AFLP引物組合數對準確分析馬纓杜鵑遺傳多樣性的影響

沈德周 縱 丹 周安佩 顏璐茜 李 旦 何承忠,4

(1. 西南林業大學云南省高校林木遺傳改良與繁育重點實驗室，云南 昆明 650224; 2. 西南林業大學西南地區生物多樣性保育國家林業局重點實驗室，云南 昆明 650224; 3. 西南林業大學云南生物多樣性研究院，云南 昆明 650224;4. 西南林業大學西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點實驗室，云南 昆明 650224)

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AFLP引物組合數對準確分析馬纓杜鵑遺傳多樣性的影響

沈德周1,2縱 丹1,2周安佩1,2顏璐茜1,2李 旦3何承忠1,2,4

(1. 西南林業大學云南省高校林木遺傳改良與繁育重點實驗室，云南 昆明 650224; 2. 西南林業大學西南地區生物多樣性保育國家林業局重點實驗室，云南 昆明 650224; 3. 西南林業大學云南生物多樣性研究院，云南 昆明 650224;4. 西南林業大學西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點實驗室，云南 昆明 650224)

利用5、7、9、11和13對AFLP引物組合對4個居群馬纓杜鵑遺傳多樣性進行分析，探討不同引物組合數量對其遺傳多樣性參數指標的影響。結果表明：隨著引物組合數量的增加，紫溪山居群遺傳多樣性的各參數指標變化趨勢一致， 5對引物組合檢測結果略高于其他引物組合數，但差異不顯著，其余3個居群的變化規律不明顯；不同引物組合數量對居群間遺傳距離無顯著影響，UPGMA聚類結果完全相同。由此可見，選用5對引物組合對馬纓杜鵑進行遺傳多樣性分析就能夠提供較為準確的結果。

馬纓杜鵑；遺傳多樣性；AFLP標記；引物

馬纓杜鵑 (Rhododendrondelavayi)，又名馬纓花，杜鵑花科 (Ericaceae)，杜鵑屬，常綠灌木或小喬木，樹干直，最高可達12 m。葉革質，長圓狀披針形或長圓狀倒批針形，長7～16 cm，寬2～5 cm，側脈14～18對?；ㄐ蚨嗷芗?，有花10～20朵?；ㄝ嘈?，花冠鐘形，深紅色。蒴果長圓柱形?；ㄆ?—5月，果期9—11月。在我國廣布于云南全省及貴州西部，海拔1 200～3 000 m處，生長于常綠闊葉林或云南松林下，局部地區形成馬纓花純林[1]。馬纓杜鵑具有較高的觀賞、藥用價值和經濟價值[2-4]，吸引了眾多學者的研究目光。但馬纓杜鵑變種豐富，難以從形態學上加以鑒定區分[1]，同時存在著同名異物，同物異名的現象，對馬纓杜鵑良種的選育和繁育造成影響，不利于其大規模種植和加工利用[5-6]。因此，有必要對馬纓杜鵑群體間和種內不同個體的遺傳多樣性進行全面的調查研究，為其遺傳育種、種植資源收集及進一步的開發利用提供理論依據。

遺傳多樣性是指種內不同居群之間或同一居群內不同個體之間的遺傳變異總和，它是物種適應自然并發生進化的基礎[7]。而能夠反映生物個體或居群間基因組中某種差異特征的DNA片段，即DNA分子標記，可以直接反映基因組DNA之間的差異[8]。近年來，采用分子標記技術分析物種遺傳多樣性的報道有很多，而所使用的標記種類、標記數量、引物數量不盡相同，如Demeke等[9]在使用RAPD技術對蕓苔屬植物進行研究時認為，要充分反映其親緣關系，至少需要10對引物組合；陳新露等[10]認為至少13對引物組合才能使得RAPD分子標記的分析結果更加客觀；李潞濱等[11]認為，利用AFLP技術在以系統學關系分析為目的的研究中，尤其是對基因組較大的植物，應采用盡可能多的引物組合分析供試樣品。采用引物組合的數量不同，不僅在試驗成本方面存在差異，也對研究結果的準確性和不同結果之間的可比性評價帶來了一定的困擾。為此，本研究采用AFLP分子標記技術對馬纓杜鵑4個自然居群的遺傳多樣性水平進行檢測，探討在不影響試驗結果可靠性以及盡可能節省成本的情況下，可以準確揭示馬纓杜鵑遺傳多樣性水平的合理引物組合數，旨在為其群體遺傳學研究提供前期基礎，也能夠為其他物種遺傳多樣性的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的56份馬纓杜鵑樣本分別采自于紫溪山、馬雄山、板凳山和小營地4個自然居群 (表1)。每一居群的采樣數均為14份，單株間隔50 m以上，以避免采集到親緣關系較近的個體。在每一樣株上均采集位于植株中部且生長狀況良好的健康嫩葉6～8片，放入裝有變色硅膠的自封袋中干燥保存，帶回實驗室備用。

