毛細管區帶電泳場放大進樣檢測自來水中季銨鹽類除草劑

張慶慶，孟品佳,*，王燕燕，張文芳

（1.中國人民公安大學，北京100038；2.法庭毒物分析公安部重點實驗室，北京100192)

毛細管區帶電泳場放大進樣檢測自來水中季銨鹽類除草劑

張慶慶1，孟品佳1,*，王燕燕2，張文芳2

（1.中國人民公安大學，北京100038；2.法庭毒物分析公安部重點實驗室，北京100192)

本文建立了毛細管電泳場放大堆積在線富集技術檢測自來水中百草枯、敵草快和燕麥枯3種季銨鹽類除草劑的方法。采用pH4的200 mmol/L磷酸鹽溶液(含體積分數為20 %乙腈)為分離緩沖液，0.5 psi壓力下引入去離子水3 s，10 kV電遷移進樣30 s，+2 5kV下分離12 min，對3種季銨鹽類除草劑進行分離和測定。其中百草枯和敵草快的LOD均達到0.1 ng/mL；百草枯和敵草快線性范圍0.25～10 μ g/mL，回歸系數0.995和0.998。燕麥枯則更適用于壓力進樣方式，優化條件下，其自來水中檢測限可以達到100 ng/mL，0.25～10μg/mL范圍內線性回歸系數為0.993。3種除草劑的日內精密度和日間精密度均小于8 %和11 %。該方法簡單、快速，無需進行樣品前處理，且能獲得較高靈敏度，可應用于自來水中該類藥物的檢測。

毛細管區帶電泳；場放大樣品堆積；季銨鹽類除草劑；自來水

KEY WORDS: quaternary ammonium pesticides; capillary electrophoresis; field-amplified sample stacking(FASS); tap water

百草枯（Paraquat，PQ）、敵草快（Diquat，DQ）和燕麥枯（Difenzoquat，DF）3種季銨鹽類除草劑近年來被廣泛使用，因其會造成環境污染、人或動物中毒，在毒物檢驗中經常涉及。目前，檢測這類農藥殘留的方法主要有光譜法[1-2]、氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS）[3-4]、高效液相色譜法（HPLC）[5-6]、液相色譜-質譜聯用法（LC-MS）[7-9]、毛細管電泳法（CE）[10-13]及酶聯免疫法（ELISA）[14]等。季銨鹽類農藥屬于極性有機陽離子化合物，常規氣相色譜方法分析困難，需要進行衍生化處理，使得分析過程繁瑣。毛細管電泳和液相色譜適用于直接分析這類離子化合物。其中毛細管電泳具有儀器簡單、操作方便、分離效率高、成本低、消耗少等優點，但由于進樣量和紫外檢測器光程的制約，毛細管電泳-紫外檢測通常要使用在線富集技術提高其濃度檢測限。場放大樣品堆積（Fieldamplified sample stacking，FASS）是采用電動進樣的在線富集技術，易于操作，是通過配制高電阻樣品溶液形成高場強區域實現樣品堆積，并通過電動進樣引入大體積樣品，提高檢測靈敏度。

本文采用毛細管電泳技術考查和優化了3種除草劑的電泳分析條件，建立了場放大進樣區帶電泳的分析方法，可用于自來水中痕量季銨鹽類除草劑的檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

BECKMAN P/ACETM MPQ毛細管電泳儀，配二極管陣列檢測器；未涂層熔融石英毛細管（60.2 μm×75 μ m i.d.，有效柱長50 cm，美國Polymicro Technologies公司）。

百草枯、敵草快、燕麥枯標準品以及紫精二溴乙酯（IS）購于百靈威公司。用萬分之一天平稱取，超純水溶解制備1 mg/mL的百草枯、乙基百草枯、敵草快和燕麥枯標準溶液為儲備液，置于冰箱冷藏室中待用。

試驗用磷酸二氫鈉、磷酸、甲醇、乙醇、乙腈和異丙醇等均為分析純試劑，購于國藥集團化學試劑有限公司。配制400 mmol/L的磷酸二氫鈉和磷酸溶液，依據需要配制成pH 2.5～8的20、50、100、150和200 mmol/L磷酸鹽緩沖液及含一定體積比有機試劑的磷酸鹽緩沖液。實驗用純凈水、所用緩沖液及樣品溶液均經過0.45 μm纖維素過濾膜后超聲波振蕩脫氣。

