團頭魴谷胱甘肽S-轉移酶基因的克隆及其在氨氮脅迫中的表達分析

孫盛明，朱健,*，戈賢平，張成鋒，繆凌鴻，張武肖，章瓊

1.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，無錫214081

2.南京農業大學無錫漁業學院，無錫214081

團頭魴谷胱甘肽S-轉移酶基因的克隆及其在氨氮脅迫中的表達分析

孫盛明1，朱健1,*，戈賢平1，張成鋒1，繆凌鴻1，張武肖2，章瓊2

1.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，無錫214081

2.南京農業大學無錫漁業學院，無錫214081

谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferase,GST)是一類多功能蛋白家族,主要參與解毒和抗氧化防御過程。為了研究GST在團頭魴(Megalobrama amblycephala)肝臟解毒過程中的作用,克隆并分析了團頭魴1個谷胱甘肽S-轉移酶基因(命名為MaGST)cDNA序列,采用實時熒光定量PCR研究了其在氨氮脅迫下的表達規律。MaGST包含1個長218個氨基酸的完整開放閱讀框,具有GST蛋白家族的保守堿基和保守結構域。通過MEGA 5.0軟件分析系統進化樹發現,團頭魴GST與其他動物mu型GST聚為一簇,表明團頭魴GST屬于mu型GST。熒光定量PCR結果顯示MaGST基因在團頭魴各組織中均有表達,在肝臟和鰓中表達量最高,肌肉中表達量最低,同時在氨氮脅迫過程中該基因在肝和鰓中的表達規律相似,均在脅迫期間表達量顯著上調；氨氮脅迫24 h時鰓和肝組織均存在組織損傷。研究結果提示在團頭魴肝臟和鰓組織中GST基因參與了氨氮脅迫的解毒過程。將該基因的編碼區重組到pET-21(a+)載體后在大腸桿菌中得到誘導表達,重組MaGST的GST活力為(10.36±0.68)U·mg-1蛋白。

氨氮脅迫；團頭魴；谷胱甘肽S-轉移酶；基因克隆

團頭魴(Megalobrama amblycephala)是我國大宗淡水魚類主要養殖品種之一。然而,隨著團頭魴集約化養殖密度和規模的擴大,其發病率明顯增高,而水體中氨氮含量過高是促使其發病的主要影響因素之一,嚴重制約了團頭魴高密度養殖模式的發展[1]。已有研究表明氨氮脅迫對魚類的影響主要集中在生長性能[2-3]、鰓增生[4]和氧化損傷脂質和蛋白質[5]等幾個方面,而目前有關團頭魴對水環境氨氮脅迫的去毒分子機理、代謝機制等研究尚未見報道。

水生生物解毒過程被分為3個階段,階段Ⅰ與階段Ⅱ能夠將外源性化學物質轉化成毒性較小的水溶性代謝物,階段Ⅲ在機體細胞內消除這些代謝產物[6]。谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferase, GST,EC.2.5.1.18)作為主要的第二相解毒酶(phaseⅡdetoxification enzyme)參與了外源性或內源性毒素的解毒過程,它可以催化親核性的谷胱甘肽與各種親電子外源化學物的結合反應,參與維持了機體內氧化還原狀態的平衡,從而提高機體對環境的適應能力以及成活率[7]。文獻報道GST參與細胞耐菌性、植物抗除草劑和昆蟲抗藥性等分子過程[8-10],上述研究表明GST在動植物解毒、抗逆和抗病過程中起著重要作用。

谷胱甘肽S-轉移酶是一組廣泛分布于各類生物細胞的超家族酶類[11],哺乳動物中目前報道的GST主要分為細胞質GSTs(包括7個類型Alpha、Mu、Pi、Theta、Sigma、Omega和Zeta)、線粒體GST (kappa)和微粒體GST[12]。鑒于魚類中抗氧化分子如谷胱甘肽或抗氧化物酶如谷胱甘肽S-轉移酶能夠保護機體氧化損傷,近年來魚類不同亞型的GST基因cDNA全序列已相繼被克隆[13-15],而關于草食性魚類團頭魴GST基因的克隆與表達研究未見報道。本研究以實驗室前期構建的團頭魴全組織cDNA文庫中篩選出的EST序列為基礎,通過RACE技術獲得了團頭魴谷胱甘肽S-轉移酶基因的全長序列,采用熒光定量PCR技術分析該基因在團頭魴氨氮脅迫下的表達模式。采用體外重組表達技術獲得了谷胱甘肽S-轉移酶基因的重組表達產物,檢測了重組蛋白的活性,以期為團頭魴功能基因開發及解毒系統研究提供技術支撐。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗魚

