轉錄激活因子3對綠膿桿菌致急性肺損傷小鼠肺泡灌洗液炎癥因子的影響

吳秀琳 李明霞 蔡俊 錢斕蘭 郭亮 吳學玲 陳復輝

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·論著·

轉錄激活因子3對綠膿桿菌致急性肺損傷小鼠肺泡灌洗液炎癥因子的影響

吳秀琳1,6李明霞2蔡俊3錢斕蘭4郭亮4吳學玲5陳復輝6

目的探討轉錄激活因子3(ATF3)對綠膿桿菌致急性肺損傷(ALI)小鼠肺泡灌洗液炎癥因子的影響。方法以熒光標記的綠膿桿菌(PA)(1.5×108CFU/ml，50 μl)經鼻滴入C57BL/6野生型和ATF3敲基因小鼠氣管構建急性肺損傷模型；ELISA檢測WT小鼠和ATF3-KO小鼠肺泡灌洗液中前炎癥因子白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)濃度。結果經鼻滴入綠膿桿菌6 h后小鼠肺組織病理檢測表現為：中性粒細胞大量浸潤、肺泡結構破壞、肺泡出血以及肺間質水腫，證實成功構建了經鼻滴入綠膿桿菌(PA)誘導的急性肺損傷模型。野生型小鼠在綠膿桿菌滴入后肺泡灌洗液中IL-1β的濃度于3、6、12和24 h時分別為(198.36±20.85)pg/ml，(131.93±8.23) pg/ml，(130.10±15.65) pg/ml，(67.04±2.77) pg/ml；肺泡灌洗液中IL-6的濃度于3、6、12和24 h時分別為(1 657.59±77.13) pg/ml，(1 232.78±31.85) pg/ml，(103.33±1.75) pg/ml，(24.44±5.79) pg/ml；肺泡灌洗液中TNF-α的濃度于3 h，6 h，12 h和24 h時分別為(542.12±49.12) pg/ml，(347.89±34.38) pg/ml，(42.23±9.63) pg/ml，(19.45±3.23 )pg/ml。野生型小鼠急性肺損傷小鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α濃度均于3 h表達最高，故選擇3 h時相點對敲基因小鼠進行檢測，ATF3敲基因小鼠在綠膿桿菌滴入后3 h時肺泡灌洗液中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的濃度分別為(321.25±7.81) pg/ml、(2 479.69±127.4) pg/ml、(840.75±22.97) pg/ml，表達明顯高于野生型小鼠急性肺損傷組及對照組，均存在顯著差異(P<0.05)。結論ATF3對綠膿桿菌致急性肺損傷小鼠的炎癥反應有抑制作用。

轉錄激活因子3； 綠膿桿菌； 急性肺損傷； 促炎因子

急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(acute lung injury/acute respiratory distress syndrome, ALI /ARDS)是膿毒血癥、爆發性流感、嚴重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)、重癥肺炎等疾病的主要死亡原因[1]。其中綠膿桿菌致急性肺損傷的發病率較高。近年來雖然在氣道管理和保護性機械通氣策略等方面有了長足的進步，其病死率仍在40%左右。因此對ALI/ARDS發病機制及其防治的研究具有重要的臨床意義。

ARDS是由炎癥失控所致的臨床危重癥疾病，表現為急性呼吸困難，低氧血癥和非心源性肺水腫。但其發病機制尚不完全明確。研究表明巨噬細胞產生的轉錄激活因子3(ATF3)可抑制中心粒細胞在肺內的遷移，其作用的發揮可能是通過Tiam2途徑[2]。在非感染性疾病，如呼吸機相關肺損傷(ventilator induced lung injury, VILI)中，ATF3通過降低炎癥反應對肺損傷有保護作用[3]，證實ATF3對炎癥反應有“剎車”作用，是TLR4炎癥反應中的重要的負性調控基因。本課題組前期實驗發現LPS腹腔注射后2 h，野生型小鼠ATF3 mRNA表達明顯增加，因此推測ATF3在細菌致急性肺損傷中亦可能起一定的保護作用。因此本研究采用綠膿桿菌致急性肺損傷模型，探討ATF3在綠膿桿菌致急性肺損傷小鼠中的保護作用及可能機制，旨在為ARDS/ALI的發病機制提供理論依據，并提供新的可能的治療靶點。