1.2 實驗方法

毛細管在第一次使用前依次用甲醇（10 min）、純凈水（10 min）、0.1 mol/LNaOH（20 min）、純凈水（10 min）、緩沖液（60 min）在20 psi壓力下沖洗平衡；兩次分析間用緩沖液20 psi壓力下沖洗（15 min）。

電泳分析使用背景電解質為含有體積分數為20 %乙腈pH4的200 mmol/L磷酸鹽緩沖液，0.5 psi引入水柱3 s，10 kV電遷移進樣30 s，施加+25 kV電壓，定量檢測波長200 nm，溫度20 ℃。

1.3 方法學確認

定量線性是在空白自來水中分別添加5個不同濃度的標準品和同一濃度的內標溶液，以待測物峰面積與內標峰面積比值與待測物濃度繪制工作曲線，線性方程濃度點覆蓋范圍即為線性范圍。

以線性考察的最低點濃度作為待測物的定量限（LOQ），最小檢出限（LOD）為1/3定量限濃度。重復性是在線性范圍內低、中、高3個濃度點分別制備5個平行樣品進行分析，以待測物與內標峰面積比值計算日內相對標準偏差（RSD%）；在5天內，每天在線性范圍內低、中、高3點平行測試3個平行樣本，每點共15個數值計算日間相對標準偏差（RSD%）。

2 結果與討論

2.1 電泳條件的優化

影響毛細管區帶電泳（CZE）分離的重要因素主要是電滲流（EOF）的方向及大小，這受到緩沖液種類、pH值、濃度、有機添加劑種類及比例、溫度、分離電壓等因素的影響。

分析物PQ與DQ離子分子量相近，電荷數相同，電泳淌度十分接近，不易分離，本文以PQ與DQ間的分離度作為重要參數對電泳條件進行了詳細考查。

2.1.1 緩沖液種類、濃度及pH 值考查

通過實驗比較了乙酸銨、檸檬酸、硼酸和磷酸鹽緩沖液的分離效果，發現乙酸銨緩沖液的譜圖基線不穩，硼酸分離效果沒有磷酸和檸檬酸緩沖液好，因此選用磷酸鹽作為背景緩沖液。

考察了pH在2.5 ～ 8之間、緩沖液濃度在50 ～200 mmol/L之間，PQ和DQ間的分離度（見表1）及峰寬、峰高等參數。緩沖液的pH值主要通過管壁上硅羥基的電離影響電滲流。由于季銨鹽類除草劑均為陽離子化合物，其帶電狀態不受pH的影響。

表1 不同磷酸緩沖液濃度和pH值條件下PQ和DQ間的分離度Table 1 Resolution of PQ and DQ under the condition of different buffer concentration and pH

考慮到DQ在pH＞9的情況下易分解，DF遇強酸時易氧化分解，因而緩沖液的pH范圍選擇在pH3～8的范圍內進行考察。隨著pH值升高，電滲流、遷移速度升高，但當pH值＞7時，PQ和DQ由于與管壁的靜電吸附作用使區帶明顯展寬，而DF的峰寬隨著pH值的升高而減小，這可能是由于DF凈電荷少，電泳淌度增大，與毛細管壁上的硅羥基吸附力要小于帶有雙電荷的PQ和DQ的緣故。季銨鹽與管壁的硅羥基產生靜電吸附作用會造成樣品峰拖尾，低pH值能抑制硅羥基的電離，減少吸附從而減小拖尾，因此選擇緩沖液的pH為4。隨著緩沖液離子強度的增加，電滲流減小，分離時間延長。

另外，季銨鹽類化合物易與未涂層的熔融石英毛細管壁上帶負電的硅羥基離子發生離子吸附作用，而高離子濃度的緩沖液有利于抑制季銨鹽與毛細管壁間的吸附作用。實驗結果表明，在磷酸鹽緩沖液濃度為20 mmol/L時，PQ和DQ完全不能分離，隨著緩沖液濃度增加兩者的分離度變大，當磷酸鹽緩沖液濃度為200 mmol/L時，可實現完全分離（R＞1.5）。而且隨著緩沖液濃度的增加，各分析物的峰高響應值也在增加，這也說明緩沖液與樣品溶液間的電導率差別是實現場放大富集的主要機制。