表1 供試4個馬纓杜鵑居群的基本概況

1.2 試驗方法

1.2.1 總DNA提取

采用改良的SDS法依照標準酚/氯仿流程提取分析樣本的基因組總DNA[12]，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計 (Spekol-1300) 共同檢測其濃度和純度，稀釋至50 ng/μL的濃度，于-20 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 AFLP體系建立

AFLP分析參照Vos等[13]的方法。使用EcoRI+MseI 2種限制性內切酶組合進行基因組DNA雙酶切，預擴增反應采用EcoR I+00/MseI+00引物組合，將預擴增產物稀釋20倍作為選擇性擴增DNA模板，選擇性擴增采用EcoR I+3/MseI+3引物組合共計15對，PCR擴增反應在PTC-100TMThermal PCR儀上進行。

1.2.3 電泳分離

選擇性擴增產物加入1/3體積的雙指示劑，于95 ℃變性5 min，隨后立即放置于冰水混合物中。取6 μL上樣于已預電泳30 min的6%變性聚丙烯酰胺凝膠中，70 W恒定功率電泳約2 h。電泳結束后采用銀染檢測法[14]進行AFLP顯色反應。

1.2.4 數據處理與分析

本研究從15對引物組合中隨機選取3對引物組合作為基數，在剩余的12對引物組合中，以隨機抽取的2對引物組合 (不重復抽取) 為單位從3對引物組合逐級遞增到13對，分別為5、7、9、11和13對，并設置3次重復。在電泳圖譜上對遷移率相同的條帶進行統計，有帶記為 “1”，無帶記為 “0”，形成0/1 矩陣。采用多態性信息含量 (polymorphism information content, PIC) 評價不同引物組合數量的標記效應，計算公式為 “PIC=∑PICi/N=∑2fi(1-fi)/N”[15]，其中 “PICi” 表示第 “i” 個標記的多態性信息含量，“fi” 表示擴增條帶 (記為 “1” 的條帶)的出現頻率， “1-fi” 表示無效帶 (記為 “0” 的條帶)的頻率， “N” 表示檢測到的多態性條帶數 (NPB)。應用POPGENE 1.32軟件對馬纓杜鵑4個自然居群的多態位點百分率 (PPB)、觀測等位基因數 (Na)、有效等位基因數 (Ne)、Nei′s基因多樣性指數 (H)、Shannon′s信息指數 (I)、Nei′s總基因多樣度 (Ht)、居群內基因多樣度 (Hs)、遺傳分化系數 (Gst)、基因流 (Nm)、以及4個居群間的Nei′s遺傳距離等遺傳參數進行分析，并應用SPSS 13軟件對不同引物組合數量的遺傳多樣性參數進行方差分析。采用MEGA 5.0軟件進行基于Nei′s遺傳距離的UPGMA聚類分析，構建聚類圖。

2 結果與分析

2.1 AFLP擴增結果

篩選出來的15對引物對4個居群56份馬纓杜鵑樣本的AFLP分析結果表明 (表2)，15對引物組合共擴增出1 142條帶，有效片段長度在75～580 bp之間，其中多態性條帶 (NPB) 806條，多態帶百分率 (PPB) 為70.58%，多態性信息含量 (PIC) 為0.304 6。不同引物組合擴增得到的多態帶數 (NPB) 各不相同，最高的出現在引物組合E32-M36中，達79條，而E38-M46、E58-M64、E64-M49這3對引物組合擴增得到的多態性條帶數較少，僅為29條；多態性條帶百分率最高的是引物組合E45-M54，為82.72%，最低的是引物組合E38-M46，為46.03%；多態性信息含量PIC值在不同引物組合間的變動范圍為0.255 2 (E53-M49)～0.370 6 (E32-M36)。平均每對引物擴增出的總條帶數為76.1條，多態性條帶為53.7條，多態性條帶百分率為69.65%，多態性信息含量為0.302 6。

