碲化鎘量子點對小鼠肝臟超微結構及重要生物酶活性的影響

王吉龍，韓瑩，王萌萌，孫湖泊，黃沛力,*，孫志偉

1.首都醫科大學公共衛生學院，北京100069

2.環境毒理學北京市重點實驗室，北京100069

3.中國食品藥品檢定研究院，北京100050

4.北京體育大學，北京100084

碲化鎘量子點對小鼠肝臟超微結構及重要生物酶活性的影響

王吉龍1,2，韓瑩3，王萌萌1,2，孫湖泊4，黃沛力1,2,*，孫志偉1,2

1.首都醫科大學公共衛生學院，北京100069

2.環境毒理學北京市重點實驗室，北京100069

3.中國食品藥品檢定研究院，北京100050

4.北京體育大學，北京100084

探討了碲化鎘量子點(cadmium telluride quantum dots,CdTe QDs)對小鼠肝組織超微結構及琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase,SDH)和三磷酸腺苷酶(adenosine triphosphatase,ATPase)活性的影響。將20只雄性ICR小鼠隨機分成QDs染毒組和對照組,采用尾靜脈注射方式進行一次性染毒,染毒組每只小鼠注射2μmol·kg-1體重的CdTe QDs(以Cd2+的摩爾濃度計算)。每5只為一組分別在染毒后的1 d、3 d和7 d處死小鼠,另外5只注射生理鹽水作為對照組。取部分肝組織在透射電鏡下觀察其超微結構變化并使用試劑盒測定肝臟中SDH、Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶的活性。結果顯示CdTe QDs暴露后染毒組小鼠肝細胞胞漿疏松,線粒體出現腫脹、空泡、嵴減少等結構變化,表明肝細胞受到損傷且染毒1 d后損傷最嚴重；肝臟中染毒組SDH活性與對照組相比顯著降低(P＜0.05)；染毒1 d后,Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活性與對照組相比顯著升高,隨著染毒后時間的延長,其活性呈現下降的變化趨勢。單次量注射CdTe QDs能夠引起小鼠肝臟損傷,抑制SDH活性,引起ATP酶活性改變,這些癥狀在暴露時間內呈現恢復趨勢。

碲化鎘量子點；小鼠；肝組織；超微結構；琥珀酸脫氫酶；ATP酶

量子點(quantum dots,QDs)作為一種新型的納米材料,因其具有獨特的光學特性而被廣泛應用于細胞成像、追蹤和標記以及藥物篩選等生物醫藥研究領域[1]。其中鎘系QDs,由于含有Cd元素,對其潛在毒性的研究成為了當今亟待解決的熱點問題。研究表明,QDs能夠分布在生物體內多個組織器官,并聚集在肝臟、腎臟等網狀內皮系統[2]。進一步研究表明,QDs可以以胞吞的形式通過細胞膜進入細胞內,并以線粒體作為靶標。線粒體是細胞的能量轉換器,三羧酸循環、電子傳遞及氧化磷酸化均在線粒體內進行,線粒體損傷后將影響細胞的活性進而引起臟器損傷[3-4]。本實驗以雄性ICR小鼠為實驗對象,研究了CdTe QDs對小鼠肝細胞超微結構、線粒體標志酶SDH及膜蛋白酶ATP酶的影響,以其進一步探討量子點對肝細胞的毒作用機制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗動物與試劑

ICR小鼠,雄性,SPF級,體重24.3～27.9 g,由軍事醫學科學院實驗動物中心提供,許可證號:SCXK-(京)2012-0001。嚴格控制飼養環境(實驗室溫度(22 ±2)℃,相對濕度55% ±15%,正常通風換氣,采用12 h光照/12 h黑暗飼養),用滅菌顆粒料和純凈水喂養。染毒開始前動物適應飼養一周。CdTe QDs購于南京捷納思新有限公司(粒徑3～4 nm,激發波長490 nm,發射波長620 nm)；SDH、Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.2 主要儀器設備

AX200電子分析天平(日本Shimadzu公司), KQ-250E型超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司),臺式高速離心機(德國Eppendorf公司),RF-5301pc熒光分光光度儀(日本Shimadzu公司),JEM-1400透射電子顯微鏡(日本Jeol公司),Mili-Q超純水機(法國Milipore公司)。

1.3 小鼠染毒及處理

用無菌生理鹽水將CdTe QDs配成濃度為250 nmol·mL-1的溶液。染毒前超聲處理30 min,使團聚量子點均勻分散。將20只小鼠隨機分為染毒組和對照組,每組5只。采用尾靜脈注射方式一次性染毒,染毒組每只小鼠注射2μmol·kg-1體重的CdTe QDs(以Cd的摩爾濃度計算),對照組注射等體積生理鹽水。分別在染毒后1 d、3 d和7 d處死小鼠,取部分肝組織在透射電鏡下觀察其超微結構變化。其余組織迅速用生理鹽水清洗后置于-80℃冰箱以備用。