材料與方法

一、 實驗材料

熒光標記的綠膿桿菌由復旦大學中山醫院呼吸科宋元林教授贈予。C57BL/6(17.8～26.25 g)小鼠，SPF級，購于第三軍醫大實驗動物中心。ATF3敲基因小鼠(18.9～24.91 g)經美國俄亥俄州立大學Tsonwin Hai教授同意由武漢大學模式動物協同創新中心李紅良教授贈送，飼養于第三軍醫大學新橋醫院動物中心。適應3～4 d，按照隨機數字表法隨機分組。將小鼠隨機分為4組，每組20只野生型小鼠對照組(WC組，即給予野生型小鼠生理鹽水)、野生型小鼠急性肺損傷組(WA組，即給予野生型小鼠經鼻滴入綠膿桿菌)、ATF3敲基因小鼠對照組(KC組，即給予敲基因小鼠生理鹽水)及ATF3敲基因小鼠急性肺損傷組(KA組，即給予敲基因小鼠經鼻滴入綠膿桿菌)。PA給予后0 h、3 h、6 h、12 h及24 h(每個時相點5只小鼠)處理小鼠。

二、研究方法

1. 急性肺損傷小鼠模型的建立及實驗設計

①配制綠膿桿菌菌液：將原始菌種從-80 ℃冰箱取出解凍后接種于哥倫比亞血平板，普通三區劃線后放置于37 ℃孵箱中24 h后長出大量菌落。用接種環取適量1～2個菌落置于無菌生理鹽水中，用DL-ZD1濁度計調至0.5個麥氏單位，相當于1.5×108cfu/ml；②將小鼠置于秤盤中稱重；③麻醉小鼠：小心打開乙醚瓶口，取出一朵醫用棉球并用乙醚沾濕，置于密閉的燒瓶內，將小鼠放入燒瓶內約1 min，小鼠被麻醉后取出小鼠，進行后續滴鼻操作。在用乙醚麻醉的過程中，注意掌握麻醉時間，若麻醉時間過短則在后續操作過程中小鼠易醒，若時間過長則小鼠易死；④綠膿桿菌/生理鹽水滴鼻：小鼠用乙醚麻醉后，左手提起小鼠，頭部垂直向上，右手用10 μl移液器將綠膿桿菌菌液(以1.5×108cfu/ml的濃度)或生理鹽水共50 μl經鼻滴注至肺內，滴注過程中可見小鼠鼻孔處有氣泡產生，但嘴內無液體流出，表明綠膿桿菌經過呼吸道到達小鼠肺內；⑤麻醉小鼠：綠膿桿菌作用實驗設置時間后，左手拇指和食指抓住頸部皮膚，固定并提起小鼠頭部，小指夾住尾巴，以45 ℃方向進針進行戊巴比妥250 mg/kg腹腔注射麻醉小鼠，小鼠皮膚較薄，在注射時注意觀察液體是否外漏；⑥肺泡盥洗：待麻醉成功后，將小鼠固定于板上，解剖頸部暴露氣管，在氣管上端剪一小口，置入氣管導管，用1 ml生理鹽水反復盥洗3次，留取灌洗液約0.7～0.8 ml左右于EP管中，做好標記，置于-80 ℃冰箱備用。收集的肺泡灌洗液用于檢測炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達；⑦收集標本：固定小鼠于板上，打開胸腔，暴露肺臟組織，小心取下肺臟組織，右上肺用于提取蛋白，左肺用于提取RNA。其余肺組織石蠟包埋及切片，HE染色。

