磷酸肽的鈣結合機制及抑制磷酸鈣結晶的效果

黃 海,李八方,曾名湧,*

(1.欽州學院食品工程學院,廣西欽州 535011; 2.廣西北部灣特色海產品資源開發與高值化利用高校重點實驗室,廣西欽州 535011; 3.中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

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磷酸肽的鈣結合機制及抑制磷酸鈣結晶的效果

黃 海1,2,李八方3,曾名湧3,*

(1.欽州學院食品工程學院,廣西欽州 535011; 2.廣西北部灣特色海產品資源開發與高值化利用高校重點實驗室,廣西欽州 535011; 3.中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

探討源于鯉魚卵肽(carp egg peptide,CEP)的磷酸肽(isolated phosphopeptide,IPP)的鈣結合機制及其抑制磷酸鈣結晶的效果。通過質譜和紅外光譜解析IPP結合鈣的位點,通過紅外光譜和圓二色譜分析IPP結合鈣前后的空間結構變化,并通過電鏡觀察IPP抑制磷酸鈣結晶的效果。結果表明,磷酸基團是鈣離子的優先結合部位,1分子IPP能結合4個鈣離子,羧酸基團未參與鈣離子的結合。IPP在生理pH下無論是否結合鈣離子均未形成有序的空間二級結構,完全以無序狀態存在。在磷酸鈣過飽和溶液中,IPP能夠與磷酸根離子競爭與鈣離子的結合,并吸附到晶核表面,抑制其聚集成結晶。IPP是通過磷酸基團與鈣結合,并能有效抑制磷酸鈣結晶。

鯉魚卵肽,磷酸肽,鈣結合,結晶抑制

鈣的吸收主要是在小腸進行,在小腸吸收的鈣約占總吸收鈣的90%[1]。然而由于小腸的弱堿環境以及食物中存在的磷酸、植酸、草酸會使鈣形成難溶性鹽,導致鈣的吸收利用率低下。目前,國內外科研工作者通過酶解、分離方法已從各種食物蛋白質中制備了一些具有結合鈣離子和抑制生成磷酸鈣沉淀活性的肽,如Jiang等從蛋黃中得到與鈣離子結合能力較強的蛋白肽,其肽鏈中富含Ser、Thr和Asp殘基[2]。Jung等從鱈魚純化出促進Ca2+吸收的活性肽,其肽鏈中的Ser、Thr、Met和Tyr殘基有阻止小腸中的鈣生成磷酸鈣沉淀的功效[3-4]。Nishimoto等從鯉魚中分離出osteocalcin蛋白肽,其氨基酸殘基主要為Thr、Tyr、Gln和Asp[5]。上述研究表明,這些活性肽均富含具有極性尤其是帶電基團側鏈的氨基酸殘基。然而針對上述活性肽與鈣的結合機制和抑制磷酸鈣結晶沉淀的機制還沒有系統研究。

魚卵富含脂質、卵黃蛋白、礦物元素、維生素、類胡蘿卜素等營養物質,但在常規的加工過程中,魚卵往往被作為下腳料而廢棄。水產加工副產物已經有大量的利用研究[6-7],而關于魚卵的利用研究則較少。作者前期研究表明通過酶解得到的鯉魚卵肽(carp egg peptide,CEP)富含磷酸絲氨酸,鯉魚卵肽-鈣復合物具有促進體內鈣吸收的活性[8-9],從CEP中分離純化得到一條具有較強鈣離子結合活性的磷酸肽(isolated phosphopeptide,IPP),其含有5個磷酸化的Ser殘基[10]。本論文將對IPP的鈣結合特性及其抑制磷酸鈣結晶的效果進行系統研究,揭示其鈣結合和抑制磷酸鈣結晶的機制,為磷酸肽-鈣復合物類補鈣制劑的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

CEP:含有91.2%(w/w)的蛋白質和0.68%(w/w)的磷,實驗室自制[11];IPP:一級結構為(pS)S(pS)AF(pS)(pS)ELAR,分子量1461 u,上海強耀生物有限公司合成,純度98%以上。

D2O,DCl,NaOD:豐度99.9%,Sigma公司;實驗所用其它試劑級別均為分析純及以上。

ESI-QTOF質譜儀 英國Waters公司;JEM-1200EX透射電鏡 日本JEOL公司;MOS450/AF-CD圓二色譜儀 法國Biologic公司;Nicolet iS10傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo公司;PHS-3C型精密pH計 上海雷磁儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 質譜分析 用超純水將IPP配成0.5 mmol/L樣液,加入等體積3 mmol/L CaCl2溶液混合均勻,pH調至7.0,靜置1 h。取200 μL加入20 μL乙腈混勻進樣。收集200～2000荷質比范圍內的離子碎片信息。

