豬多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

林躍華

（福建省漳州市農業局漳州市動物疫病預防控制中心，福建漳州363000）

豬多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

林躍華

（福建省漳州市農業局漳州市動物疫病預防控制中心，福建漳州363000）

從福建省某豬場發生以呼吸道病為主要特征的病死豬臟器中分離到1株可疑菌，通過細菌分離和純培養、涂片鏡檢、生化試驗、小鼠致死性試驗、藥敏試驗，并設計1對檢測豬多殺性巴氏桿菌的引物，對可疑菌做PCR檢測。結果表明，可疑菌對小鼠有致死毒力；PCR檢測結果與生化鑒定結果符合，可疑菌為豬多殺性巴氏桿菌；藥敏試驗檢測結果顯示，該菌對先鋒霉素Ⅴ、阿米卡星、氟哌酸、氯霉素和慶大霉素高度敏感。

多殺性巴氏桿菌；分離鑒定；PCR；藥敏試驗

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida,Pm）對多種動物均有致病性，屬于巴氏桿菌科，主要使動物發生傳染性肺炎或出血性敗血癥，感染豬后引起豬肺疫和豬傳染性萎縮性鼻炎，是誘發豬呼吸道病綜合征的重要致病因子之一，豬傳染性萎縮性鼻炎主要是由產毒素多殺性巴氏桿菌或支氣管敗血波氏桿菌（主要是D型）引起的，而豬肺疫一般是由非產毒素多殺性巴氏桿菌引起的。該菌正常存在于多種動物的口腔和咽部黏膜，當動物處于應激狀態和機體抵抗力下降時細菌大量繁殖并致病，發生內源性感染[1]，可與豬偽狂犬病、豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌病、豬喘氣病等發生混合感染或繼發感染[2]。近年來，福建地區部分規模養殖場受多殺性巴氏桿菌與其他病毒和細菌混合感染和繼發感染的侵害呈逐年上升趨勢，為此，本次對福建地區的多殺性巴氏桿菌進行了分離鑒定、PCR檢測及藥物敏感性等試驗，為該區域的豬群體感染多殺性巴氏桿菌病的治療和預防提供參考。

1 材料

1.1 病料來源及試驗時間、地點

2015年10月份，福建省某豬場的臨床患病小豬，以10%甘油生理鹽水浸潤棉簽采集鼻腔深部的分泌物，解剖病危小豬，采集肺臟、氣管和淋巴結做病原診斷。本次試驗的地點為福建省漳州市動物疫病預防控制中心，試驗時間為2015年10—11月。

1.2 試劑與試驗動物

化學藥品主要有：胰蛋白大豆瓊脂（TSA），革蘭氏染料，瑞氏染料，糖發酵管和藥敏試紙均購自杭州微生物試劑有限公司。

參照文獻[3-4]設計如下1對引物，該引物擴增片段為457 bp，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。P1：5'-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3'；P2：5'-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3'。

Taq DNA聚合酶及PCR相關試劑購自TaKaRa。

豬巴氏桿菌陽性標準菌株（C48-1菌株）由四川農業大學動物檢疫實驗室保存并提供。

試驗健康雌性小鼠（體重20 g左右）20只，購自福建農林大學。

2 方法

2.1 病原分離培養及純化

將采集的小豬鼻腔分泌物棉拭子及肺臟、氣管無菌條件下分別接種于胰蛋白大豆瓊脂平板上，于37℃溫箱中培養18～24 h后觀察。挑取直徑1～2 mm，光滑、濕潤、透明的單個菌落進行革蘭氏染色和瑞氏染色，于37℃溫箱中培養18～24 h。對革蘭氏染色為紅色的細小桿菌及瑞氏染色為兩極濃染的細菌為可疑菌落，對其傳代純化，進一步做生化鑒定、PCR鑒定、小鼠致死試驗、藥敏試驗。

2.2 生化試驗

對純化好的可疑細菌進行生化試驗：葡萄糖、果糖、甘露醇、麥芽糖、乳糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、吲哚、硝酸鹽、MR、VP，觀察結果。

2.3 PCR檢測

2.3.1 PCR模板用接種環挑取可疑菌落和豬巴氏桿菌陽性標準菌株（C48-1菌株），分別懸浮于含50 μL無菌水的離心管中，100℃水煮5～10 min，然后迅速置于冰上冷卻5 min，10 000 r/min離心2 min，分別取上清液為PCR模板。

2.3.2 PCR反應體系采用25 μL的反應體系：10×Taq緩存液2.5 μL，25 mmol/L dNTPs 0.5 μL，20 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，無菌水10 μL，模板10 μL。