1.4 肝組織勻漿制備

將小鼠脫頸處死后立即摘取肝臟,在冰冷的生理鹽水中漂洗,以去掉表面的血跡,濾紙拭干,稱重,加入預冷的0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(PBS)(pH 7.8),冰浴中用玻璃勻漿器制成1%組織勻漿,將勻漿以4 000 r·min-1的轉速離心15 min,取上清備用。

1.5 肝臟組織的超微結構觀察

將小鼠處死后,在肝臟右前葉上取1 mm3大小肝組織(染毒組和對照組肝臟均取相同部位),快速放入體積分數為4%的戊二醛中固定(4℃,2 h以上)；0.1 mol·L-1PBS(pH 7.2)漂洗3次,每次15 min；經過戊二醛-鋨酸雙重固定(4℃,1.5 h)；0.1 mol·L-1PBS(pH 7.2)漂洗3次；梯度乙醇、丙酮系列脫水3次(體積分數為50%的乙醇15 min,體積分數為70%的乙醇15 min,體積分數為90%的乙醇15 min, 100%乙醇10 min)；環氧樹脂包埋、聚合(45℃,12 h；60℃,36 h)；超薄切片機切片(厚度60 nm)；經醋酸雙氧鈾30 min、檸檬酸鉛3 min雙重染色,并蒸餾水水洗；透射電鏡下觀察其超微結構改變。

1.6 SDH活力的測定

使用SDH試劑盒測定SDH活力,應用雙抗體夾心法,使用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度值,通過標準曲線測定肝組織中SDH的活力濃度。

1.7 Na＋/K＋-ATP酶、Ca2＋/Mg2＋-ATP酶活性的測定

使用試劑盒測定Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活性。ATP酶可分解ATP生成ADP及無機磷,測定無機磷的量可判斷ATP酶活力的高低。其活性定義為:單位時間(h)單位質量(mg)組織蛋白的ATP酶分解ATP產生1μmol無機磷的量為1個ATP酶活力單位(μmol·(mg·h)-1)。

1.8 統計學分析

所有實驗數據用平均值±標準偏差表示,使用SPSS 19.0軟件統計數據,各實驗組與對照組之間用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行統計分析, P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果(Results)

2.1 CdTe QDs對小鼠肝細胞超微結構的影響

染毒組和對照組的肝臟細胞超微結構圖如圖1所示。對照組肝細胞形態正常,胞質均勻分布,細胞器、糖原顆粒豐富,粗面內質網繞線粒體存在,核仁清晰,核膜清晰完整,核染色質分布均勻,異染色質和常染色質散在分布,無異常,如圖1(A)所示。染毒組肝細胞胞漿疏松,細胞器分散,胞質內脂滴與溶酶體相對增多,粗面內質網變化不明顯。染毒1 d后線粒體出現腫脹、空泡較多,線粒體膜融合,嵴減少,基質密度降低；細胞核溶解出現空泡(圖1 B)。染毒3 d后細胞器出現腫脹,少量空泡化現象(圖1 C),染毒7 d后的結果與對照組相比出現輕微損傷但沒有1 d、3 d組損傷嚴重(圖1 D)。

圖1 小鼠肝臟細胞超微結構圖注:細胞核(N),線粒體(M),內質網(RER)；A,對照組(×8 000)；B,1 d組(×8 000)；C,3 d組(×8 000)；D,7 d組(×8 000)。Fig.1 The hepatocytes ultrastructure of mice nuclear(N),mitochondrion(M),rough endoplasmic reticulum(RER)Note:A,control group(×8 000);B,1 d group(×8 000);C,3d group(×8 000);D,7 d group(×8 000).

2.2 肝臟中SDH活性的變化

小鼠肝臟組織勻漿中SDH活性的變化如圖2所示。與對照組相比,各染毒組SDH活性明顯降低(P＜0.05),其中染毒1 d后的SDH活性最低,而7 d SDH活性有所上升,但尚未恢復到正常水平。染毒1 d、3 d、7 d后結果兩兩比較有顯著性差異(P＜0.05),且隨著染毒時間的延長SDH活性有逐漸升高的趨勢。

圖2 CdTe QDs對小鼠肝臟中SDH活性的影響注:n=5；與對照組比較,*P＜0.05。Fig.2 The effect of CdTe QDs on SDH activities in mouse liver tissueNote:n=5;compared with the control group,*P＜0.05.