2. 小鼠肺組織病理學檢查：步驟同前。肺損傷評分按照以下三項標準進行: ①肺泡和間質水腫；②肺泡出血；③中性粒細胞浸潤或聚集。 每項標準又分四個等級：0=正常，1=輕度變化，2=中度變化，3=重度變化。最終的肺損傷得分為：三項標準評分的總和(總分為9)。ELISA檢測肺泡灌洗液中TNF-α和IL-1β、IL-6表達(按照試劑盒說明進行)

三、統計學方法

運用SPSS13.0統計軟件進行數據分析。所有數據均以均數±標準誤表示。用單因素方差分析進行多組間的比較，組間的兩兩比較采用q檢驗。P<0.05為差異，有統計學意義。

結 果

一、肺組織病理變化

肺組織切片HE染色病理鏡檢結果顯示，在WT小鼠及ATF3-KO小鼠吸入生理鹽水組的肺泡間隔無明顯增厚，無明顯中性粒細胞浸潤。在吸入綠膿桿菌后6 h后，WT小鼠吸入綠膿桿菌組及ATF3-KO小鼠肺組織出現典型急性肺損傷病理變化，表現為中性粒細胞大量浸潤、肺泡結構破壞、肺泡出血以及肺間質水腫。按照肺組織損傷病理評分，顯示WA組的得分要低于KA組，提示ATF3-KO肺組織病變程度較WT小鼠組明顯加重，見圖1。

二、綠膿桿菌致WT小鼠急性肺損傷小鼠肺泡灌洗液中前炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α的表達

結果顯示，野生型小鼠在綠膿桿菌滴入后肺泡灌洗液中IL-1β的濃度于3 h，6 h，12 h和24 h時分別為198.36±20.85 pg/ml，131.93±8.23 pg/ml，130.10±15.65 pg/ml，67.04±2.77 pg/ml；肺泡灌洗液中IL-6的濃度于3 h，6 h，12 h和24 h時分別為1 657.59±77.13 pg/ml，1 232.78±31.85 pg/ml，103.33±1.75 pg/ml，24.44±5.79 pg/ml；肺泡灌洗液中TNF-α的濃度于3 h，6 h，12 h和24 h時分別為542.12±49.12 pg/ml，347.89±34.38 pg/ml，42.23±9.63 pg/ml，19.45±3.23 pg/ml，見圖2。

三、ATF3對綠膿致急性肺損傷小鼠肺泡盥洗液前炎癥因子的影響

野生型小鼠在綠膿桿菌滴入后肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α的濃度分別均于3 h表達最高，故選擇3 h時相點對敲基因小鼠進行檢測。ATF3敲基因小鼠在綠膿桿菌滴入后3 h時肺泡灌洗液中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的濃度分別為321.25 pg/ml±7.81、2 479.69 pg/ml±127.4、840.75 pg/ml±22.97，表達明顯高于野生型小鼠急性肺損傷組(WA)及對照組(WC、KC組)，即ATF3敲基因急性肺損傷組(KA組)炎癥因子表達明顯高于野生型小鼠急性肺損傷組及對照組，存在顯著差異(P<0.05)，見圖3。

圖1 小鼠肺病理學檢查(HE×100)；注：A為WT小鼠滴入生理鹽水(WC組)；B為WT小鼠滴入綠膿桿菌(WA組)；C為KO小鼠滴入生理鹽水(KC組)；D為KO小鼠滴入綠膿桿菌(KA組)

圖2 野生型小鼠吸入生理鹽水和綠膿桿菌肺泡灌洗液炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α表達時間梯度；注：a、b、c、d:P<0.05

圖3 ATF3對綠膿桿菌誘導的肺泡灌洗液炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α表達的影響；注：a、b、c、d:P<0.05

