響應曲面法優化石榴皮總黃酮提取工藝

鄧婷婷,李建華,肖本勝,鄭琦鍇,宋 陽

(湖北工程學院 生命科學技術學院， 湖北 孝感 432000)

?

響應曲面法優化石榴皮總黃酮提取工藝

鄧婷婷,李建華*,肖本勝,鄭琦鍇,宋 陽

(湖北工程學院 生命科學技術學院， 湖北 孝感 432000)

為獲得超聲波輔助提取石榴皮總黃酮的最佳工藝條件，在采用Plackett-Burman試驗篩選出影響石榴皮總黃酮提取量的關鍵因素，通過最陡爬坡試驗確定這些因素中心值的基礎上，用Design-Expert 8.0.6軟件中心復合試驗(Central Composite Design，CCD)模塊進行響應面分析。結果表明，初始溫度和提取時間在研究所設水平范圍內對石榴皮總黃酮提取影響不顯著；以石榴皮總黃酮提取量最大值作為優化目標，在室溫下提取10 min，得到石榴皮總黃酮最佳提取工藝條件為：液料比(mL/g)82：1，乙醇分數66%，超聲波功率154 W；在此條件下進行5次平行驗證試驗，總黃酮平均提取量為165.10 mg/g，達到理論預測值(171.22 mg/g)的96.42%，表明該工藝條件穩定可靠，提取率高，可作為從石榴皮中大規模提取總黃酮的參考。

石榴皮；總黃酮；響應曲面法；Design-expert軟件

本研究在運用Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗初步確定影響石榴皮總黃酮提取量的主要因素及其水平范圍的基礎上，運用響應曲面法優化石榴皮總黃酮超聲波輔助提取工藝，為簡便高效提取石榴皮總黃酮提供參考，為后續純化及測定總黃酮成分等研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮石榴采自湖北省孝感市楊店果園，將剝下的石榴皮置于60 ℃烘箱內干燥20 h，粉碎過40目篩備用；安捷倫 Cary 60 紫外-可見分光光度計(安捷倫科技有限公司)；循環水真空泵(SHZ-III型，上海亞榮生化儀器廠)；電子天平(PL203型，梅特勒-托利多儀器有限公司)；智能超聲波清潔器(DL-480B型，上海滬粵明科學儀器有限公司)；數顯恒溫水浴鍋(HH-4型，江蘇榮華儀器制造有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線回歸方程

植物提取物中總黃酮的測定一般采用亞硝酸鹽-硝酸鋁法[5-7]，但紫外分光光度法測定植物提取物中總黃酮更簡單、 準確[8]。本研究參考王靜等[10]的研究結果，以山奈酚為對照品，在265 nm波長下測定其吸光值，構建總黃酮含量標準曲線。具體的作法是：精確稱取3.4 mg山奈酚對照品，用20 mL甲醇超聲(功率：240 W，時間：5 min)溶解，得每1 mL含0.170 mg山奈酚的儲備液。分別精密吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL儲備液，用75%乙醇稀釋為10 mL，搖勻，配制成濃度梯度0.0085～0.051 mg/mL的山奈酚工作液，以 75%乙醇為空白對照，在265 nm處測定不同濃度山奈酚溶液的吸光值，建立標準曲線回歸方程。

1.2.2 總黃酮的提取與檢測

準確稱取石榴粉(過40目篩)0.5 g后，按設定的工藝參數進行超聲波提取和真空抽濾，得到石榴皮總黃酮提取液。用移液器準確量取5 μL石榴皮總黃酮提取液，置于10 mL具塞試管中，加5 mL 75%乙醇搖勻，在265 nm處測定吸光度，根據回歸方程和液料比，計算出每克石榴粉中總黃酮的提取量。

1.2.3 Plackett-Burman試驗設計

根據以往研究經驗，選取可能對超聲波法黃酮提取率有影響的5個因素(初始溫度、提取時間、液料比、乙醇分數、超聲波功率)，每個因素取兩個水平(低水平“-1”和高水平“+1”) 進行Plackett-Burman試驗設計，以確定顯著影響石榴皮總黃酮提取量的因素。需說明的是，由于在提取過程中超聲波清洗器中的水溫會不斷變化，不易測定，故將其初始溫度作為一個變量。表1為Plackett-Burman試驗因素水平及編碼。

1.2.4 最陡爬坡試驗設計

根據Plackett-Burman試驗的結果，選取顯著影響石榴皮總黃酮提取量的因素，分別以試驗值變化梯度方向為爬坡方向，以效應值的大小為最優步長，可得到最優提取條件下，響應面試驗設計的中心點。