團頭魴幼魚取自中國水產科學研究院淡水漁業研究中心南泉養殖基地。選擇活潑健康、規格一致的團頭魴幼魚(15±0.86)g共300尾,試驗開始前用基礎飼料馴養2周,每天投喂3次(08:00、11:30和17:00),根據攝食情況適當調整投喂量,實驗前提前2天停止投喂飼料。整個試驗期間水質如下:水溫為23～24℃,溶氧≥5mg·L-1,pH為6.8～7.2。通過本實驗室預實驗得出團頭魴幼魚96 h氨氮半致死濃度的基礎上[16],設計低氨氮組(對照組0.46mg·L-1)和高氨氮組(25mg·L-1),每個處理設置3個平行,用氯化銨為母液配制實驗組的總氨氮濃度。挑選體色正常、健康的團頭魴幼魚隨機放入6個可控溫循環流水圓形蓄養槽(規格為φ820 mm×700 mm)內,每桶40尾。實驗期間停止喂食,每隔4小時進行總氨氮濃度的測定。

1.1.2 試劑和儀器

RNAiso Plus、3’-Full RACE Kit、5’-Full RACE Kit、LA Taq TM、pMD 18-T Vector、PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Premix Ex Taq TM、DH5α感受態細胞購自TaKaRa；分析純NH4Cl、苯酚氯仿異戊醇(25:24:1)、氯仿、異丙醇、DEPC水、Tryptone、Yeast extract、NaCl、Agar、氨芐青霉素、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購自Sangon Biotech；引物由上海生工合成。低溫離心機(湘儀TGL-16M高速臺式冷凍離心機)、凝膠成像系統(Beckman Coulter CEQ 8000)、紫外分光光度計(eppendorf BioPhotometer)、PCR儀(eppendorf Autherized Thermal cycler)、熒光定量PCR儀(Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System)、搖床(華利達HZ-9511K恒溫振蕩器)、熒光顯微鏡(奧林巴斯)、德國徠卡切片機(Leica RM 2135)。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA的提取

取團頭魴肝組織轉入液氮預冷的研缽中,邊磨邊加入液氮,迅速將組織研磨成粉末狀,RNA提取方法按照RNAiso Plus的操作步驟進行組織裂解后用傳統的酚仿抽提法提取總RNA并使用RNA-free DNaseI純化試劑盒用于各組織總RNA的純化,紫外分光光度計測定RNA濃度及純度并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測各組織總RNA的完整性。

1.2.2 GST3’端和5’端擴增

從本實驗室構建的團頭魴肝臟cDNA文庫的測序結果中,通過拼接組裝及比對分析,從中發現1條EST序列(長度為756 bp)與鯉魚(Cyprinus carpio)的GST(ABD67509.1)氨基酸序列相似度較高,根據已知中間序列,采用 Primer 5.0軟件分別設計5′RACE和3′RACE的特異性引物(詳見表1),以團頭魴肝臟cDNA為模板,按照3'RACE和5'RACE試劑盒(Takara,大連)說明書分別進行3’和5’的擴增。

1.2.3 序列分析

使用ContigExpress軟件將團頭魴GST的中間序列、3’測序結果、5’測序結果進行拼接得到該基因的全長cDNA序列。在Compute pI/Mw程序中預測蛋白分子量及等電點(http://web.expasy.org/compute _pi/)。登陸NCBI,在該網站中的ORF Finder程序中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找所拼接團頭魴GSTcDNA序列的開放閱讀框及其所對應的氨基酸序列,同時對開放閱讀框進行Blastp比對,運用DNAMAN軟件進行氨基酸多序列比對分析,利用MEGA 5.0軟件構建系統進化樹。采用NCBI的Conserved Domains(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)查找工具分析蛋白質結構域。

1.2.4 團頭魴不同組織GST的表達分析

提取團頭魴肌肉、鰓、腎、腦、肝、腸道6個組織的總RNA,熒光定量PCR反應的cDNA合成按照TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒說明書進行反轉,根據所獲得的GST基因全長cDNA序列設計1對熒光定量特異引物MaGST qF和MaGST qR(見表1),擴增長度為151 bp；以團頭魴的β-actin基因(序列號AY170122)為熒光定量反應的內參基因,設計1對內參引物β-actin-F和β-actin-R (見表1)。對熒光定量基因特異性引物和內參引物進行普通PCR擴增,用瓊脂糖檢測其在團頭魴中的擴增情況,判斷目的片段的大小并檢測其正確性。

表1 基因克隆所用的引物及其序列Table 1 Primers and their sequences used in gene cloning

熒光染料使用Takara的SYBR?Premix Ex Taq II,反應在Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System定量儀上進行,按照試劑盒上的說明加樣,反應總體系為20μL,內含cDNA 2μL、引物各0.8μL(10μmol·L-1)、SYBR?Premix Ex Taq II 10μL、ROX Reference Dye or Dye II 0.4μL、dH2O 6μL,采用兩步法進行擴增,反應程序為95℃30 s、95℃5 s、60℃34 s,共40個循環。每個樣品3次重復實驗以減少誤差,先用標準品梯度稀釋進行定量PCR獲得內參基因及谷胱甘肽S-轉移酶基因的標準曲線,熒光定量的實驗數據采用雙標準曲線法進行相對定量分析,計量數據資料均用平均值±標準誤表示[17],使用SPSS 17.0軟件進行顯著性分析,用Turkey法進行多重比較分析(P＜0.05為顯著水平)。