2.1.2 有機調整劑、水柱長度和電遷移時間對分離的影響

緩沖液中加入有機調整劑可達到降低緩沖液的粘度、減小電滲流、提高分離度等效果。實驗考察了甲醇、乙腈、乙醇、四甲亞砜、丙酮及異丙醇這6種有機添加劑對分離的影響。添加丙酮和四甲亞砜時基線不好，異丙醇使電滲流降低，甲醇、乙腈可使溶液黏度變小，增大電滲流。無論是甲醇還是乙腈對于PQ的峰型影響不大。但甲醇揮發性大，對緩沖基質影響較大不宜采用，而低濃度的乙腈對遷移時間的影響很小，最后選定20 %體積比乙腈的緩沖體系。

本實驗中，在樣品和緩沖液間引入了一段水柱。水柱的電導低于緩沖液，樣品隨溶液進入后，由于樣品溶液和水柱的電阻大，形成高電場，樣品離子迅速遷移至水柱與緩沖液的界面，隨后遷移速率降低，樣品在界面處富集。顯然水柱的長短將影響分離和富集的效果。壓力引進水柱不宜過短，否則背景電解質中的離子易擴散進入樣品區帶，影響富集效果；水柱過長會因為水的電導率低而影響工作電流的穩定。水柱長度應在1～2 mm之間[15]，實驗中0.5 psi引進純凈水，對比進樣時間3～10 s，在此范圍內，引進水柱長度對分析物峰面積幾乎無影響。電遷移進樣可實現在大量引入樣品體積的同時實現組分的富集，但也是有限度的。實驗表明10 kV電遷移30 s時，PQ和DQ的峰高到達線性最高值，綜合考慮，選擇電遷移30 s。

2.1.3 溫度、分離電壓對分離的影響

實驗結果表明，在15～40 ℃范圍內，因焦耳熱問題，低溫時的分離度、峰高以及峰面積要比高溫時要好（見表2）。但是若分離溫度低于實驗室室溫（25℃）時，實驗過程中冷凝管上容易凝結水珠，影響實驗進程。因此選擇略低于實驗室溫度的20 ℃為最佳分離溫度。

分離電壓是樣品分離的原動力，電壓越高，組分遷移越快，分析時間縮短，但高于25kV時會導致分離度變差；當電壓低于25 kV時，峰寬有所增加，亦影響組分的分離。25 kV時，10 min內3種季銨鹽和內標均出峰，因此選擇用25 kV分離電壓（見表3）。

2.2 方法學考查

方法的比較影響

2.2.1 常規CZE與FASS-CZE

表4和表5分別為用純凈水配制的3種季銨鹽類除草劑標準樣品在常規區帶電泳（CZE）和場放大進樣區帶電泳（FASS-CZE）的方法學考察結果，比較表4與表5的檢測限，可以看出場放大進樣的富集效果比壓力進樣（常規的區帶電泳模式）的靈敏度可提高近1000倍。

在實際樣品如自來水中，由于樣品中存在離子雜質，會對不同組分的檢測產生干擾。圖1說明了3種季銨鹽除草劑在不同模式下的分析效果。在自來水的檢測中，DF在低于1 μg/mL的時候，基本不成峰型，高于1 μg/mL的濃度時峰型也不是很好，峰型較寬且有拖尾。這可能是因為自來水中成分要比純凈水中復雜，其中的成分和DF相互間作用，影響了DF的電遷移（見圖1a）。這時用壓力進樣方式檢測自來水中的3種季銨鹽除草劑，DF峰形改善，而且檢測限要比電遷移的檢測限要低，可以達到100 ng/mL（見圖1b）。因此對自來水中的3種季銨鹽進行檢測時，DQ和PQ適合場電遷移進樣場放大富集方式檢測，而DF適用壓力進樣的方式進樣檢測。

2.2.2 自來水中季銨鹽的檢測

在自來水中添加3種季銨鹽類標準品后采用優化條件進行檢測，結果見表6、表7。本文中采用的毛細管區帶電泳場放大在線富集方法對自來水中的PQ以及DQ的檢測靈敏度均很好，但場放大電遷移進樣的方式對自來水中的DF檢測靈敏度還不及壓力進樣方式，這可能源于自來水中的基質抑制效應。

表2 不同溫度下PQ與DQ間的分離度Table 2 Resolution of PQ and DQ under the different temperature

表3 不同分離電壓對PQ和DQ分離的影響Table 3 Resolution of PQ and DQ under the different separation voltage

表4 純凈水中季銨鹽除草劑壓力進樣線性方程與LODTable 4 Regression equation, linear range and detection limit detected by CZE