表2 AFLP分析的引物組合及擴增結果

2.2 遺傳多樣性水平分析

有效等位基因數 (Ne) 和Nei′s基因多樣性指數(H) 是衡量物種遺傳變異常用的2個指標，具有明顯的遺傳學意義，而Shannon′s信息指數 (I) 本身沒有意義，但方便與同類研究進行比較[16-17]。利用POPGENE 1.32對不同引物組合數量的馬纓杜鵑遺傳多樣性參數進行分析，結果見表3。從物種水平來看，不同引物組合數量的多態位點百分率變化范圍為68.77% (11對引物組合) ～70.08% (5對引物組合)。Ne、H、I均是5對引物組合略高，分別為1.235 8、0.156 9和0.256 0，在9對引物組合中略低，依次為1.246 8、0.163 0和0.263 8。多態性信息含量 (PIC) 略有不同，在7對引物組合中最高，達0.329 5，5對引物組合次之，為0.319 9，9對引物最低，僅0.287 7。

表3 馬纓杜鵑4個居群的遺傳多樣性參數

從居群水平來看，不同引物組合數量遺傳參數變化趨勢也不相同，隨著引物數量的增加，4個居群所擴增的多態帶數也逐漸增加。紫溪山居群中， PPB、Ne、H、I變化趨勢一致，均在5對引物組合中最高 (50.10%、1.213 4、0.133 9和0.210 9)，多態性信息含量 (PIC) 則在7對引物組合中最高 (0.350 3)，它們在13對引物組合中最低 (47.41%、1.189 2、0.121 0、0.192 7，0.330 2)；板凳山居群中，PPB、Ne、H、I最低值均出現在5對引物組合中，多態性信息含量 (PIC) 最低值 (0.324 2) 則出現在11對引物組合中，除有效等位基因數 (Ne) 最高值出現在9對引物組合中， PPB、H、I、PIC最高值均出現在7對引物組合中，分別為54.31%、0.132 3、0.213 6和0.342 1；馬雄山居群中， PPB、Ne、H、I最大值均出現在5對引物組合中，分別為54.75%、1.216 8、0.139 4和0.222 4；最小值除Ne在7對引物組合中，其余均在9對引物組合中，分別為52.60%、0.126 1和0.203 9，而PIC的變動范圍為0.320 8～0.341 1，分別出現于13對引物組合和7對引物組合中；小營地居群中， PPB的最高值 (63.51%) 出現在11對引物組合中，最低值 (61.59%) 出現在5對引物組合中，Ne和H最高值 (1.286 5和0.179 4) 在5對引物組合中，最低值 (1.275 9和0.174 8) 在9對引物組合中，I則在11對引物組合中最高 (0.280 3)，最低值在9對引物組合中，為0.275 0， PIC的最高值 (0.372 5) 同前3個居群一樣，出現于7對引物組合中，最低值出現于9對引物組合 (0.355 6)。由此可見，相同引物組合數對不同居群遺傳多樣性參數的作用規律具有一定的差異性，但對多態性信息含量 (PIC) 的影響不明顯，且遺傳多樣性參數與引物組合的多態性信息含量之間無明顯的相關性。

此外，5、7、9、11和13對引物組合數量所得出的Nei′s總基因多樣度 (Ht) 依次為0.163 0、0.159 2、0.156 9、0.160 1、0.158 0；居群內基因多樣度 (Hs) 依次為0.145 6、0.142 3、0.139 6、0.142 6、0.140 0；居群間遺傳分化系數 (Gst) 分別為0.106 5、0.105 7、0.110 9、0.109 0、0.114 2，均表明馬纓杜鵑的遺傳變異主要存在居群內不同個體之間，居群間的遺傳變異僅占總變異的11%左右；居群間基因流 (Nm) 分別為4.198 8、4.229 9、4.021 9、4.088 4、3.883 9，表明馬纓杜鵑居群間基因交流頻繁。