1.2.2 紅外光譜分析 固體樣品:取IPP分別在兩個條件下與鈣結合(條件1:肽鈣摩爾比1∶6,pH7.0;條件2:肽鈣摩爾比1∶10,pH10.0),冷凍干燥得到肽-鈣復合物(IPP-Ca)。在瑪瑙研缽中將樣品與光譜純KBr混合,研磨均勻,使其粒度在2.5 μm以下,用壓片機壓成透明片,置于光路中進行紅外光譜分析。

液體樣品:將樣品用D2O溶解后,冷凍干燥,重復2次,盡可能去除樣品中的H2O。處理好的樣品用D2O溶解,配成3.5 mmol/L IPP溶液,用DCl和NaOD調節溶液pD。加入CaCl2重水溶液,使其與鈣離子結合,形成IPP-Ca復合物(pD 7.0,15 mmol/L CaCl2和pD 10.0,50 mmol/L CaCl2)。樣液置于兩片氟化鈣窗片之間進行紅外光譜分析。

1.2.3 圓二色譜分析 用超純水分別配制0.75 mmol/L IPP溶液,調節溶液pH,加入CaCl2,使其與鈣離子結合,形成IPP-Ca復合物(pH7.0,3 mmol/L CaCl2和pH10.0,10 mmol/L CaCl2)。樣液置于光程為1 mm的石英比色皿中,25 ℃條件下采用圓二色譜儀進行光譜掃描。實驗參數設定為:掃描波長190～300 nm,分辨率0.1 nm,帶寬1.0 nm,掃描速度40 nm/min,每個樣品掃描3次,取平均值。

1.2.4 電鏡分析 將待測樣液吸附在銅網上,自然風干5～10 min后用磷鎢酸負染,自然風干后置于80 kV透射電鏡上觀察。

1.2.5 磷酸鈣過飽和溶液配制 所有溶液均用超純水配制,防止離子干擾。磷酸鹽緩沖液和CaCl2(含NaCl維持離子強度)溶液分開配制,臨用時磷酸鹽緩沖液、CaCl2和肽混合。體系條件為:25 ℃,初始pH7.4,磷酸鹽60 μmol/L,鈣離子15 μmol/L,離子強度0.15 mol/L。計算可得體系過飽和度(σHAP)為38.3。計算公式為[12]:

Ksp(HAP)是羥基磷灰石晶體的離子積常數,為10-116.8。

1.2.6 pH漂移曲線繪制 將肽加入σHAP為38.3的磷酸鈣過飽和溶液中,使IPP終濃度分別為0.5、2.0、4.0 mol/L,CEP終濃度0.5 mg/mL。用超純水做空白。用pH計實時監控體系pH。繪制體系pH隨時間變化的曲線。

2 結果與分析

2.1 鈣離子結合位點解析

圖1 IPP與鈣離子結合的質譜圖譜Fig.1 ESI-QTOF-MS spectra of IPP with calcium binding

2.1.2 紅外光譜分析 為了進一步驗證哪些基團參與鈣的結合,對IPP和IPP-Ca進行紅外光譜分析(圖2),比對譜圖變化情況?；衔镏械牟煌鶊F由于其分子伸縮振動、變形振動需要的能量不同而在紅外光譜中具有其特征吸收峰。圖譜中主要的特征吸收峰及其表征[13]如表1所示。

圖2 IPP及IPP-Ca復合物的紅外吸收譜帶Fig.2 Infrared spectra of IPP and IPP-CaA:IPP;B:IPP-Ca(摩爾比1∶6,pH7.0);C:IPP-Ca(摩爾比1∶10,pH10.0)。

Table 1 Specifical IR absorbance peak of IPP and IPP-Ca

波數(cm-1)特征吸收峰解析3349氨基酸的N-H或羧酸的O-H伸縮振動2162磷酸的PO-H(氫鍵)伸縮振動1658羧基的C=O反對稱伸縮振動1548/1536酰胺C=O反式變形振動1455羧基的O-H面內變形1403/1388酰胺C=O順式變形振動1241磷酸P=O伸縮振動1096/1068酰胺的C-N振動1068/1001磷酸P-O-C伸縮振動929/924羧基的O-H面外變形