1.2.5 團頭魴肝和鰓組織應答氨氮脅迫后GST基因的表達分析

在氨氮脅迫后0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h時,分別在處理組和對照組中隨機取3尾團頭魴,取肝和鰓保存于-80℃冰箱用以提取RNA,再經反轉錄獲得cDNA模板,進行熒光定量PCR分析。反應在Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System中進行,對照組和處理組的團頭魴肝和鰓組織cDNA樣品在每個時間點做3個熒光定量特異引物和內參基因β-actin基因重復。

1.3 MaGST重組表達載體構建

根據所得到的MaGST的cDNA編碼區設計特異性引物“5′AAGATGGCAATGAAATTGGCATA 3′,含有NdeⅠ酶切位點”和“(5′AAATGGGGAAACAAGGAGTGAA 3′,含有XhoⅠ酶切位點和6×His純化標簽”進行GST體外重組表達。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳純化后連入pMD18-T載體,轉化Top10F’感受態細胞,通過特異性PCR進行陽性克隆篩選。培養經測序驗證后的陽性克隆進行質粒提取并NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切,純化后連接到pET21(a+)表達載體,轉化大腸桿菌origami(DE3)感受態之后,菌液PCR驗證并測序。

1.4 MaGST重組蛋白純化、復性及活性檢測

在200 mL LB培養基(含100μg·mL-1氨芐青霉素)中接入5 mL含有重組質粒的宿主菌origami (DE3),200 r·min-1,37℃培養至OD600達到0.5～0.7時,加入IPTG至終濃度為1 mmol·L-1,相同條件下繼續培養,分別在誘導2 h和4 h后各取2 mL菌液,SDS-PAGE電泳檢測。菌體加入20 mL緩沖液(50 mmol·L-1pH 7.4的PBS,含8 mol·L-1尿素),混勻,冰浴條件下超聲破碎至液體變澄清,然后4℃下10 000 g離心30 min,收集上清。上清經過鎳瓊脂糖凝膠柱親和純化。純化后的重組蛋白,依次在含有6、4、2、1和0 mol·L-1尿素的50 mmol·L-1PBS(pH 7.4)中過夜透析(4℃),之后用不含尿素的50 mmol·L-1PBS(pH 7.4)連續透析2次。利用15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法檢測透析后所獲得的純化樣品,采用牛血清白蛋白(BSA)作為標準制作標準曲線,蛋白濃度的測定參考Bradford(1976)的方法進行[18]。在進行測定時,以透析結束時的透析緩沖液代替待測蛋白作為對照。重組MaGST活性的測定采用南京建成的谷胱甘肽-S轉移酶測定試劑盒,單位為U·mg-1蛋白。

圖1 團頭魴GST基因cDNA全序列以及由此推測的氨基酸序列注:方框表示起始密碼子和終止密碼子,星號表示翻譯終止,大寫字母表示開放閱讀框,陰影部分表示Mu loop結構域,方框表示GST基因N-terminal和C-terminal結構域,下劃線表示PolyA加尾信號。Fig.1 cDNA sequence of GST gene and putative amino acid sequence inM.amblycephalaNote:The box respresents the initiation codon and stop codon,“*”means translation termination;the capital letter means ORF;the Mu loop domain was shaded in gray and N-terminal and C-terminal domain were boxed;the PolyA signal was marked by single underline.

1.5 鰓和肝臟組織光鏡樣品制備與觀察

氨氮脅迫實驗期間,分別于0 h和24 h采集樣品。每次從每個循環桶中隨機取出3尾進行活體解剖,取各實驗組的肝和鰓經生理鹽水漂洗后,用Bouin氏液固定,用常規梯度酒精逐級脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片機連續切片,厚度為5μm,蘇木精和伊紅染色,脫水封片,顯微觀察并拍照。

2 結果(Results)

表2 團頭魴GST基因氨基酸序列與其他脊椎動物的相似性比較Table 2 The similarity between the GST amino acid sequence ofM.amblycephalaand other vertebrates

2.1 團頭魴GST基因3’RACE和5’RACE擴增、克隆及全長拼接

如圖1所示,利用Contig Express軟件對中間序列、5’端序列、3’端序列進行拼接,得到團頭魴GST基因全長1 011 bp的cDNA序列,其中有133 bp的5’末端非翻譯區(untranslated regions,UTR),224 bp的3’UTR,并且有明顯的AATAAA加尾信號和Poly(A)尾,654 bp的開放閱讀框(open reading frame, ORF),編碼218個氨基酸。團頭魴GST主要有Mu loop(GEAPDYD),GST N-terminal和GST C-terminal三個結構域。通過Compute pI/Mw程序預測該基因的蛋白分子量為25.95 kD,等電點(pI)為5.44。團頭魴GST基因cDNA序列已提交到GenBank,登陸號為KM586249。