表1 Plackett-Burman試驗因素水平

1.2.5 響應面試驗設計

綜上，在當前階段對于老年糖尿病并發神經痛患者實施優質化護理干預方式能夠提升患者的護理效果，改善患者的神經痛情況，提高患者的治療依從性。

利用Design-Expert 8.0.6軟件，根據最陡爬坡試驗結果進行中心復合試驗設計(Central composite design，CCD)，并對石榴皮中總黃酮的提取工藝參數進行響應面分析。

1.2.6 數據分析

運用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結果進行統計分析。

2 結果與分析

以山奈酚為標準品，在265 nm條件下試驗建立的標準曲線回歸方程為y=86.948x- 0.0024，其中y為吸光度，x為標準品濃度，該回歸方程線性決定系數R2= 0.9997，表明在試驗所用濃度范圍內，溶液中山奈酚含量與吸光值呈良好的線性關系。

2.1 Plackett-Burman試驗方案及試驗結果

Plackett-Burman試驗方案及試驗結果見表2，對表2中Plackett-Burman試驗各因素參數及試驗結果進行方差分析(表3)，構建回歸方程。

表2 Plackett-Burman試驗方案及試驗結果

表3 Plackett-Burman試驗方差分析

方差分析結果(表3)表明，在所研究的5個因素中，初始溫度和提取時間對石榴皮總黃酮提取量的影響不顯著(P>0.05)，在后續研究中將提取初始溫度和提取時間分別固定為室溫和10 min；而乙醇分數、超聲波功率和液料比對石榴皮總黃酮提取量的影響達到了顯著水平(P<0.05)，本研究選取這3個因素進行最陡爬坡和響應面試驗。由PB試驗構建的回歸方程為：

總黃酮=23.90071-0.030219×溫度-0.53428×時間+0.69441×液料比+0.80368×乙醇分數+0.44557×功率。

2.2 最陡爬坡試驗設計及結果

在上述5個因素對總黃酮提取量的回歸方程中，乙醇分數、超聲波功率、液料比的系數為正，故這三個因素應從低水平向高水平進行最陡爬坡試驗設計，并根據試驗設計在室溫下提取10 min(見表4)。

從表4可知，在第4組試驗條件下，石榴皮總黃酮提取量最大，因此應以第4組中各因素的試驗水平作為響應面試驗的中心點，即以液料比75:1，乙醇分數70%，超聲波功率134.4 W為響應面試驗設計的中心點。

表4 Plackett-Burman試驗方案及試驗結果

2.3 石榴皮總黃酮提取的響應面試驗設計及提取結果

在Plackett-Burman試驗以及最陡爬坡試驗的基礎上，以液料比A(mL/g)、乙醇分數B(%)、取整后的超聲波功率C(W)為設計參數，以提取總黃酮含量Y(mg/g)為響應值，設計響應面試驗，在室溫下提取10 min，可得實驗結果，試驗方案及結果見表5。

根據響應面試驗結果，通過Design-Expert 8.0.6軟件對表5中數據進行多元回歸擬合及方差分析，得到多元非線性回歸方程為：

Y=147.11+9.55A-4.89B+11.03C-1.99AB-1.36AC-12.19BC-2.48A2-6.88B2-18.38ABC-31.90AB2-2.68B3

式中，Y為石榴皮中總黃酮的提取量(mg/g)，多元回歸方程的方差分析結果見表6。

該回歸方程的決定系數(R2)為0.9898，說明該模型擬合度較好，所選試驗因子對響應值有較大的影響；F檢驗表明，模型F=70.4559，對應的P<0.0001，表明回歸模型達到極顯著水平，該模型有意義；失擬項F=0.8966，對應P=0.5042>0.05，表明該回歸方程沒有遺漏對響應值有顯著影響的項，即方程所含各項可對響應值的變化做出較全面的解釋。

2.4 響應曲面交互作用分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件得到的液料比、乙醇分數和超聲波功率兩兩之間交互作用的3D響應曲面如圖1所示。圖1中分別反應液料比與乙醇分數、液料比與超聲波功率、乙醇分數與超聲波功率交互作用的三個響應曲面均不呈球面，表明乙醇分數、液料比和超聲波功率兩兩之間存在著交互作用，即各因素在其他因素的不同水平上，對石榴皮總黃酮提取量的影響不同；但從響應曲面波動幅度看，反應液料比與乙醇分數、液料比與超聲波功率之間的交互作用不強，乙醇分數與超聲波功率間的交互作用較強；結合方差分析結果(表6)，在實際應用中應主要考慮乙醇分數與超聲波功率之間的互作效應以及液料比的主效應。