N-H和O-H以及它們之間締結形成的氫鍵的伸縮振動會在3600～2800 cm-1區域形成寬吸收峰。由于IPP分子中含有羧基、羥基、氨基、胍基等基團,在此處有強吸收,形成寬吸收峰。圖2中A 2162 cm-1處是O=P-O-H締結氫鍵形成的特征吸收峰,但在圖2中B和圖2中C該峰消失,說明磷酸基團與鈣結合后O=P-O-H中的H被取代[14]。三個圖譜中均觀察到羧基C=O反對稱伸縮振動形成的吸收峰(1658 cm-1),然而,羧基的O-H面內變形和面外變形形成的兩個特征峰(1455 cm-1和924 cm-1)卻出現了改變。圖2中B仍保留了這兩個峰,924 cm-1處的峰紅移到929 cm-1,說明分子中的羧基氫在結合后未被取代,羧基并未參與鈣的結合,由此可知,在生理pH下即使磷酸基團飽和后鈣也依然不與羧酸根離子結合,這與質譜分析結果一致。然而,圖2中C的這兩個峰均消失,表明羧基參與了鈣的結合。由此可知,羧酸是否參與鈣的結合與pH和肽鈣摩爾比這兩個因素有關。通過質譜及紅外光譜分析證實IPP的磷酸基團參與鈣的結合,而當溶液pH和肽鈣摩爾比等因素發生改變時羧基也可能參與鈣的結合。學者在研究酪蛋白磷酸肽(casein phosphopeptide,CPP)及其特征序列肽(S(p)S(p)S(p)EE)在磷酸鹽緩沖體系下的肽鈣結合性能時,發現它們與鈣結合并不符合P/Ca化學計量關系,由此推測CPP可能與鈣離子及無機磷酸形成納米顆粒[15-16],但并未對結合位點進行系統研究。因此羧基可能在促進肽分子通過“鈣橋”交聯從而形成納米顆粒的過程中起到一定作用。

酰胺C=O的反式、順式變形振動分別發生在1548 cm-1和1403 cm-1處,與鈣結合后位置發生了偏移。圖2中B這兩處峰分別紅移到1536 cm-1和1388 cm-1處,而在圖2中C 1548 cm-1處的峰卻發生藍移并與羧酸C=O反對稱伸縮吸收峰(1658 cm-1)發生部分重疊。1096 cm-1和1001 cm-1分別是酰胺的C-N伸縮振動和磷酸P-O-C伸縮振動產生的特征峰,在與鈣結合后兩處的峰發生重疊,并成1068 cm-1的寬峰[14]。

2.2 IPP與Ca結合前后空間結構的變化

2.2.1 酰胺Ⅰ帶紅外光譜分析 通過紅外光譜法分析蛋白質在紅外光譜1700～1600 cm-1處的特征吸收帶(酰胺Ⅰ帶)的變化情況,可得到蛋白質二級結構變化的信息[15]。1683 cm-1處涉及到分子間反平行β折疊結構形成,而1617 cm-1處的β折疊結構形成與分子聚集過程有關[16-17]。由圖3可知,在生理pH下,無論IPP是否與鈣結合,其譜圖只在1659 cm-1和1607 cm-1(氨基酸側鏈振動)處有弱吸收(圖3中A、B),均未觀察到任何有序的二級結構,如β折疊和α螺旋,這是由于IPP帶大量負電荷,由于排斥作用難以形成有序的二級結構,分子可能是以無規卷曲形式存在,而且IPP與鈣離子結合后結構沒有發生改變。在不添加鈣離子的條件下,將IPP的pH調至10.0,其二級結構依然沒有變化,也呈現無序狀態(圖3C)。但當同時調節pH和添加鈣離子時,其譜圖(圖3D)中具有多個吸收峰,分別為1683cm-1(β折疊)、1657 cm-1(β轉角)、1637 cm-1(β折疊)和1617 cm-1(β折疊),也未發現α螺旋結構吸收峰(1651 cm-1或1646 cm-1)[16-19],說明此時IPP的空間結構發生了從無序到有序的轉變。結合2.1.2的實驗結果可知,這種轉變可能與羧基結合鈣離子有關。

圖3 IPP及IPP-Ca的酰胺Ⅰ帶紅外吸收光譜Fig.3 Infrared spectra of amideⅠband ofIPP and IPP-CaA:3.5 mmol/L IPP(pD 7.0);B:3.5 mmol/L IPP-Ca (pD 7.0,15 mmol/L CaCl2);C:3.5 mmol/L IPP(pD 10.0); D:3.5 mmol/L IPP-Ca(pD 10.0,50 mmol/L CaCl2)。