進一步應用SPSS軟件對不同引物組合數量獲得的馬纓杜鵑遺傳多樣性參數進行方差分析，結果表明 (表4)，引物組合數量的增加對馬纓杜鵑遺傳多樣性參數 (PPB、Na、Ne、H、I、Ht、Hs、Gst、Nm) 的影響均不顯著 (P> 0.05)，表明使用5對引物組合就可以準確地對馬纓杜鵑的遺傳多樣性水平進行分析。

表4 馬纓杜鵑遺傳多樣性參數的方差分析

2.3 遺傳距離與聚類分析

對4個不同自然居群的馬纓杜鵑Nei′s遺傳距離分析結果表明(表5)，在5對引物組合中，遺傳距離的范圍為0.013 3～0.026 5；7對引物組合中，遺傳距離的范圍為0.015 0～0.027 5；9對引物組合中，遺傳距離的范圍為0.013 6～0.029 5；11對引物組合的遺傳距離范圍在0.013 8～0.030 3之間；13對引物組合的遺傳距離范圍在0.015 8～0.034 6之間。不同引物組合數所得的居群間遺傳距離與引物組合數之間無明顯相關性，但不同引物組合數揭示的居群之間遺傳關系完全一致，即紫溪山居群與板凳山居群之間的遺傳距離最小，表明二者之間的親緣關系較近，而紫溪山居群與小營地居群之間的遺傳距離最大，表明二者之間的遺傳差異較大。

表5 馬纓杜鵑居群間的遺傳距離

采用MEGA 5.0軟件進行基于居群間Nei′s遺傳距離的UPGMA聚類分析，構建不同引物組合數下的馬纓杜鵑4個居群聚類圖 (圖1)。由聚類圖可見，AFLP共計5組引物組合數的聚類分析結果完合一致，馬纓杜鵑4個居群可以劃分為2個大組，第I組由來自楚雄市的紫溪山居群和板凳山居群構成，第II組包含了來自曲靖市的馬雄山居群和小營地居群。

圖1 AFLP 5對引物組合數的基于Nei′s遺傳距離聚類圖

Fig.1 Dendrogram of AFLP five primer combinations based on Nei′s genetic distance

3 討 論

與其他同類型分子標記技術相比，AFLP標記通常能檢測到更多的條帶數目，多態性較高，一直以來都受到研究者的青睞，被不斷用于研究生物種群的遺傳結構、物種遺傳多樣性分析和系統進化等領域[18]。且相比其他標記，AFLP技術檢測效率高，很少的引物組合即可達到研究目的，因此研究者在對植物遺傳多樣性和系統進化進行研究時，依據研究目的的不同，選用的引物組合數量也不同[11]。閆志峰等[19]采用AFLP標記的8對熒光引物對10個野生種群共計129個黃檗 (Phellodendronamurense) 個體進行了遺傳多樣性分析，索風梅等[20]同樣也采用AFLP標記8對選擇性擴增引物對唐古特大黃 (Rheumtanguticum)、掌葉大黃 (Rheumpalmatum) 和藥用大黃 (Rheumofficinale) 的親緣關系進行了分析，而吳揚等[21]則選用3對AFLP引物對黃金茶 (Camelliasinensis) 群體的111個株系進行了遺傳多樣性分析。