小鼠Mus musculus Mm Alpha1 AAH61134 Mm Alpha2 AAH30173 Mm Alpha3 AAH09805 Mm Alpha4 AAH12639 Mm Kappa1 NP-083831 Mm Mu4 AAH30444 Mm Mu6 AAH31818 Mm Pi AAH61109 Mm Theta1 AAH12254 Mm Theta2 Q61133 Mm Theta3 AAH03903 Mm mGST1 AAQ93322 Mm mGST2 NP-778160 Mm mGST3 AAH29669斑馬魚Danio rerio Dr Alpha AAH60914 Dr Kappa1 XP-686115 Dr Mu NP-997841 Dr Mu1 XP-690427 Dr Pi AAH83467 Dr Pi2 NP-001018349 Dr Theta NP-956878 Dr Theta3 XP-692427 Dr Rho CAK10882 Dr mGST1 AAH74022 Dr mGST2 XP-700815 Dr mGST3 XP-695658河豚Tetraodon nigroviridis PlRho CAA64493 PlRho CAA64496大口黑鱸Micropterus salmoides Ms Rho AAQ91198 Tn Alpha CAG09409 Tn Mu CAG07510 Tn Theta CAG09655 Tn mGST1 CAF97117 Tn mGST2 CAG04538 Tn mGST3 CAG09920鰈魚Pleuronectes platessa真鯛Pagrus major Pm Rho BAD98443鰷魚Pimephales promelas Pr Rho AAF78081鯽魚Carassius auratus Ca Pi ABF57553歐鰻Anguilla anguilla Aa Pi AAS01601團頭魴Megalobrama amblycephala Ma Mu KM586249

圖2 團頭魴mu型GST基因推導氨基酸序列的多序列比較注:Mu型GST基因結構域用紅色方框框出；GSH結合位點用菱形標出；底物結合位點用倒三角標出；N端二聚體用圓形標出,C端二聚體用箭頭標出。Fig.2 Multiple sequence alignments of mu-MaGST with other five homologous mu-GST amino acid sequencesNote:The mu class GST motif is boxed in red.Diamond,GSH binding sites;Inverted triangle,substrate binding sites;Circular,dimer interface in N-terminal domain;and arrow,dimer interface in C-terminal domain.

圖3 利用MEGA4.0軟件構建各物種GST基因進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of GST amino acid sequence in diffrerent groups by MEGA 4.0

2.2 團頭魴GST基因的同源性分析

氨基酸序列比對結果顯示團頭魴GST的氨基酸序列與草魚GST同源性最高,相似度高達91%,運用DNAMAN軟件將團頭魴GST的氨基酸序列與其他已公布的6種魚類的氨基酸序列進行比對分析,結果如圖2所示,顯示該基因在魚類中的同源性較高,均有比較保守的3個酶催化位點以及底物結合位點。

2.3 團頭魴GST基因的系統進化樹分析

團頭魴與其他脊椎動物的GST基因氨基酸序列的亞型與基因登錄號如表2所示,其他脊椎動物包括人、小鼠、斑馬魚、河豚、大口黑鱸、真鯛、鰷魚、鯽魚等。

用MAGE4.0軟件對已經公布的序列以及團頭魴的GST基因氨基酸序列采用鄰位相聯法構建系統進化樹。如圖3所示,團頭魴GST基因與其他脊椎動物mu型GST基因親緣關系較近并處在同一分支,表明團頭魴GST基因屬于mu型。魚類與哺乳動物GST親緣關系較遠,可能與魚類GST基因在水環境毒素去毒代謝中承擔的特殊功能有關。

2.4 團頭魴GST基因的組織表達

以團頭魴 β-actin為內參基因采用熒光定量PCR檢測健康團頭魴肌肉、鰓、腎、腦、肝、腸的這6個組織中GST基因的相對表達量,結果如圖4所示:該基因在肌肉、鰓、腎、腦、肝、腸道內均有表達,其中在肝和鰓組織中表達量較高,在腸道組織中表達量最低。

圖4 熒光定量PCR方法檢測團頭魴各組織中GST mRNA的相對表達量Fig.4 GST mRNA expression in different tissues of M.amblycephalaby qRT-PCR

2.5 團頭魴GST的mRNA在受到氨氮脅迫后不同時間點表達規律

采用熒光定量PCR方法檢測團頭魴受到氨氮脅迫6、12、24、48 h后肝和鰓中GST的表達規律。肝組織和鰓組織的脅迫前后表達模式類似,如圖5所示,團頭魴肝組織中的GST基因在氨氮脅迫的6～48h時,其表達量顯著高于對照組(P＜0.05)；由圖6中可知,與對照組相比,團頭魴鰓組織中的GST基因表達水平在脅迫6～48 h顯著上升(P＜0.05)。

圖5 氨氮脅迫后團頭魴肝組織中GST基因mRNA的表達量變化注:*表示與對照組差異顯著(n=3,*P＜0.05)。Fig.5 Expression of GST in liver ofM.amblycephalaunder acute ammonia exposueNote:* means significant different compared with control(n=3,*P＜0.05).