2.3 肝臟中Na＋/K＋-ATP酶活性的變化

小鼠肝臟組織勻漿中Na+/K+-ATP酶活性的變化如圖3所示。與對照組相比,染毒1 d和3 d后的Na+/K+-ATP酶活性明顯高于對照組(P＜0.05)。而染毒7 d后的Na+/K+-ATP酶活性與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)。

2.4 肝臟中Ca2＋/Mg2＋-ATP酶活性的變化

小鼠肝臟組織勻漿中Ca2+/Mg2+-ATP酶活性的變化如圖4所示。與對照組相比,染毒1 d、7 d后的Ca2+/Mg2+-ATP酶活性明顯高于對照組(P＜0.05)。而染毒3 d后的Ca2+/Mg2+-ATP酶活性與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)。

圖3 CdTe QDs對小鼠肝臟中Na＋/K＋-ATP酶活性的影響注:n=5；與對照組比較,*P＜0.05。Fig.3 The effect of CdTe QDs on Na+/K+-ATPase activities in mouse liver tissueNote:n=5;compared with the control group,*P＜0.05.

圖4 CdTe QDs對小鼠肝臟中Ca2＋/Mg2＋-ATP酶活性的影響注:n=5；與對照組比較,*P＜0.05。Fig.4 The effect of CdTe QDs on Ca2+/Mg2+-ATPase activities in mouse liver tissueNote:n=5;compared with the control group,*P＜0.05.

3 討論(Discussion)

QDs由于其具有獨特的熒光特性越來越受到研究者的關注,同時它對環境的影響和生物安全性問題也逐漸被人們所關注。針對生物應用及其安全性評價,了解量子點在體內的生物學行為顯得尤其重要。而肝臟是機體的重要器官,具有儲存營養、排除血液毒素、促進膽汁分泌等功能。有研究表明, QDs在小鼠體內肝臟富集程度遠遠大于其他部位[5-6]。因此,深入探討QDs對肝組織的毒性效應有重要意義。

超微結構容易直接的表現出外源物對機體的作用情況,本研究中肝臟組織超微結構顯示,肝細胞胞漿疏松,細胞器分散,線粒體出現腫脹、空泡,線粒體膜融合、嵴減少、基質密度降低等,說明以2μmol·kg-1體重的CdTe QDs染毒對小鼠肝細胞造成損傷。

SDH存在于諸多組織臟器中,主要定位于細胞內線粒體嵴膜的內側膜中,為線粒體的標志酶,可催化琥珀酸生成延胡索酸參與三羧酸循環。SDH是三羧酸循環的限速酶,其活性大小可表明機體細胞有氧氧化能力的高低,反映線粒體狀態[7-8]。Hong等[9]通過對小鼠連續60 d染毒,發現隨著TiO2納米顆粒物染毒劑量的增加,睪丸內SDH的活性逐漸降低。本研究顯示,各染毒組小鼠肝臟中SDH活性與對照組相比均顯著降低,與楊利劍等[10]探討納米羥基磷灰石作用于大鼠肝線粒體時對SDH活性的影響所得到的結果相似,說明CdTe QDs對肝細胞的損傷伴隨著SDH的活性下降。從不同染毒組SDH活性的變化趨勢來看,暴露1 d時SDH活性最低,而肝細胞超微結構也在1 d時損傷最為嚴重。CdTe QDs染毒1 d、3 d、7 d后的結果互相對比后發現:隨著時間的延長,SDH活性逐漸上升,提示該損傷有一定的恢復趨勢,這與肝細胞超微結構圖顯示的損傷程度基本吻合。

ATP酶存在于組織細胞及細胞器的膜上,是生物膜上的1種蛋白酶,它在物質運送、能量轉換以及信息傳遞方面具有重要的作用。機體在病理狀態下,ATP酶活力發生一系列轉變,所以ATP酶的活性是各種細胞能量代謝及功能有無損傷的重要指標[11-12]。Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶是細胞膜上重要的ATP酶,有研究表明,這2種酶在維持細胞內Ca2+濃度穩定中發揮重要的作用[13-14]。劉信勇等[15]發現單壁碳納米管懸濁液中長期暴露條件下,試驗組Na+/K+-ATP酶活性均大于空白組,35 d時斑馬魚體內組織的Na+/K+-ATP酶活性比28 d時要低,但變化無顯著性差異。高春生課題組[16]研究水體銅對黃河鯉Na+/K+-ATP酶活性的影響,結果表現為低濃度Cu2+對黃河鯉肝臟Na+/K+-ATP酶活性有促進作用,且隨著Cu2+處理時間的延長促進作用逐漸加強。Hu等[17]研究納米SiO2對神經系統的影響,用不同濃度納米SiO2對小鼠進行染毒發現,隨著染毒計量的增加,腦中Na+/K+-ATP酶和Ca2+/ Mg2+-ATP酶活性都顯著降低。本研究中發現, CdTe QDs染毒后Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活性有明顯的波動變化,與對照組相比都有所升高,提示CdTe QDs對這些酶有一定的激活作用,這一點與Sastry和Gupta[18]在研究重金屬離子對水生動物體內ATP酶活性的影響所得到的結果非常相似,估計這是機體在長期毒物負荷下的一種保護機制,也可能是機體受到刺激后的一種代償性升高,當這種刺激超出機體的適應能力時,將會導致ATP酶活性消耗性降低。這種變化是否與QDs進入細胞的方式有關(胞吞或者離子通道),將有待于進一步研究。