應用于品種的區分時，由于AFLP技術的高效性，僅用少數幾對引物就可以達到研究目的。Cervera等[22]在對來自西班牙的67個葡萄 (Vitisvinifera) 品種進行AFLP分析時，使用2對引物就很好地解決了同名異物和同物異名的問題，Tignon等[23]采用AFLP技術對蘋果 (Maluspumila) 品種進行鑒別時，僅用1對AFLP引物組合就能夠鑒別28個待測蘋果品種。李潞濱等[11]選用10對AFLP引物組合對竹子系統關系進行研究結果表明，僅用1對引物組合就能區分出26個竹種的差異，且隨著引物數量的增加，26個供試竹種的聚類關系趨于一致。但應用于居群間和居群內個體遺傳多樣性的研究時，AFLP標記所用引物數量各不相同，季鵬章等[24]采用AFLP技術對云南南部及周邊地區狹隘分布的大理茶 (Camelliataliensis) 11個居群共204個個體進行遺傳多樣性分析，結果表明，僅選用2對引物組合擴增獲得的多態性條帶百分率達100%，檢測到大理茶的遺傳多樣性水平較低，且遺傳變異主要存在于居群內。陳良華等[25]采用4對多態性高、分辨力強的引物組合對4個四川核桃 (Juglusregia) 居群共46個樣品進行分析，結果表明群體內的遺傳多樣性大于群體間的遺傳多樣性。而黃驥[26]等選用7對AFLP引物組合對武陵山區蛇足石杉 (Huperziaserrata) 4個居群的遺傳多樣性進行分析，結果表明居群間遺傳多樣性有明顯差別。王東升等[27]在對山東省5個地區共62份紫椴 (Tiliaamurensis) 遺傳多樣性分析時，選用了9對AFLP引物組合，分析結果表明紫椴具有較高的遺傳多樣性。由此可見，種內遺傳多樣研究所選用的引物數量沒有統一的定論，選用引物數量較少時，會影響數據的判斷，產生較大的隨機誤差，選用引物數量較多，會增加工作量，造成非必要的時間與成本上的損失。本研究分別選取AFLP標記的5、7、9、11和13對引物組合對4個不同自然居群的馬纓杜鵑遺傳多樣性進行了分析，結果表明，隨著引物組合數的增加，AFLP分析結果無論在物種水平，還是在居群水平，馬纓杜鵑的遺傳多樣性參數差異均不顯著，且聚類分析結果完全一致，表明在采用AFLP分子標記技術進行馬纓杜鵑群體遺傳學分析時，選擇5對引物組合即可得到較為準確的分析結果。但將AFLP分子標記技術應用于不同物種的群體遺傳學分析時，適宜的引物組合數是否相同或存在差異，尚有待于進一步研究。

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(責任編輯 張 坤)

Effect of the Quantity of AFLP Primer Combinations on Accurately AnalyzingRhododendrondelavayiGenetic Diversity

Shen Dezhou1,2, Zong Dan1,2, Zhou Anpei1,2, Yan Luxi1,2, Li Dan3, He Chengzhong1,2,4

(1. Key Laboratory for Forest Genetic and Tree Improvement & Propagation in Universities of Yunnan Province, Southwest Forestry University,Kunming Yunnan 650224, China; 2. Key Laboratory of Biodiversity Conservation in Southwest China, State Forestry Administration,Southwest Forestry University, Kunming Yunnan 650224, China; 3. Yunnan Academy of Biodiversity, Southwest Forestry University,Kunming Yunnan 650224, China; 4. Key Laboratory for Forest Resources Conservation and Use in the Southwest Mountains of China,Ministry of Education, Southwest Forestry University, Kunming Yunnan 650224, China)

In order to investigate the effect of the quantity of primer combinations on genetic diversity parameters inRhododendrondelavayi, the amplified fragment length polymorphism (AFLP) was employed to test 4 natural populations ofRhododendrondelavayiwith 5, 7, 9, 11 and 13 AFLP primer combinations. The results showed that the genetic diversity parameters of Zixi Mountain population had same changing trends with the increase of primer combinations quantity, which indicated that the amplified resutls with 5 primer combinations were slightly higher than that with other primer combinations, but the differences were not significant. The changing trends of genetic diversity parameters in other 3 populations were not obvious. There was no significant effect on the genetic distance between populations and the cluster results were consistent based on unweighted pair group method analysis (UPGMA) with different numbers of primer combinations. So, it could be concluded that 5 primer combinations could provide accurate results ofR.delavayigenetic diversity.

Rhododendrondelavayi, genetic diversity, AFLP markers, primer

10. 11929/j. issn. 2095-1914. 2016. 06. 004

2015-12-14

云南省中青年學術與技術帶頭人后備人才培養項目 (2012HB021) 資助；西南林業大學云南省省級重點學科 (林學) 建設項目資助；西南林業大學大學生創新基金項目 (C15070) 資助；西南林業大學云南省高校林木遺傳改良與繁育重點實驗室開放基金項目 (YNGB201505) 資助。

何承忠 (1970—)，男，博士，教授。研究方向：林木遺傳育種與生物技術。Email: hcz70@163.com。

S718.46

A

2095-1914(2016)06-0022-07

第1作者：沈德周 (1992—)，男，碩士生。研究方向：林木遺傳育種及群體遺傳學。Email: 1244339480@qq.com。