圖6 氨氮脅迫后團頭魴鰓組織中GST基因mRNA的表達量變化注:*表示與對照組差異顯著(n=3,*P＜0.05)。Fig.6 Expression of GST in gill ofM.amblycephalaunder acute ammonia exposueNote:* means significant different compared with control(n=3,*P＜0.05).

圖7 重組團頭魴GST蛋白SDS-PAGE電泳結果注:M,標準分子質量Marker；1,未加IPTG的大腸桿菌培養物(對照)；2,添加IPTG誘導2 h；3,添加IPTG誘導4 h；4,純化后的團頭魴GST重組蛋白。Fig.7 The SDS-PAGE result of recombinant MaGSTNote:Line M shows the protein marker;Lane 1,negative control for recombinant MaGST(without induction);lane 2,induced expression for 2 h of recombinant MaGST;lane 3,induced expression for 4 h of recombinant MaGST;lane 4,purified recombinant MaGST.

2.6 團頭魴GST原核重組表達及活性測定

將團頭魴GST的編碼區重組到pET21(a+)中,通過IPTG誘導表達,利用凝膠柱純化得到帶有6× His標簽的團頭魴GST蛋白。從圖7所示,所獲得的純化蛋白的分子量為26 kDa左右,與預測的分子量結果相吻合。經GST檢測試劑盒測定,重組團頭魴GST的GST活力為(10.36±0.68)U·mg-1蛋白。

2.7 氨氮脅迫導致鰓和肝臟組織病理變化

氨氮脅迫前,團頭魴幼魚的鰓絲和鰓小片泌氯細胞較少,鰓絲排列整齊規則(圖8),而氨氮脅迫24 h時,泌氯細胞較少、鰓小片融合、變短,基部毛細血管破裂。氨氮脅迫前,團頭魴幼魚的肝細胞排列整齊,細胞輪廓清晰(圖8),而氨氮脅迫24 h時,肝細胞水樣變性嚴重,細胞溶解,輪廓模糊,血竇擴張嚴重。

圖8 氨氮脅迫對團頭魴幼魚鰓和肝臟組織顯微結構的影響注:A表示氨氮脅迫0 h(對照組)鰓絲組織顯微結構圖；B分別表示氨氮濃度(25mg·L-1)脅迫24 h鰓絲組織顯微結構圖；C表示表示氨氮脅迫0 h(對照組)肝組織顯微結構圖；D表示氨氮濃度(25mg·L-1)脅迫24 h肝組織顯微結構圖。H.E染色(×200),標尺50μm。CC,泌氯細胞；SL,鰓小片；LF,鰓小片融合；SSL,鰓小片變短；H,肝細胞；NH,細胞核腫大；DS,血竇擴張。Fig.8 Effect of ammonia exposure on gill and liver microstructure in juvenileM.amblycephalaNote:A means the microscopical gill structure of juvenileM.amblycephalaexposed to ammonia at 0 h;B means the microscopical gill structure of juvenileM.amblycephalaexposed to ammonia(25mg·L-1)at 24 h;C means the microscopical liver structure of juvenileM.amblycephalaexposed to ammonia at 0 h;D means the microscopical liver structure of juvenileM.amblycephalaexposed to ammonia(25mg·L-1)at 24 h.H.E(×200), bar=50μm.CC,chloride cells;SL,secondary lamellae;LF,lamellar fusion;SSL,shortening of secondary lamellae;H,hepatocytes;NH,nuclear hypertrophy;DS,dilatation in sinusoids.

3 討論(Discussion)

GST基因是魚類重要的Ⅱ相去毒酶基因,其表達產物一方面緩解氧化壓力、抑制活性氧對機體的損傷,另一方面催化毒素形成親水化合物經排泄系統排出體外[19]。GST基因亞型的分類基于對該基因N端結構域的氨基酸、結構、抗體反應以及對抑制劑的敏感性[7]。本研究通過RACE PCR技術獲得了團頭魴GST基因的cDNA序列,包含1個典型的GST-N結構域和1個GST-C結構域,其編碼的氨基酸序列與其他近源物種比對結果可判斷擴增得到的cDNA序列屬于GST基因家族,同時與其他物種的Mu-型GST相比,具有一致的Mu-loop結構域[20]。此外,系統進化樹分析結果也表明團頭魴GST屬于mu型的1個成員,團頭魴 GST與斑馬魚 mu型GST在系統樹上處于相鄰位置,且與其他魚類(河豚)聚成1簇,與團頭魴分類學上的地位吻合。團頭魴GST的組織定量表達分析顯示,該基因在各組織中均有表達,但在肝組織中的表達量最高,然后依次是鰓、腎、肌肉、腦和腸道,這與已報到的鯉魚(Cyprinus carpio)GST基因的組織表達結果相一致[21]。