綜上所述,CdTe QDs染毒后會抑制體內的SDH的活性,該酶活力受到抑制后就會導致細胞內氧化磷酸化過程受阻,直接影響ATP的生成從而造成三羧酸循環及能量代謝紊亂[19]。ATP酶活性升高,使得ATP酶需消耗更多的ATP來保證能量代謝的進行,此時SDH活性受到抑制ATP生成減少, ATP酶就不能正常進行逆化學梯度的離子轉運來維持細胞內外離子濃度的相對穩定,從而進一步引起機體代謝紊亂?？傊?CdTe QDs能夠引起小鼠肝細胞超微結構改變,抑制SDH活性,引起ATP酶活性改變。關于CdTe QDs對肝臟組織的損傷作用,還有待于進一步探討。

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Influences of CdTe Quantum Dots on Ultrastructure and Enzymatic Activities of Mice Liver

Wang Jilong1,2,Han Ying3,Wang Mengmeng1,2,Sun Hubo4,Huang Peili1,2,*,Sun Zhiwei1,2
1.School of Public Health,Capital Medical University,Beijing 100069,China
2.Beijing Key Laboratory of Environmental Toxicology,Beijing 100069,China
3.National Institutes for Food and Drug Control,Beijing 100050,China
4.Beijing Sport University,Beijing 100084,China

27 July 2015 accepted 18 September 2015

In the present study,influences of cadmium telluride quantum dots(CdTe QDs)on the ultrastructure and the activities of succinate dehydrogenase and adenosine triphosphatase in liver of mice were examined.Twenty ICR mice were randomly divided into exposed groups and control group,and injected with 2μmol·kg-1weight of CdTe QDs(as Cd)by tail intravenous injection(IOCV).Mice injected with normal saline were used as the control.Each of 5 mice was sacrificed at 1 d,3 d and 7 d,respectively.Liver tissue was sampled to observe the ultrastructural changes by transmission electron microscopy(TEM)and homogenized to measure enzymatic activities of SDH, Na+/K+-ATPase,Ca2+/Mg2+-ATPase using assay kits.The TEM results showed that mitochondria swelling,vacuole, crest reduction occurred after CdTe QDs exposure,indicating the hepatocytes damage,especially for 1 d exposure. The activities of SDH in the treated groups were significantly lower than that in the control group(P＜0.05).The activities of Na+/K+-ATPase and Ca2+/Mg2+-ATPase in the liver tissue were significantly higher than those in the control group at 1 d exposure.As the exposure time increasing,the activities of ATPase showed a downward trend. We concluded that single dose of CdTe QDs exposure could induce mice liver damage,affect activities of both SDH and ATP enzyme,which could gradually recovered.

cadmium telluride quantum dots;mice;liver tissue;ultrastructure;succinate dehydrogenase;ATPase

2015-07-27 錄用日期:2015-09-18

1673-5897(2016)1-283-06

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150727001

王吉龍,韓瑩,王萌萌,等.碲化鎘量子點對小鼠肝臟超微結構及重要生物酶活性的影響[J].生態毒理學報,2016,11(1):283-288

Wang J L,Han Y,Wang M M,et al.Influences of CdTe quantum dots on ultrastructure and enzymatic activities of mice liver[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(1):283-288(in Chinese)

國家自然科學基金項目(81273131)；北京市教育委員會科技發展計劃重點項目(KZ201510025027)；首都醫科大學優秀學術帶頭人及團隊交流培養項目

王吉龍(1988-),男,碩士研究生,研究方向為衛生毒理學,Email:wangjilong21@126.com；

),E-mail:huangpl@ccmu.edu.cn

簡介:黃沛力(1963—)，女，無機化學碩士，首都醫科大學教授，博士生導師，長期從事納米材料檢測技術與生物體內化學穩定性研究。