)可見，兒茶素與DNA聚合酶中THR219、GLY170的氨基酸殘基有相應的相互作用，結合圖6(D)發現，兒茶素與GLU304具有氫鍵的相互作用，氫鍵鍵長為3.04 A。

A.表兒茶素；B.槲皮素；C.木犀草素；D.兒茶素A.L-Epicatechin；B.Quercetin；C.Luteolin；D.Cianidanol圖5 DNA聚合酶蛋白(4ckl)的對接空間位置示意圖Fig 5 Space position of DNA polymerase (4ckl) molecular docking

A.表兒茶素；B.槲皮素；C.木犀草素；D.兒茶素A.L-Epicatechin；B.Quercetin；C.Luteolin；D.Cianidanol圖6 DNA聚合酶蛋白(4ckl)的對接交互作用二維平面圖Fig 6 2D planar graph of DNA polymerase (4ckl) molecular docking interaction

3 討論

分子對接是依據酶的鎖-鑰匙原理，從已知結構的化合物及蛋白出發，通過計算機模擬、化學計量學計算，識別并預測受體-配體結合的方法，在預測蛋白質復合物結構和結合位點方面對探索作用機制具有重要的意義，并已廣泛用于藥物虛擬篩選、定量構效關系研究。

從單個化合物對蛋白的影響和Ki絕對值大小的角度而言，表兒茶素對PBP-5的Ki最低，為582 nmol/L，表明以Ki絕對值大小為參數，表兒茶素對PBP-5的抑制強度最大。其次分別為兒茶素(其對PBP-5的Ki為1.36 μmol/L)、槲皮素(其對PBP-5的Ki為2.55 μmol/L)、木犀草素(其對DNA聚合酶的Ki為2.69 μmol/L)。但綜合3種目標蛋白，木犀草素的算術平均Ki值最低，為7.89 μmol/L(其對PBP-3、PBP-5、DNA聚合酶的Ki分別為18.19、2.80、2.69 μmol/L)，其后依次是表兒茶素(9.78 μmol/L)、槲皮素(11.28 μmol/L)、兒茶素(14.33 μmol/L)，表明木犀草素是人面子葉中潛在活性成分。

從單個蛋白的作用強度而言，4種黃酮類化合物對PBP-5蛋白的Ki普遍較低，最佳結合構象均<3 μmol/L，說明PBP-5蛋白是人面子葉抗菌作用的潛在靶點。其次為4種黃酮類化合物對DNA聚合酶蛋白的Ki，除兒茶素外其余化合物最佳結合構象均<5 μmol/L，說明DNA聚合酶蛋白也是人面子葉抗菌作用的潛在靶點。相比較而言，4種黃酮類物質對PBP-3蛋白的Ki較高，均>18 μmol/L，說明PBP-3蛋白可能不是人面子葉抗菌作用的靶點。

此外，通過空間位置示意圖發現，ASN197是4種黃酮類化合物對PBP-5蛋白共同作用的氨基酸殘基。但是在交互作用二維平面圖中，4種黃酮類化合物對PBP-5蛋白ASN197氨基酸殘基的作用方式各異，表兒茶素和木犀草素是氫鍵的作用方式，槲皮素和兒茶素是具有疏水作用但尚未形成相關配位鍵或氫鍵，說明木犀草素是人面子葉抗菌活性作用的潛在靶點。比較木犀草素的對接信息發現，木犀草素對PBP-3和PBP-5具有相同作用位點，均與TYR183、ASN197、SER252氨基酸殘基有氫鍵作用，表明木犀草素的作用位點較為穩定，值得進一步探索。

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Prediction of Target Points of the Antibacterial Activity of Flavonoids From the Leaves of Dracontomelon Dao Based on Molecular Docking TechnologyΔ

LI Yang1,2, XIA Houlin1, ZHOU Houqin1,2, LU Xiaohua1,2, ZHANG Lu1,2, ZHAO Yanling2

(1.College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Sichuan Chengdu 611137, China; 2.Dept.of Pharmacy, 302 Military Hospital of PLA, Beijing 100039, China)

OBJECTIVE：Luteolin, Cianidanol, Quercetin, PBP-3(4bjp)were the major flavonoids from the leaves ofDracontomelondao. It was reported thatDracontomelondaohad antibacterial activity. Autodock software was adopted to simulate and predict the target points of the antibacterial activity of flavonoids. METHODS: Chinese medicine chemistry database and Autodock 4.2 software were used for the molecular docking. RESULTS: The simulation analysis showed the correlation of docking results and functional area betwwen Luteolin, Cianidanol, Quercetin, L-Epicatechin and PBP-3, PBP-5, DNA polymerase. CONCLUSIONS: Luteolin is the potential active component inDracontomelondao. PBP-5 and DNA polymerase are the potential targets for the antibacterial activity of flavonoids from the leaves ofDracontomelondao. In this study, antibacterial targets was predicted by Autodock softwave which lays the foundation for exploring the antibacterial mechanism and provide theory basis for the development of new drugs with luteolin as lead compounds.

Dracontomelondao; Flavonoids; Autodock; PBPs; DNA polymerase

國家重大新藥創制專項(No.2015ZX09J15102-004)；國家自然科學基金資助項目(No.81342571)

R96

A

1672-2124(2016)10-1303-05

2016-08-29)

*在讀碩士研究生。研究方向：中藥質量控制、計算機輔助藥物設計。E-mail：liyang0838@qq.com

#通信作者：主任醫師，博士，研究員。研究方向：中藥藥理學。E-mail：zhaoyl2855@126.com

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2016.10.003