鰓和肝臟組織是魚類重要的呼吸和解毒器官,鑒于GST基因在團頭魴肝臟和鰓組織表達量較高,本實驗選擇肝和鰓組織作為研究對象,在氨氮急性脅迫后不同時間段對團頭魴肝和鰓組織中GST基因的定量表達分析顯示,肝和鰓組織中該基因的表達規律相似,表達水平均呈先升高后降低的趨勢,研究表明團頭魴幼魚魚體處于在高濃度氨氮應激初始狀態下防御與損傷或許處于平衡狀態,隨著急性脅迫時間延長,平衡系統被打破組織發生損傷(肝和鰓組織結構變化),機體抗氧化能力下降,這是因為GST的過氧化物酶活性能利用谷胱甘肽向氫過氧化物發動親核攻擊,使其還原為低毒的一元醇(monohydroxy alcohol),從而緩解氧化脅迫[22],而隨著氨氮脅迫時間的增加,過量的自由基和過氧化產物或許抑制了GST基因的轉錄與翻譯。最近在哺乳動物的研究中已經證實氨中毒引發腦組織谷氨酰胺的積累進一步導致其中樞神經系統(CNS)的氧化應激并產生大量活性氧分子,這些活性氧分子不但直接對細胞造成損傷,還將通過引發脂質過氧化作用介導細胞膜的功能紊亂[23],而Hegazi等[24]在氨氮脅迫下的尼羅羅非魚肝臟和肌肉中也發現大量的活性氧自由基,抗氧化酶活性顯著升高,Sun等[25]也發現慢性氨氮脅迫下的鳙魚也存在類似的氧化應激反應,這與本實驗室結果相吻合。為了進一步確定氨氮脅迫是否產生一定程度氧化應激損傷,本實驗選取GST表達量較高的時間點進行鰓和肝臟組織結構觀察,氨氮脅迫24 h下團頭魴幼魚鰓絲毛細血管擴張,泌氯細胞增生,鰓小片卷曲,鰓小片融合、變短；而氨氮脅迫24 h下團頭魴幼魚肝細胞腫大、細胞核變形溶解、血竇擴張、細胞輪廓模糊,這與張武肖等[16]研究結果相一致。過量的自由基介導脂質過氧化產物產生,丙二醛(MDA)被認為是脂類過氧化損傷最具代表性的指標[26],胡毅等[27]的研究表明青魚MDA含量隨著氨氮脅迫時間的延長而顯著增加,蔣玫等[28]的研究表明慢性氨氮脅迫對鯔魚MDA活性與氨氮濃度呈一定的正相關。故此,我們可推斷活性氧自由基與內源性抗氧化能力的不平衡是導致氨氮毒性分子機制的主要原因之一。

鑒于mu型GST在細胞解毒和抗氧化防御中起著非常重要的作用[29]。本研究利用原核表達方法獲得了重組MaGST蛋白,其GST活力為(10.36± 0.68)U·mg-1蛋白,這與在真鯛(Pagrus major)GST重組蛋白活性相類似[30]。GST活力能反映機體抗氧化能力的高低,Lee等[31]通過原核表達的方法獲得了重組GST蛋白,其活性為天然GST的45%,故此本研究測定的重組MaGST蛋白的活力也可能只是其活性的部分。本研究純化的重組蛋白可用于制備MaGST的單克隆抗體,并用于GST相關表達的檢測,為團頭魴mu-型GST功能的進一步研究奠定了堅實基礎,如何增強淡水魚類解毒酶基因的表達以減輕急性氨氮脅迫導致的致毒作用有待于進一步研究。

[1]江曉浚,孫盛明,戈賢平,等.添加不同碳源對零換水養殖系統中團頭魴魚種生長、腸道生化指標和水質的影響[J].水產學報,2014,38(8):1113-1122 Jiang X J,Sun S M,Ge X P,et al.The effect of different carbon sources on growth,intestinal biochemical parameters and water quality in the juvenileMegalobrama amblycephalacultured in zero water exchanged system[J]. Journal of Fisheries of China,2014,38(8):1113-1122(in Chinese)

[2]El-Shafai S A,El-Gohary F A,Nasr F A,et al.Chronic ammonia toxicity to duckweed-fed tilapia(Oreochromis niloticus)[J].Aquaculture,2004,232(1–4):117-127

[3]Hegazi M M,Hasanein S S.Effects of chronic exposure to ammonia concentrations on brain monoamines and ATPases of Nile tilapia(Oreochromis niloticus)[J].Comparative Biochemistry and Physiology C,2010,151(4):420-425

[4]Benli A C K,K?ksal G,?zkul A.Sublethal ammonia exposure of Nile tilapia(Oreochromis niloticusL.):Effectson gill,liver and kidney histology[J].Chemosphere, 2008,72(9):1355-1358

[5]Lushchak V I,Bagnyukova T V.Effects of different environmental oxygen levels on free radical processes in fish [J].Comparative Biochemistry and Physiology B,2006, 144(3):283-289

[6]Sheehan D,Meade G,Foley V M,et al.Structure,function and evolution of glutathione transferases:Implications for classification of non-mammalian members of an ancient enzyme superfamily[J].Biochemistry Journal, 2001,360(1):1-16

