辣蓼總黃酮超聲波輔助提取條件優化研究

張 晶，黃士文，徐紹清，田 方，倪 穗*

(1.寧波大學 海洋學院，浙江 寧波 315211；2.慈溪市橫河鎮農業辦公室，浙江 慈溪315318；3.慈溪市農業局，浙江 慈溪 315318；3.寧波市缸鴨狗健康食品與生物技術研究所，浙江 寧波 315205)

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辣蓼總黃酮超聲波輔助提取條件優化研究

張 晶1，黃士文2，徐紹清3，田 方4，倪 穗1*

(1.寧波大學 海洋學院，浙江 寧波 315211；2.慈溪市橫河鎮農業辦公室，浙江 慈溪315318；3.慈溪市農業局，浙江 慈溪 315318；3.寧波市缸鴨狗健康食品與生物技術研究所，浙江 寧波 315205)

目的：優化超聲波輔助法提取辣蓼黃酮類化合物的工藝條件。方法：實驗從超聲溫度、料液比、乙醇濃度和超聲時間四個方面對黃酮類化合物的提取效果進行了探討，通過單因素試驗確定提取黃酮類化合物的較優水平，再結合正交試驗確定辣蓼全草中黃酮類化合物的最優提取工藝。結果和結論：經研究所得工藝的最佳參數為：乙醇濃度60%，料液比1∶45，超聲溫度50 ℃，提取時間50 min。在此工藝條件下得到黃酮類化合物含量為55.8 mg/g。由此證明辣蓼中黃酮類化合物能夠利用超聲波輔助法來方便有效地提取。

辣蓼；黃酮類化合物；超聲波；提取工藝

辣蓼，又名水蓼(PolygonumhydropoperL.)，是蓼科(Polygonum)蓼屬(PolygonumL.)一年生草本植物，直立或下部伏地，有須根，葉呈卵圓形或披針形，互生[1]。辣蓼主要分布在東南亞地區，生長在水邊潮濕的地方[2]，在我國各地均有分布，而浙江全省分布的較為廣泛，野生資源豐富。辣蓼全草味辛，中國及東南亞等許多國家已把辣蓼列入到食品添加劑中，它可以用來增加食物的風味。辣蓼還是我國傳統的藥材，許多古醫書中對其藥理功能都有過記載，具有化濕、行滯、祛風、消腫的功效[3]。臨床研究發現，辣蓼有抑菌、消炎、抗病毒、抗氧化、抑腫瘤、鎮痛止血等功效，黃酮類化合物是其主要的生物活性成分[4-6]。黃酮類化合物有強抗氧化活性，清除人體內部自由基，被廣為研究和應用[7]。Haragehi[8]等研究發現辣蓼葉的水溶性組分中具有黃酮苷和黃酮苷元類物質，主要成分為異槲皮苷，槲皮素，7,4-二甲基榭皮素，和3-甲基槲皮素；Zhao[9]等從辣蓼葉中分離鑒定出10中黃酮類化合物，其中6種為黃酮醇類化合物，4種為黃酮苷類化合物，經電子自旋共振譜技術(ESR)和UV-Vis 分析法鑒定出這10種物質含有較強的抗氧化結構，經抗氧化實驗發現，2''-O-(3,4,5-三羥基苯酚) 槲皮苷抗氧化能力最強。Chan[10]等對東南亞藥用植物抑菌活性和抗氧化活性進行研究時發現，辣蓼的水煮液具有強抗氧化性。林燕文[11]對2種蓼科植物進行體外抑菌實驗，探究發現辣蓼水煮液對革蘭氏陽性菌(枯草芽胞桿菌和金黃色葡萄球菌)、革蘭氏陰性菌(大腸埃希菌)均有不同的抑制效果，對黑曲霉、青霉、釀酒酵母這些真菌沒有抑制效果。