討 論

ALI/ARDS的發病機制十分復雜，涉及環節多，受損的靶細胞多，其中炎癥反應失控是其本質。參與炎癥反應的細胞主要有巨噬細胞、中性粒細胞(polymorphonuclear, PMN)[4-5]。巨噬細胞是肺部防御病原微生物和肺損傷的第一道防線，是ALI早期肺部炎癥反應的“導火索”[6]。PMN在炎癥組織的過度募集和伴隨過度激活、持續存在是導致肺內失控性炎癥反應的關鍵環節[7]。盡管ALI/ARDS可發生在白細胞減少的患者，諸多試驗證實PMN在肺內的募集是啟動絕大多數ARDS的早期和重要事件及造成過度炎癥反應的“元兇”[8]。而氧化應激和Toll樣受體4(toll like receptor 4, TLR4)信號通路是急性肺損傷發生發展的關鍵途徑[9]。

ATF3屬于ATF/CREB家族成員，是一個應激反應誘導的快反應基因，廣泛參與多種細胞活動的調控，如炎癥應答、氧化應激、細胞凋亡和免疫調節等，與炎癥、腫瘤、創傷、缺血缺氧、缺血灌注損傷發生等關系密切[8-12]。LPS刺激下ATF3敲基因小鼠巨噬細胞釋放多種炎癥因子量明顯增加，表明ATF3對TLR4介導的信號通路有負調控作用[13-14]。在巨噬細胞中，HDL誘導ATF3的生成，從而下調Toll樣受體(TLR)誘導的各種炎癥因子的表達，對“持續的過激的炎癥反應”起到滅火的作用[15]。ATF3對VILI亦有保護作用，ATF3通過降低機械通氣產生的環切力誘導的炎癥反應對肺損傷有保護作用，能抗衡環切力和高通氣帶來的炎癥[3]。再次證實了ATF3對炎癥反應有“剎車”作用，是TLR4炎癥反應中的重要的負性調控基因。

前期預實驗發現LPS腹腔注射后，ATF3 mRNA及蛋白表達 在2 h其mRNA水平明顯升高，其6 h、12 h、24 h雖下降，但仍高于正常水平。這一表達模式與文獻報道的LPS所致肺部炎癥反應時相點相一致[16]?；谖墨I報道和前期實驗結果，推測上調ATF3的表達可能對急性肺損傷有保護作用。

為進一步評價ATF3對綠膿桿菌誘導的ALI小鼠的作用，比較了WT小鼠和ATF3-KO小鼠組的肺組織病理變化及肺泡灌洗液中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。本研究發現WT小鼠及ATF3-KO小鼠吸入綠膿桿菌6h后均出現典型的ALI典型病變，表現為PMN大量浸潤、肺泡結構破壞、肺泡出血以及肺間質水腫，ATF3-KO小鼠肺組織病變程度重于WT小鼠。ATF3-KO小鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子明顯增高，于3h達高峰，且明顯高于WT小鼠及對照組的表達。上述研究結果與文獻報道相一致[17-18]。說明本研究中采用滴入綠膿桿菌(0.5個麥氏單位，相當于1.5×108CFU/ml)菌懸液誘導建立的ALI模型是成功的。這一研究結果表明，ATF3能夠抑制炎癥因子在綠膿桿菌誘導的ALI小鼠肺泡灌洗液中的表達，證實ATF3對綠膿桿菌致ALI的肺泡炎癥反應可能有負性調控作用。

以上實驗結果表明，ATF3對綠膿桿菌誘導的ALI具有保護作用。但目前對于ATF3調控ALI的機制尚不清楚。Gilchrist等[19]使用基因芯片技術分析LPS誘導巨噬細胞TLR4/NF-κB通路活化的轉錄譜，發現ATF3的mRNA轉錄活性明顯升高。Nguyen等[20]證實了ATF3是通過TLR4下游的JNK/c-jun信號通路被誘導表達上調的。鑒于以上結果和文獻報道，推測TLR4/NF-κB信號通路可能是ATF3負性調控ALI炎癥損傷的機制之一，但尚有待進一步研究證實。