表5 純凈水中季銨鹽除草劑毛細管場放大進樣線性方程與LODTable 5 Regression equation, linear range and detection limit detected by FASS-CZE

圖1 自來水中標準添加3種季銨鹽類除草劑的CZE 譜圖。圖中數字代表含義：1.PQ；2.DQ；3.內標；4.DF。緩沖體系為pH4的200mmol/L磷酸緩沖液（乙腈20%），分離條件FASSCZE為0.5psi×3s引入去離子水，10kV電遷移進樣30s；CZE為0.7psi×10s壓力進樣，+25kV分離12min，20℃。Fig.1 Electropherogram of the mixture of 3 quaternary ammonium pesticides and the internal standard by capillary zone electrophoresis (CZE)

表6 自來水中季銨鹽除草劑的線性方程與LODTable 6 Regression equation, linear range and detection limit of quats in tap water

表7 自來水中季銨鹽除草劑加標后的精密度Table 7 Precision of the tap water spiked with quats

3 結論

本文建立了自來水中3種季銨鹽類除草劑的毛細管電泳分析方法。優化和建立了場放大堆積-區帶電泳分析季銨鹽類除草劑的條件和方法，并與常規區帶電泳分析結果進行了比較。

毛細管電泳技術分析季銨鹽類除草劑，操作簡單，靈敏度高。其中采用毛細管區帶電泳場放大在線富集方法對自來水中的PQ以及DQ的檢測靈敏度均很好，但場放大電遷移進樣的方式對自來水中的DF檢測靈敏度不及壓力進樣方式。因此可根據分析的對象選擇合適的方法。

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Analysis of Quaternary Ammonium Herbicides in Tap Water by Fieldamplified Sample Stacking of Capillary Zone Electrophoresis

ZHANG Qingqing1? MENG Pinjia1,*? WANG Yanyan2? ZHANG Wenfang2
(1. People's Public Security University of China, Beijing, 100038, China;
2. Key Laboratory of Forensic Toxicology, Ministry of Public Security, Beijing 100192, China)

In this paper,we established a capillary zone-electrophoresis analytical method for the determination of three herbicides of paraquat, diquat and difenzoquat in tap water. Capillary electrophoresis (CE) is a popular separation technique for the charged molecules. However, because of the short optical detection length and low sample loading, it has some limitations in terms of sensitivity, thereby restricting its use into a wide range of applications. Much effort has been devoted to address this problem. Sample pretreatment and/or online pre-concentration represent some approaches to increase the sensitivity of CE. Employed the online field-amplified stacking (FASS) injection technique. No sample pretreatment was needed. In this method, a phosphate solution (pH=4.0) containing 20 % acetonitrile was used as separation buffer. After optimization of the key parameters and experimental set-ups, the best stacking efficiency was obtained under these conditions: deionized water to be introduced at first at 0.5 psi pressure for 3s, followed by the introduction of sample solution at 10 kV for 30s. The separation was conducted under 25 kV and completed in 12 min, and the three herbicides were well separated. In the method validation, results demonstrated that paraquat and diquat were given linearity at concentration range of 0.25 -10 μg/mL (coefficient: 0.995 and 0.998), with their LODs of both 0.1ng/mL based on the signal-to-noise ratio of 3:1. For the difenzoquat, the hydrodynamic injection mode was more suitable than FASS mode. Good linear relation was obtained over the scope of 0.25 -10 μg/mL with related coefficient of r2=0.993 and its LOD of 100ng/mL. The intra-day precisions of our method for the three herbicides were all less than 7.5% and those of the inter-dayall below 10.4%. This method is simple, sensitive, able to be used in the rapid detection and determination of quaternary ammonium herbicides in tap water.

DF795.1

A

1008-3650(2016)04-0265-05

2015-12-23

格式：張慶慶，孟品佳，王燕燕，等.毛細管區帶電泳場放大進樣檢測自來水中季銨鹽類除草劑[J]. 刑事技術，2016,41(4):265-269.

10.16467/j.1008-3650.2016.04.002

公安部科技強警基礎工作專項項目（No.2013GABJC002）

張慶慶（1978—），女，湖北武漢人，博士，講師，研究方向為法化學。E-mail:897101671@qq.com

* 通訊作者：孟品佳（1955—），女，遼寧沈陽人，博士，教授，研究方向為毒物毒品分析。E-mail:mengpinjia@163.com