近年來關于辣蓼中黃酮的提取研究漸有報道，主要提取方法有回流浸提法、超聲波和微波提取法[12-15]。傳統的回流提取法耗時長，不利于工業化生產，超聲波技術提取天然產物中的黃酮類化合物是目前應用最為廣泛的一種新方法，超聲波提取辣蓼中黃酮的研究報道較少。本研究旨在應用超聲波輔助法對辣蓼黃酮的提取進行工藝優化，對工業化生產辣蓼中黃酮類化合物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

辣蓼：于2014年10月采自浙江寧波慈溪市楊梅村，洗凈，自然晾干，粉碎，過40目篩，保存于-20℃中。

試劑：蘆丁(Rutinu) 購買于上海源葉生物科技有限公；亞硝酸鈉(NaNO2)，硝酸鋁[Al(NO3)3]，氫氧化鈉(NaOH)，乙醇等均為分析純。

儀器：高速中藥粉碎機；超聲波清洗儀：寧波新芝 SB-5200；紫外分光光度計：北京普析tu-1810；分析天平：梅特勒多利多AM104，臺式離心機：湘儀 L600。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線的繪制

以蘆丁為標樣采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定黃酮化合物[15-17]。精密稱取稱取蘆丁標準品10 mg，精確到0.000 1g，加入一定量的乙醇溶液，置于水浴鍋中微熱使其溶解，冷卻后用60%的乙醇水溶液定容至50 mL，搖勻，得蘆丁標準溶液(0.2 mg/mL)，備用。

準確吸取蘆丁標準溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL于10 mL容量瓶中，在避光條件下，加入5%的NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min后加入10% 的Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min， 最后加入4.0 mL 1 mol/L 的NaOH 溶液，用60%的乙醇溶液補齊至刻線，搖勻。于避光處靜置15 min，在510nm下測定吸光度，并繪制標準曲線。

1.2.2 單因素試驗

采用超聲波輔助法對辣蓼中黃酮類化合物進行提取，研究不同超聲溫度、料液比、乙醇濃度、超聲時間4個因素對黃酮類化合物提取效果的影響。

1.2.3 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，對所用的四個因素設計正交試驗，以確定超聲波輔助法的最佳工藝條件。

1.2.4 乙醇浸提法

在最佳超聲條件下，不采用超聲波輔助技術，用乙醇直接浸提。以確定超聲波輔助法的優勢。

1.2.5 超聲波法提取辣蓼中總黃酮及含量測定

1) 工藝流程

辣蓼粉末→按照一定的料液比加溶劑浸潤→在一定條件下超聲處理→離心過濾→定容→樣品測定

2) 辣蓼黃酮的提取與測定方法

準確稱取3.0 g辣蓼粉末，于150 mL錐形瓶中，按照一定的料液比加入乙醇溶液，在一定條件下進行超聲波輔助提取，提取液經離心過濾，將濾液轉移到250 mL容量瓶中，定容，靜置得待測液。準確吸取1.0 mL待測液于10 mL容量瓶中，按照1.2.1繪制蘆丁標準曲線過程中，化學試劑的加入方法，在510 nm處定其吸光度，每組重復3次提取實驗。利用標準曲線回歸方程計算得提取液中黃酮類化合物含量。

黃酮計算公式：黃酮類化合物含量(mg/g)=nCV/(m×1000)

式中：C—從標準曲線上得到的蘆丁的濃度(mg/L)；

n—提取液的稀釋倍數；

V—提取液體積(mL)；

m—樣品質量(g)。

2 結果與分析

2.1 黃酮標準曲線

以蘆丁為標準品，測得標準曲線(見圖1)，由圖1可以看出R2達到0.999 5，說明本實驗結果精確度高，在實驗室條件下得出的標準曲線是準確可信的。

圖1 黃酮標準曲線

2.2 單因素試驗

2.2.1 料液比對黃酮提取的影響

按照1.2.5的試驗方法，選擇不同的料液比(1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45，1∶50)，在超聲溫度為30 ℃，乙醇濃度為60%，超聲30 min的條件下，對比黃酮類化合物提取效果，以選取合適的料液比。