綜上所述，本研究證實了ATF3對綠膿桿菌誘導的ALI有保護作用，對其過激炎癥有負性調控作用。這些結果提示上調ATF3的表達有望成為治療ALI的潛在靶點。

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(本文編輯：黃紅稷)

ChenFuhui,Email：chenfuhui2006@126.com

Objective To study the effect of activating transcription factor 3(ATF3) on inflammation of pseudomonas aeruginosa -induced acute lung injury(ALI). Methods C57BL/6 wild and ATF3 knockout mice were lightly anesthetized by ether inhalation, and inoculated intranasally with PA (1.5×108CFU/ml，50 μl) (group ALI) or normal saline (group control) to establish ALI mouse model. The mice were sacrificed at 3, 6, 12, 24 h after PA challenge. The levels of tumor necrosis factor-α(TNF-α) , interleukin-6(IL-6) and Interleukin-1β(IL-1β) in Bronchoalveolar lavage fluid(BALF) were examined by ELISA. Results After 6 h of PA stimulation, the neutrophil infiltrate in lung tissue, destruction of alveolar structure, alveolar hemorrhage and pulmonary interstitial edema had established ALI mouse model successfully. IL-1β expression in WT mice BALF which inoculated intranasally with PA were 198.36±20.85 pg/ml, 131.93±8.23 pg/ml, 130.10±15.65 pg/ml, 67.04±2.77 pg/ml at 3 h, 6 h, 12 h, 24 h separately. The same with IL-6 were 1 657.59±77.13 pg/ml, 1 232.78±31.85 pg/ml, 103.33±1.75 pg/ml, 24.44±5.79 pg/ml at 3 h, 6 h, 12 h, 24 h separately, and TNF-α were 542.12±49.12 pg/ml, 347.89±34.38 pg/ml, 42.23±9.63 pg/ml, 19.45±3.23 pg/ml at 3 h, 6 h, 12 h, 24 h separately. The top expression of IL-1β, IL-6, TNF-α in BALF were 3 h after the WT stimulate with PA, then it was choosen that the 3 h point to check the KO mice. It was found that the IL-1β, IL-6, TNF-α expression in KO mice which were stimulate with PA were 321.25±7.81 pg/ml, 2 479.69±127.4 pg/ml, 840.75±22.97 pg/ml separately. The concentration of TNF-α, IL-6 and IL-1β in BALF from ATF3 knock out acute lung injury mice were increased compared with that of ATF3 wild type acute lung injury mice (P<0.05). Conclusion ATF3 inhibites the inflammation of pulmonary of PA-induced acute lung injury.

ATF3; Pseudomonas aeruginosa; Acute lung injury; Pro-inflammatory factor

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.05.003

國家自然科學基金資助項目(81270130)

400016 重慶，武警重慶總隊醫院老年科1、中心實驗室2、檢驗科3400037 重慶，第三軍醫大學新橋醫院呼吸科4200127 上海，上海交通大學醫學院仁濟醫院呼吸科5150001 哈爾濱，哈爾濱醫科大學附屬第二醫院呼吸科6

陳復輝，Email：chenfuhui2006@126.com

R563

A

2016-09-02)

Effects of activating transcription factor 3 on lung inflammation of pseudomonas aeruginosa-induced acute lung injuryWuXiuling1,6,LiMingxia2,CaiJun3,QianLanlan4,GuoLiang4,WuXueling5,ChenFuhui6.1DepartmentofGeriatric,2CentralLaboratory,3Clinicallaboratory,ChongqingArmedCropsPloiceHospital,Chongqing400016,China;4DepartmentofRespiration,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China;5DepartmentofRespiration,RenjiHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicne,Shanghai200127,China;6DepartmentofRespiration,The2ndAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China