[7]Kim M,Ahn I Y,Cheonand J,et al.Molecular cloning and thermal stress induced expression of a pi-class glutathione S-transferase(GST)in the Antarctic bivalveLaternula elliptica[J].Comparative Biochemistry Physiology A,2009,152(2):207-213

[8]Arca P,Hardisson C,Suarez J.Purification of a glutathione S transferase that mediates fosfomycin resistance in bacteria,Antimicrob[J].Agents Chemother,1997,34(5): 844-848

[9]Hatton P J,Cummins I,Cole D J,et al.Glutathione transferase involved in herbicide detoxification in the leaves of Setaria faberi(giant toxtail)[J].Physiology Plant,1999, 105(1):9-16

[10]Ranson H,Rossiter L,Ortelli F,et al.Identification of a novel class of insect glutathione S-transferase involved in resistance to DDT in the malaria vectorAnopheles gambiae[J].Biochemistry Journal,2001,359(2):295-304

[11]Eaton D L,Bammler T K.Concise review of the glutathione S-transferases and their significance to toxicology[J]. Toxicological Sciences,1999,49(2):156-164

[12]Hayes J D,Flanagan J U,Jowsey I R.Glutathione transferases[J].Annual Review of Pharmacology and Toxicology,2005,45:51-88

[13]程煒軒,梁旭方,李觀貴,等.鱖魚兩種谷胱甘肽S-轉移酶基因 cDNA的克隆與分析[J].生態毒理學報, 2009,4(4):537-543 Cheng W X,Liang X F,Li G G.Molecular Cloning and sequence analysis of alpha-and rho-classes of glutathione S-transferases in Chinese perch(Siniperca chuatsi)[J].A-sian Journal of Ecotoxicology,2009,4(4):537-543(in Chinese)

[14]Angelucci S,Sacchetta P,Moio P,et al.Purification and characterization of glutathione transferase from the sea bass(Dicentrarchus labrax)liver[J].Archives of Biochemistry and Biophysics,2000,373(2):435-441

[15]Melgar-Riol M J,Nóvoa-Vali?as M C,García-Fernández M A,et al.Glutathione S-transferase from rainbow trout liver and freshly isolated hepatocytes:Purification and characterization[J].Comparative Biochemistry and Physiology C,2001,128(2):227-235

[16]張武肖,孫盛明,戈賢平,等.急性氨氮脅迫及毒后恢復對團頭魴幼魚鰓、肝和腎組織結構的影響[J].水產學報,2015,39(2):233-244 Zhang W X,Sun S M,Ge X P,et al.Acute effects of ammonia exposure on histopathology of gill,liver and kidney in juvenileMegalobrama amblycephalaand the postexposure recovery[J].Journal of Fisheries of China, 2015,39(2):233-244(in Chinese)

[17]Livak K J,Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))method[J].Methods,2001,25(4): 402-408

[18]Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Analytical Biochemistry,1976,72:248-254

[19]Gehringer M M,Shcphard E G,Downing T G,et al.An investigation into the detoxification of microcystin-LR by the glutathione pathway in Balb/c mice[J].International Journal of Biochemistry＆ Cell Biology,2004,36(5): 931-941

[20]Dirr H,Reinemer P,Huber R.X-ray crystal structures of cytosolic glutathione S-transferase.Implications for protein architecture,substrate recognition and catalytic function[J].European Journal Biochemistry,1994,220(3): 645–661

[21]Fu J,Xie P.The acute effects of microcystin LR on the transcription of nine glutathione S-transferase genes in common carp,Cyprinus carpioL[J].Aquatic Toxicology, 2006,80(3):261-266

[22]Edwerds R,Dixon D P,Walbot V.Plant glutathione S-transferases enzymes with multiple functions in sickness and in health[J].Trends in Plant Science,2000,5(5): 193-198

[23]Kosenko E,Venediktova N,Kaminsky Y.Sources of oxygen radicals in brain in acute ammonia intoxication in vivo[J].Brain Research,2003,981(1–2):193–200

[24]Hegazi M M,Attia Z I,Ashour O A.Oxidative stress and antioxidant enzymes in liver and white muscle of Nile tilapia juveniles in chronic ammonia exposure[J].Aquatic Toxicology,2010,99(2):118-125

[25]Sun H,Wang W,Li J,et al.Growth,oxidative stress responses,and gene transcription of juvenile bighead carp (Hypophthalmichthys nobilis)under chronic-term exposure of ammonia[J].Environmental Toxicology Chemis-try,2014,33(8):1726-1731

[26]李磊,蔣玫,沈新強,等.Cr(VI)對脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)幼蝦暴露和恢復期肝胰臟的SOD活性、MDA及MTs含量的影響[J].生態毒理學報,2014, 9(6):1226-1231 Li L,Jiang M,Shen X Q,et al.Effects of Cr(VI)exposure and recovery on the SOD activities,contents of MDA and MTs in hepatopancreas tissue of juvenileExopalaemon carinicauda[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2014,9 (6):1226-1231(in Chinese)