2.3.3 PCR反應條件95℃反應5 min；95℃30 s，56℃30 s，72℃40 s，進行35個循環；最后72℃延伸10 min，產物于8℃短時間保存。

2.3.4 PCR結果取反應產物各10 μL，于含EB的10 g/L瓊脂糖凝膠中，90 V電泳30 min，然后在紫外線下觀察。

2.4 紙片擴散法藥敏試驗

對純化好的可疑細菌進行藥物敏感性試驗，操作方法和判定標準參照杭州天和微生物試劑有限公司的操作方法與標準。藥敏紙片包括：氨芐青霉素、先鋒霉素Ⅴ、阿米卡星、卡那霉素、鏈霉素、氟哌酸、四環素、妥布霉素、氯霉素、紅霉素、慶大霉素、復方新諾明。

2.5 小鼠致死性試驗

將可疑菌落接種于TSA平板培養24 h，純化檢驗合格后，用PBS液洗脫菌苔，并稀釋至1010CFU/mL，稀釋菌液超聲波破碎3次，每次10 s，破碎產物12 000 r/min，離心30 min，上清液依次通過0.45 μm和0.22 μm細菌過濾器過濾，進行平板計數。將上述小鼠隨機分為試驗組和對照組，每組5只，對試驗組每只小鼠分別腹腔注射0.5 mL稀釋菌液，同時對對照組每只小鼠腹腔注射0.5 mL生理鹽水，72 h內觀察小鼠死亡情況，并解剖病死小鼠，觀察其病理變化，采集心、肺等病料組織涂片，分離細菌并鑒定。

3 結果與分析

3.1 細菌分離純化及染色鏡檢

經培養18～24 h，胰蛋白大豆瓊脂平板上長出針尖大小、露珠狀、透明的菌落，革蘭氏染色鏡檢為紅色、兩極濃染的短小桿菌，多單個存在；瑞氏染色鏡檢為藍色、兩極明顯濃染的短小桿菌，見圖1。

3.2 生化試驗結果

純培養物能發酵葡萄糖、果糖、甘露醇、麥芽糖，產酸不產氣；不發酵麥芽糖、乳糖、鼠李糖；吲哚、硝酸鹽還原試驗為陽性；MR、VP試驗為陰性。根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》的判定標準，分離的可疑菌落符合多殺性巴氏桿菌的生化特征。

3.3 PCR檢測結果

用引物P1、P2擴增時，分離的可疑菌落和Pm陽性標準菌株（C48-1菌株）均有擴增出目的條帶，且大小基本一致，經對分離的可疑菌落Pm陽性PCR產物回收測序，與NCBI上發布的序列對比，同源性為98.8%，結果見圖2。

圖2 PCR檢測結果

3.4 紙片擴散法藥敏試驗

紙片擴散法藥敏試驗結果見表1。藥物敏感試驗表明，該菌對先鋒霉素Ⅴ、阿米卡星、氟哌酸、氯霉素和慶大霉素高度敏感；對氨芐青霉素、卡那霉素、四環素、紅霉素表現為中度敏感；對鏈霉素、妥布霉素、復方新諾明耐藥。

表1 藥敏試驗結果mm

3.5 動物試驗

小鼠致死試驗中試驗組5只小鼠72 h內全部死亡，小鼠死亡時間大多在15～40 h內，對照組小鼠沒有死亡。取死亡小鼠心、肺接種于TSA平皿，結果分離出純的經鑒定與以上一致的細菌。

4 討論

本試驗從福建省某豬場18份疑似病料，通過分離培養、染色鏡檢、生化試驗、動物致死試驗和PCR試驗等，共分離到1株豬多殺性巴氏桿菌。由于豬場感染率高于分離率，說明福建部分地區已感染豬多殺性巴氏桿菌，豬巴氏桿菌病作為養豬業重要呼吸道疾病之一，對福建地區養豬業已構成潛在威脅。目前，養殖場長期、大量使用抗生素進行豬病防治，導致細菌的抗藥性強，往往引發混合感染或繼發感染，導致對細菌的分離培養難度加大，豬場的治療效果也越來越差，因此應引起養豬業的高度重視。

本試驗在細菌純化和染色時，兩極濃染并不明顯，它的菌落和菌體形態特征與放線桿菌、溶血巴氏桿菌等細菌相似，都為革蘭氏陰性桿菌，因此采用常規的染色和生化試驗進行鑒定，難度較大。本文根據文獻合成1對PCR引物，通過PCR鑒定技術和生化等試驗，提高了分離鑒定豬多殺性巴氏桿菌的準確度，適合應用于該菌的流行性病學調查。

動物試驗中，從試驗結果看，可疑菌落培養物腹腔注射感染小鼠均在15～40 h內死亡，通過采集死亡小鼠臟器，再次進行細菌分離鑒定試驗，結果與本次試驗結果相同，說明本次分離的豬巴氏桿菌具有較強的感染率。