圖2 料液比對提取黃酮提取的影響

如圖2所示，隨著料液比的增大，黃酮提取率增加，當料液比為1∶50時，辣蓼中黃酮提取最充分。從圖2可見，在料液比1∶30～1∶50范圍內，黃酮的提取量增加緩慢，但料液比過大，增大溶劑用量的同時，在生產上還會影響黃酮提取液的濃縮。因此，采用1∶40的料液比比較合理。

2.2.2 乙醇濃度對黃酮提取的影響

按照1.2.5的試驗方法，選擇不同的乙醇濃度(20%，40%，60%，80%，100%)在料液比為1∶20，超聲溫度為30 ℃，超聲30 min的條件下，對比黃酮類化合物提取效果，以選取合適的乙醇濃度。

由圖3可知，隨著乙醇濃度的升高，辣蓼黃酮的提取量增加，但當乙醇濃度達到60%后，其提取量不增反降?？赡苁请S著乙醇濃度增加，提取液中一些色素等醇溶性成分增多，干擾黃酮類物質的檢測，或與乙醇反應應，從而導致黃酮類化合物提取效果下降[18-19]。故，60%的乙醇作為溶劑最為合適。

圖3 乙醇濃度對提取黃酮提取的影響

2.2.3 超聲溫度對黃酮提取的影響

按照1.2.5的試驗方法，選擇不同的超聲溫度(20 ℃，30 ℃，40 ℃，50℃，60 ℃)，在料液比為1∶20，乙醇濃度為60%，超聲30 min的條件下，對比黃酮類化合物提取效果，選取合適的溫度。

圖4 超聲溫度對提取黃酮提取的影響

由圖4可見，提取溫度的升高，導致黃酮提取量先增加后減少，在50 ℃時黃酮類物質量最高，超過50 ℃時，黃酮類物質含量反而降低，這可能是由于，溫度過高會破壞一些黃酮類化合物的結構，并且溫度升高，一些醇溶性雜質成分增加，從而影響黃酮類物質的提取[19]。所以提取溫度在50 ℃為最適。

2.2.4 超聲時間對黃酮提取的影響

按照1.2.5的試驗方法，選擇不同的超聲時間(20 ℃，30 ℃，40 ℃，50 ℃，60 ℃)，在料液比為1∶20，乙醇濃度為60%，超聲溫度為30 ℃的條件下，對比黃酮類化合物提取效果，以選取合適的超聲時間。

由圖5可知，在一定時間范圍內，提取越久，辣蓼黃酮類物質的量越多。但超過50 min后，黃酮類物質的提取量有所下降?？赡苁且恍S酮類物質結構不穩定，時間久被破壞，加之有溶出雜質，對黃酮類物質的量有影響[19-20]。因此，最佳提取時間應為50 min。

圖5 超聲時間對提取黃酮提取的影響

2.3 正交實驗

在單因素試驗基礎上，對乙醇濃度、料液比、超聲溫度和時間4個因素進行L9(34)正交試驗設計。正交因素水平見表1，試驗結果及極差分析見表2。

表1 正交實驗因素水平表

表2 正交實驗及結果分析表

由表2可知，選擇各因子在同一水平下的平均試驗指標之和k最高的為最優水平，得出超聲波對提取辣蓼中黃酮類化合物效果的影響從大小依次為：C>A>D>B。最佳條件是：乙醇濃度60%，料液比1∶45，超聲溫度50 ℃，提取時間50 min。即提取工藝組合A2B3C2D2。

由方差分析表3可知，3個因素，即超聲溫度乙醇濃度和超聲時間達到極顯著水平(P<0.001)料液比對水平不顯著(P=0.182)，說明超聲溫度，乙醇濃度和超聲時間3個因素對辣蓼黃酮類化合物的提取有顯著影響，料液比對黃銅類化合物的影響不顯著，因此在考慮經濟的條件下，可以選擇1∶35的料液比。由表4可知在超聲溫度、乙醇濃度、超聲時間各水平之間存在顯著差異，在料液比因素中，B2和B3之間差異不顯著。