[27]胡毅,黃云,鐘蕾,等.氨氮脅迫對青魚幼魚鰓絲Na+/ K+-ATP酶、組織結構及血清部分生理生化指標的影響[J].水產學報,2012,36(4):538-545 Hu Y,Huang Y,Zhong L,et al.Effects of ammonia stress on the gill Na+/K+-ATPase,microstructure and some serum physiological-biochemical indices of juvenile black carp(Mylopharyngodon piceus)[J].Journal of Fisheries of China,2012,36(4):538-545(in Chinese)

[28]蔣玫,李磊,沈新強,等.慢性氨氮脅迫對鯔魚(Mugil cephalus)幼魚組織細胞免疫指標的影響研究[J].海洋與湖沼,2014,45(3):529-535 Jiang M,Li L,Shen X Q,et al.Effect of ammonia stress on immunity indicators of juvenileMugil cephaus[J]. Chinese Journal of Oceanology and Limnology,2014,45 (3):529-535(in Chinese)

[29]瞿春梅,梁旭方,張進,等.日本沼蝦mu型可溶性谷胱甘肽S-轉移酶的克隆與表達[J].華中農業大學學報, 2013,32(2):103-108 Qu C M,Liang X F,Zhang J,et al.Molecular cloning and in vivo expression analysis of mu-class soluble glutathione S-tranferase in shrimp[J].Journal of Huazhong Agricultural University,2013,32(2):103-108(in Chinese)

[30]Konishi T,Kato K,Araki T,et al.Molecular cloning and characterization of alpha-class glutathione S-transferase genes from the hepatopancreas of red sea bream,Pagrus major[J].Comparative Biochemistry Physiology C,2005, 140(3-4):309-320

[31]Lee Y M,Lee K W,Park H,et al.Sequence,biochemical characteristics and expression of a novel Sigma-class of glutathione S-transferase from the intertidal copepod,Tigriopus japonicuswith a possible role in antioxidant defense[J].Chemosphere,2007,69(6):893-902

Molecular Cloning,Characterization and mRNA Expression of Mu-typ Glutathione S-Transferases from Megalobrama amblycephala

Sun Shengming1,Zhu Jian1,*,Ge Xianping1,Zhang Chengfeng1,Miao Linghong1,Zhang Wuxiao2, Zhang Qiong2
1.Freshwater Fisheries Research Center,Chinese Academy of Fishery Sciences,Wuxi 214081,China
2.Wuxi Fishery College,Nanjing Agricultural University,Wuxi 214081,China

9 March 2015 accepted 9 June 2015

Glutathione S-transferases(GSTs)play an important role in cellular detoxification and may have evolved in protecting cells against reactive oxygen metabolites.In this study,we report the molecular characterization of glutathione S-transferase(MaGST)from Bluntnose black breamMegalobrama amblycephala.The full-length cDNA of MaGST was 1 011 bp in length containing an open reading frame of 654 bp that encoded a 218-amino acid pu-tative protein.Its derived amino acid sequence was clustered with other vertebrate mu-type GSTs in a phylogenetic tree(NJ).Quantitative real-time RT-PCR analysis showed that mRNA expression of MaGST was detected in all tissues,including the brain,liver,muscles,gills,spleen,and intestines,with the highest level of expression in the liver and gill,the lowest expression in the muscles.Exposure to waterbrone ammonia significantly increased the mRNA expression of MaGST(P＜0.05)in liver and gill,respectively.Fish exposed to waterbrone ammonia also showed liver and gill tissue damage in 24 h.To further characterize the catalytic properties of this enzyme along with MaGST, we constructed the recombinant MaGST plasmid with a 6×His-Tag at the N-terminal of MaGST cDNA.Recombinant MaGST was highly expressed in transformedEscherichia coli,and its soluble fraction was purified by His-Tag affinity column chromatography.The GST activity of the recombinant MaGST was(10.36±0.68)U·mg-1protein.Overall,the results suggest a potential role for MaGST in detoxification and possibly conferring immune protection.

ammonia exposure;Megalobrama amblycephala;glutathione S-transferase;cloning

2015-03-09 錄用日期:2015-06-09

1673-5897(2016)1-295-11

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150309010

孫盛明,朱健,戈賢平,等.團頭魴谷胱甘肽S-轉移酶基因的克隆及其在氨氮脅迫中的表達分析[J].生態毒理學報,2016,11(1):295-305

Sun S M,Zhu J,Ge X P,et al.Molecular cloning,characterization and mRNA expression of mu-typ glutathione S-transferases fromMegalobrama amblycephala[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(1):295-305(in Chinese)

中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金(2015C06XK01)；國家大宗淡水魚類產業技術體系華東養殖崗位(CARS-46-14)；十二五國家科技支撐計劃“長江下游池塘高效生態養殖技術集成與示范”(2012BAD25B07)

孫盛明(1983-),男,博士,助理研究員,研究方向為水生動物生理學,E-mail:sunsm@ffrc.cn；

),E-mail:zhuj@ffrc.cn

簡介:朱健(1968—)，男，研究員，主要從事水產健康養殖研究。