表5 響應曲面試驗方案及試驗結果

表6 多元回歸方程的方差分析

圖1 因素間的交互作用

2.5 最佳工藝確定與驗證

以石榴皮中總黃酮提取率最高為目的，以試驗所用液料比、乙醇分數和超聲波功率范圍為條件，用Design-Expert 8.0.6軟件進行優化預測，得到石榴皮總黃酮提取工藝的理論最優條件：液料比(mL/g)82:1，乙醇分數66%，超聲波功率154 W，其理論預測值為171.22 mg/g；為檢驗最優條件的可靠性，在此條件下進行5次平行試驗的總黃酮平均提取量為165.10 mg/g，與理論預測值相比，預測的準確率為96.42%，表明該模型的預測準確率較高。

3 結論

在所研究的可能影響石榴皮總黃酮提取率的5個因素中，液料比、乙醇分數和超聲波功率對石榴皮總黃酮提取率影響較大，初始溫度和提取時間在研究所設水平范圍內對石榴皮總黃酮提取影響不顯著。以液料比(mL/g)82:1，乙醇分數66%，超聲波功率154 W為工藝條件，在室溫下提取10 min，得總黃酮的平均提取量為165.10 mg/g。本工藝對提取溫度和提取時間不敏感，在室溫下提取10 min總黃酮的得率較高，對于從石榴皮中提取總黃酮具有一定的參考價值。

[1] 吳亞君，李洪濤，李東偉，等.不同石榴品種的花粉量和花粉生活力比較[J].河南農業科學，2015， 44(3): 115-118．

[2] 李國秀，李建科，馬文哲.三種來源的石榴多酚抗氧化活性比較[J].食品工業科技，2014，35(5):109-112．

[3] 周倩，孫立立，戴衍朋，等.石榴皮、石榴瓤及石榴籽的化學成分比較研究[J].中國中藥雜志，2013， 36(13):2159-2162．

[4] 宋成英，黃俊懿，封加福，等.對生物黃酮生物活性的綜述[J].化學工程與裝備，2013，(4):128-130．

[5] 唐麗麗，劉鄰渭，龍明華.正交試驗法優化石榴皮總黃酮的提取工藝[J].陜西農業科學 2015，61(9):29-33．

[6] 喬清亮，劉利林.石榴皮、石榴渣總黃酮含量的測定[J].新疆畜牧業，2015， (5):18-20．

[7] 羅群，李潔，黃春萍.石榴皮總黃酮超聲波提取工藝的優化[J].南方農業學報，2013，44(9):1529-1533．

[8] 王靜，薛培鳳，趙子龍，等. 紫外分光光度法測定蒙藥玉簪花中總黃酮的含量[J].內蒙古醫科大學學報，2013，35(2):93-95．

(責任編輯：熊文濤)

Optimized Extraction Process of Total Flavonoids from Pomegranate Peel by Response Surface Methodology

Deng Tingting, Li Jianhua*, Xiao Bensheng, Zhen Qikai, Song Yang

(SchoolofLifeandScienceTechnology,HubeiEngineeringUniversity,Xiaogan,Hubei432000,China)

This paper investigated the optimum technological conditions for extracting total flavonoids from pomegranate peel by ultrasound-assisted extraction process. Key factors were selected by Plackett-Burman design, which could influence total flavonoids extraction efficiency from pomegranate peel . Steepest ascent experiment was conducted to determine the optimal level of these factors. The response surfaces were delineated based on the central composite design model in Design-Expert 8.0.6 software. The results showed that the initial temperature and extraction time had no significant effect on the extraction of total flavonoids from pomegranate peel within the scope of the research institute. Extraction at room temperature for 10 min, the optimum extraction conditions were determined to maximize the extraction of total flavonoids from pomegranate peel: the liquid-to-solid ratio (mL/g), the proportion of ethanol and the ultrasonic power was 82:1, 65% and 154 W, respectively. Under this condition, 5 parallel verification tests were carried out and the average value of total flavonoids extraction (165.09 mg/g) reached 96.42% of the theoretical prediction value (171.22 mg/g). It showed that the process was reliable with higher extraction rate, so it could be used as a reference to extract the total flavonoids from pomegranate pee on large scale.

pomegranate peel; total flavonoids; response surface analysis; design-expert software

2016-08-11

湖北省大學生創新創業訓練計劃項目(201610528005)；湖北省教育科學規劃2015年度立項課題(117)

鄧婷婷(1995- )，女，湖北松滋人，湖北工程學院生命科學技術學院學生。

李建華(1969- )，男，湖北孝感人，湖北工程學院生命科學技術學院教授，博士，本文通信作者。

R284.2

A

2095-4824(2016)06-0020-05