2.2.2 圓二色譜分析 圓二色譜能夠靈敏檢測蛋白質二級或三級結構的變化[20]。198 nm附近的正峰和218 nm附近的負峰是典型的β折疊結構形成的吸收峰,208 nm附近的負峰是α螺旋結構形成的吸收峰[21-22],198 nm附近的負峰表明無規卷曲[21]。如圖4所示,生理pH下的IPP和IPP-Ca以及pH10.0下的IPP的圓二色譜圖(圖4中A～C)均觀察到表征無規則卷曲的200 nm處負峰,沒有觀察到任何有序的二級結構,這與酰胺Ⅰ帶紅外光譜分析的結論相一致,進一步確定了IPP在生理條件下是以完全無序的狀態存在。Wang[23]等用CD色譜發現合成的骨橋蛋白(osteopontin,OPN)的高度保守序列(OPN93-106)的肽(DDVDDTDDSHQSDE)不存在任何的二級結構,呈完全無序的結構(198 nm負峰),在pH7.0與鈣結合后二級結構沒有顯著差異,這與本研究結果一致。這可能是由于IPP和OPN93-106均是高度荷電,分子內及分子間的排斥作用使得分子難以形成α螺旋和β折疊結構。同樣,當同時調節pH和添加鈣離子時,其圓二色譜圖(圖4中D)出現了典型的β折疊結構特征峰(198 nm正峰和218 nm負峰),這也與酰胺Ⅰ帶紅外光譜分析結果相吻合。

圖4 IPP及IPP-Ca的圓二色譜圖Fig.4 CD spectra of IPP and IPP-Ca A:0.75 mmol/L IPP(pH7.0);B:0.75 mmol/L IPP-Ca(pH7.0,3 mmol/L CaCl2);C:0.75 mmol/L IPP(pH10.0); D:0.75 mmol/L IPP-Ca(pH10.0,10 mmol/L CaCl2)。

2.3 抑制磷酸鈣結晶的效果

2.3.1 pH漂移曲線 25 ℃時,當初始體系pH低于6.1,磷酸鈣過飽和溶液中磷酸(氫)根與鈣離子結合形成二水合磷酸氫鈣結晶,而當初始體系pH高于6.7則形成Ca8H(PO4)3·5H2O結晶,并逐步轉化成羥基磷灰石晶體Ca10(PO4)6(OH)2(HAP)[24]。按照經典成核理論,磷酸鈣過飽和溶液中磷酸(氫)根與鈣離子首先自發成核形成晶核或晶胚,進而聚集形成無定形顆粒(ACP),然后聚集形成結晶。則當無定形態磷酸鈣開始結晶,伴隨著pH的快速下降。

圖5 磷酸鈣過飽和溶液pH漂移曲線Fig.5 pH drift curve of calcium phosphate supersaturated solutionA:空白;B:添加0.5 mg/ml CEP; C～E:分別添加0.5,2.0,4.0 μmol/L IPP。

由圖5可以看出,所有濃度的IPP對磷酸鈣的成核階段和結晶形成、增長階段均有顯著抑制作用,且隨著濃度升高抑制作用增強。許多研究表明,磷酸基團是蛋白/肽抑制體內草酸鈣和磷酸鈣沉淀所必需的,因為磷酸基團能吸附到Ca-P簌和ACP的表面,顯著增大成核階段的表面活化能,從而抑制其聚集、結晶,也能吸附到結晶表面抑制其增大[25-26]。如OPN是人體尿液中存在的天然蛋白,主要作用是抑制尿液中草酸鈣結晶,防止腎結石。OPN富含天冬氨酸,中間連有磷酸化絲氨酸,實驗證明其不僅能抑制草酸鈣結晶,還能抑制磷酸鈣結晶,而磷酸基團是必不可少的。由此可知,IPP對磷酸鈣結晶的抑制作用也是由于磷酸基團對ACP及晶體表面的吸附、包裹作用。CEP對成核不但無抑制作用,反而有促進作用,表現在誘導時間的縮短,然而在結晶形成和增長階段卻表現出明顯的抑制作用。這可能是由于CEP是混合蛋白且濃度較大,非活性蛋白肽分子在體系中充當晶核從而促進了成核。然而活性組分(磷酸肽)對晶核、ACP及結晶的吸附作用又抑制了結晶形成和增大。