表3 方差分析表

表4 正交試驗Duncanny's多重比較

注：大寫字母不同表示水平之間存在顯著差異，相同則表示水平之間差異不顯著。

2.4 驗證試驗

由上述正交試驗結果可知， A2B3C2D2組合為最優，按照最優組合，進行3次重復驗證試驗。

表5 辣蓼中黃酮提取試結果驗證

由表5可知，在A2B3C2D2組合的條件下，黃酮含量平均為55.8 mg/g。

2.5 乙醇浸提試驗

在上述正交試驗得出最佳A2B3C2D2組合下，不采用超聲波輔助，直接進行浸提，進行3次重復試驗。

表6 乙醇浸提法黃酮含量

由表6可知在常規的乙醇浸提條件下，黃酮類化合物的含量為28.4 mg/g。

3 討 論

(1)單因素試驗和正交試驗的結果表明，超聲波輔助法對提取辣蓼黃酮類化合物影響大小為：乙醇濃度>超聲溫度> 料液比>超聲時間。提取的最佳超聲條件是：乙醇濃度為60%，料液比為1∶45，提取時間為50 min，超聲溫度為50℃。在此工藝條件下可提取得到黃酮類化合物的含量為55.8 mg/g。

(2)超聲波輔助法得到的黃酮類化合物的含量，是相同條件下乙醇浸提法含量的2倍。比王振堂等[12]用乙醇回流法得到46.4 mg/g蓼實總黃酮和楊家凱等[20]采用高速勻漿法得47.5 mg/g辣蓼總黃酮要高。這與蔡玲等[15]利用超聲波法得到水蓼中的總黃酮的量為38.2 mg/g,并高于傳統回流法的提取率。并且本試驗進一步驗優化了超聲波輔助提取辣蓼黃酮類化合物的工藝條件。

采用超聲波輔助法可以有效提取辣蓼中黃酮類化合物，并且具有高效、環保、節能等優點，可以用于后續辣蓼中黃酮類化合物的應用及研究中。

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Ultrasonic Technology for Extracting Flavonoids fromPolygonumhydropoper

Zhang Jing1, Huang Shiwen, Xu Shaoqing3, Tian Fang4, Ni Sui1*

(1. School of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211, China; 2. Cixi Agricultural office of Henghe, Cixi 315318, China; 3. Cixi Forestry Technology Extension Centre of Zhejiang, Cixi 315300,China; 4. Research Institute of Gang Yagou Healthy Food and Biotechnology, Ningbo 315205, China)

Flavonoids are one of the main active ingredients inPolygonumhydropoper. The ultrasonic extraction technology was studied to extract the flavonoid compounds from whole plant ofPolygonumhydropoper. The influence of extract time, solid-to-liquid ratio, ethanol concentration, and temperature were analyzed. The optimum levels were analyzed through single-factor test and orthogonal experiment. The optimum extraction technology was as follows: ethanol concentration 60%, solid-to-liquid ratio 1∶45, temperature 50 ℃, extraction time 50 min. Under these technological conditions, the content of the extraction was 55.8 mg/g. Ultrasonic extraction technology could facilitate the efficient extraction of total flavonoids fromPolygonumhydropoper.

Polygonumhydropoper; flavonoid compounds; ultrasonic; extraction technology

10.3969/j.issn.1006-9690.2016.05.006

2016-03-28

寧波市科技富民項目(2015C10023)；慈溪市農業局農業科技項目(CN201417)。

張晶(1990—)，女，碩士研究生，研究方向:植物天然成分分析。E-mail:13857478403@163.com

R284.2

A

1006-9690(2016)05-0025-05

*通訊作者：倪穗，教授，研究方向:植物生物技術。