從藥敏試驗結果看，巴氏桿菌僅對先鋒霉素Ⅴ、阿米卡星、氟哌酸、氯霉素和慶大霉素高度敏感，與文獻[5-6]的報道有一定區別。由于該菌容易產生耐藥性，且不同時間、不同地區、不同群體分離到該菌對藥物的敏感性可能存在一定差異，而且現在大部分發病豬都普遍存在混合感染和多重感染，因此建議應先通過藥敏試驗選擇敏感藥物進行治療，達到較好的治療效果，避免因亂投藥而產生較強耐藥性，形成豬場難治的頑固癥。

本試驗設計的PCR引物，可直接從第1代培養皿上可疑菌做PCR檢查，無需提細菌的基因組，最小檢查豬巴氏桿菌病原CFU為103/mL，檢測結果若為陽性，一般可分離出Pm，若為陰性則反之，耗時只需幾小時，與傳統的分離培養及鑒定相比，PCR檢測大幅提升了該病的診斷速度，避免了費時、費力、漏檢、錯檢等缺陷問題，顯示了PCR技術對疾病的早期診斷、及時防治，對減少經濟損失具有重要的意義。

[1]唐先春，吳斌，索緒峰，等.豬多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及生物學特性研究[J].畜牧獸醫學報，2005，36（6）：590-595.

[2]徐引弟，王治方，朱文豪，等.豬多殺性巴氏桿菌的分離鑒定和藥敏試驗[J].中國獸藥雜志，2011，45（5）：5-7.

[3]Townsend K M,Frost A J,Lee C W,et al.Development of PCR assays for species and type-specific identification of Pasteurella multocida isolates[J].J Clin Microbiol,1998,36(4): 1096-1100.

[4]Davies R L,Mac Corquodale R,Baillie S,et al.Characterization and comparison of Pasteurella multocida strains associated with porcine pneumonia and atrophic rhinitis[J].Journal of Microbiology,2003,52:59-67.

[5]邢明偉，曾祥偉，王希彪.豬多殺性巴氏桿菌的分離與鑒定[J].養豬，2010（2）：63-64.

[6]彭苗苗，傅勝才.豬多殺性巴氏桿菌的鑒定方法和耐藥性的研究進展[J].河南畜牧獸醫，2015（5）：8-10.

（編輯：郭玉翠）

低脂減肥法更有利健康

【英國《每日郵報》網站8月13日報道】題：低碳水化合物食品最有利于減輕體重，但低脂食品更有利于健康

減少碳水化合物的攝入也許有助于減輕體重，但減少脂肪的攝入有助于健康。

一項研究發現，當人們采用“阿特金斯減肥法”等低碳水化合物減肥法時，能減去更多體重。但采用低脂減肥法時，卻能減去更多脂肪。

這是一個重要發現，因為減肥者往往只關注減輕體重，而對健康至關重要的是脂肪的數量。

盡管超市貨架上低脂食品琳瑯滿目，但許多減肥者都對“阿特金斯減肥法”和“杜坎減肥法”等低碳水化合物減肥法情有獨鐘，他們相信，這些減肥法對減肥特別有效。

肥胖癥專家希望這項發現有助于打破人們對土豆和面包等碳水化合物食品的誤解。專家說：“消費者可以不再為日常生活中適當攝入碳水化合物而自責了?！?/p>

美國國家糖尿病、消化系統疾病和腎病研究所的科學家，在研究中比較了低碳水化合物減肥法與低脂減肥法的效果。

研究期間，19名患有肥胖癥的男性和女性研究對象要在醫院病房被隔離4周，其間，研究人員會觀察并記錄他們吃的每一口食物和進行的每一項鍛煉。

研究對象在前2周攝入低碳水化合物食品，后2周攝入低脂食品。前2周和后2周攝入的熱量（卡路里）一樣多，但攝入低碳水化合物食品時要比攝入低脂食品時減少的體重略多。這也許是因為，他們在低碳水化合物減肥法期間流失了許多水分。

但研究發現，脂肪有害健康，而低脂減肥法可以減少更多脂肪。

據美國《細胞-代謝》月刊報道，低脂減肥法比低碳水化合物減肥法減少的脂肪幾乎多一倍。

研究人員凱文·霍爾說：“肥胖癥是一種身體脂肪過多的紊亂癥，減少脂肪對健康至關重要。人們也許會因為低碳水化合物減肥法減重效果更好而興奮，但減少的更多是水分而不是脂肪?！?/p>

但對于選擇哪種減肥法，霍爾沒給出絕對的結論。他建議減肥者找到適合自己的減肥法。

（轉自參考消息[N]，2015-08-18）

S858.28

A

1002-1957(2016)02-0094-03

2016-02-26

林躍華（1983-），男，福建龍海人，獸醫師，碩士，主要從事動物傳染病病原分子生物學研究工作.E-mail：zzslyh@163.com