2.3.2 電鏡分析 電鏡圖片(圖6)也清楚顯示過飽和溶液在沒有添加IPP或CEP時,ACP迅速聚集、定向,6 h后明顯形成結構致密的單晶,此時也正好對應pH漂移曲線中pH降至6.6,12 h可觀察到微量沉淀生成。當在體系中添加0.5 μmol/L的IPP時,能使Ca-P簌和ACP大小穩定在納米階段,形成納晶,大大減緩了結晶的形成和增大,直至48 h后形成明顯的結晶。由于CEP是含有活性肽組分的混合肽,也表現出抑制磷酸鈣結晶的作用。當體系中添加0.5 mg/mL CEP時,直至12 h后形成明顯結晶。

圖6 磷酸鈣過飽和溶液電鏡圖Fig.6 TEM image of calcium phosphate supersaturated solutionA:添加0.5 μmol/L IPP,24 h;B:添加0.5 mg/mL CEP,6 h; C:空白,6 h;D:添加0.5 μmol/L IPP,48 h; E:添加0.5 mg/mL CEP,12 h;F:空白,12 h。

為進一步確定結晶的形成,對上述在電鏡觀察中認為形成結晶的樣品(圖6中的D、E、F樣品)進行晶體衍射觀察,結果如圖7所示。沒有添加IPP和CEP的空白磷酸鈣過飽和體系,觀察到典型的單晶衍射現象,說明晶體形成。在添加IPP的體系中,則觀察到的是典型的多晶衍射現象,這說明IPP在晶體形成中吸附到ACP及晶體表面,阻礙結構更為致密的單晶形成。由于CEP的活性組分含量不高,與鈣結合及吸附在ACP及晶體表面能力不如IPP,所以在添加CEP的體系中觀察到單晶和多晶衍射共存現象。

圖7 磷酸鈣晶體衍射圖Fig.7 Crystal diffraction image of calcium phosphate 注：A:IPP;B:CEP;C:空白。

3 結論

磷酸肽中的磷酸基團是鈣離子的優先結合部位,1分子IPP能結合4個鈣離子,生理pH下羧酸基團未參與鈣離子的結合。IPP在生理pH下無論是否結合鈣離子均未形成有序的空間二級結構,完全以無序狀態存在。IPP通過與磷酸根競爭與鈣結合,有效抑制磷酸鈣過飽和溶液的成核,并能吸附到晶核、ACP及晶體表面,有效抑制其聚集成結晶及結晶的增長。本論文揭示了磷酸肽與鈣離子的結合機制,并證明其具有抑制磷酸鈣結晶的效果。

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Mechanism of binding Ca2+and the effect of inhibiting calcium phosphate crystal formation of phosphopeptide

HANG Hai1,2,LI Ba-fang3,ZENG Ming-yong3,*

(1.College of Food Engineering,Qinzhou University,Qinzhou 535011,China; 2.Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Development and High-value Utilization of Beibu Gulf Seafood Resource,Qinzhou 535011,China; 3.College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

ToinvestigatethemechanismofbindingCa2+andtheeffectofinhibitingcalciumphosphatecrystalsformationofisolatedphosphopeptide(IPP)derivedfromcarpeggpeptide(CEP).TheCa2+bindingsitesofIPPweredeterminedbymassspectrometry(MS)andFouriertransforminfraredspectroscopy(FTIR).ThechangeofitsspacestructureafterbindingCa2+wasstudiedthroughFTIRandcirculardichroismspectroscopy(CD).TheeffectofIPPinhibitingcalciumphosphatecrystalformationwasobservedbyelectronmicroscope.TheresultsshowedthatphosphatehadtheprioritytobindingCa2+.OnemoleofIPPcouldbindfourmolesofCa2+andcarboxylgroupcouldnotbindcalcium.RegardlessofthepresenceofCa2+,IPPwaspresentinthestateofunordedstructureinsolutionunderphysiologicalconditions,withoutanyorderedsecondarystructures.Inthesupersaturatedsolutionofhydroxylapatite(HAP),IPPcouldcompetewithphosphatetobindCa2+andadsorbtothesurfacesofcrystalnucleus,whichinhibitedthenuleationofcalciumphosphateanditsaggregationtocrystal.

carpeggpeptide;phosphopeptide;bindingCa2+;crystalinhibition

2016-04-08

黃海(1977- )，男，博士，副教授，研究方向：水產品加工及資源利用，E-mail:jxfifagoal@163.com。

*通訊作者:曾名湧(1965- )，男，博士，教授，研究方向：水產品高值化利用，E-mail:mingyz@ouc.edu.cn。

國家自然科學基金(31101379)；國家星火計劃項目(2012GA740048)。

TS254.1

A

1002-0306(2016)19-0062-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.004