牛支原體實驗室檢測方法研究進展

莊金秋，梅建國，劉吉山，姚春陽，馬力(山東省濱州畜牧獸醫研究院，濱州 256600)

牛支原體實驗室檢測方法研究進展

莊金秋，梅建國，劉吉山，姚春陽，馬力
(山東省濱州畜牧獸醫研究院，濱州 256600)

隨著規?；B牛業的不斷發展，牛支原體已經成為危害養牛業的一種重要致病性支原體，可導致牛肺炎、乳腺炎、關節炎等多種疾病，造成巨大的經濟損失。本文綜述了牛支原體病原學、血清學及分子生物學方面的實驗室檢測方法研究進展，以期為我國牛支原體病的防治提供參考。

牛支原體；檢測；研究進展

牛支原體（Mycoplasma bovis，M. bovis）屬支原體科支原體屬，是一種介于細菌和病毒之間的無細胞壁的原核微生物。M. bovis可引起犢牛肺炎、乳腺炎、關節炎、角膜結膜炎、耳炎、生殖道炎甚至流產與不孕等多種疾病，這些疾病常被稱為牛支原體相關疾?。∕ycoplasma bovis-associated disease，MbAD）。牛傳染性胸膜肺炎（Contagious bovine pleuropneumonia，CBPP）簡稱牛肺疫，是由與M.bovis同屬的絲狀支原體絲狀亞種SC型（Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC，MmmSC）引起的烈性傳染病，被世界動物衛生組織（OIE）列為須通報的動物疫病。M. bovis是繼MmmSC對牛致病力最強的支原體，二者具有相似的臨床癥狀和病理剖檢變化，不易鑒別診斷。1961年Hale在美國首次從一例患乳腺炎患牛的牛乳中分離出M. bovis[1]。1976年美國首次報道M. bovis引起的肺炎。我國黎濟申等[2]于1983年從患乳腺炎的牛乳中首次分離到該病原，辛九慶等[3]于2008年從患肺炎的犢牛肺臟中首次分離到該病原。M. bovis是危害犢牛的重要致病性病原體，具有較高的感染率和死亡率，而經治療后癥狀緩解的牛一般發育遲緩，甚至成為廢牛，嚴重影響牛奶的產量和質量。該病呈世界性分布，近年來MbAD已經在世界范圍內廣泛傳播，且M.bovis感染后可明顯增加其他病原的繼發感染，給世界養牛業造成了巨大的經濟損失。牛支原體感染后無特殊癥狀，因此很難對該病進行感官判斷，確診需借助實驗室診斷。本文綜述了近年來M. bovis感染最新實驗室檢測方法研究進展，以期對疾病的預防控制提供參考。

1 牛支原體分離鑒定

支原體分離鑒定方法應嚴格按照無菌操作規程，將患病動物的組織病料接種于培養基中。支原體培養營養需求較高，通常要在培養基中加入10%～20%馬血清，置于37℃、5%CO2培養箱中培養3～5d。在類胸膜肺炎微生物（Pleuropneumonia like organism，PPLO）固體培養基中進行分離培養時，在光學顯微鏡下，菌落呈現典型的“煎蛋狀”形態，邊緣整齊，表面光滑，為中間厚周邊薄的菌膜斑點。如若7d未發現生長跡象，可判斷為陰性。初步鑒定后，在含酚紅的液體培養基中培養，觀察培養基顏色是否由紅變黃，且稍渾濁，而后根據配套的生化反應進行鑒定。常用的液體培養基包括Hayfiick、Edward、Frey、MEM-KMZ、SP-4等培養基。M. bovis對外界環境要求較高，采集病料如未能及時送往實驗室，則極易導致病原死亡。病料一般需冷藏運輸，運輸時間不要超過24h，也可將其凍存于運輸培養基中進行運輸。對于病料的采集，下呼吸道分離出病原的概率一般比上呼吸道大。雖然牛支原體分離鑒定可以確診是否有M. bovis的感染，但是其分離難度大且周期長，不能作為快速診斷M. bovis感染的有效方法來使用。

2 血清學方法

血清學方法是檢測M.bovis感染的可靠方法，尤其對于經抗生素治療或慢性病例，血清抗體檢測方法比病原培養方法更敏感。

2.1 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

利用全菌抗原或重組抗原建立的間接ELISA方法是檢測血清抗體的首選方法，應用最為廣泛。用處理過的M.bovis全菌蛋白作為包被抗原的間接ELISA方法不僅能夠檢測血清抗體，還可以檢測患有乳腺炎奶牛的乳清抗體，此方法被廣泛應用于M.bovis感染的流行病學調查，但是該方法的抗原為全菌蛋白，其特異性有待提高?；诖?，Brank等[4]建立了以M.bovis的VSP重組蛋白作為包被抗原的間接ELISA方法，Robino等[5]建立了以M.bovis的膜脂蛋白P48作為包被抗原的間接ELISA用以檢測對應抗體。Fu等[6]利用P48重組蛋白作為包被抗原，其相應的單克隆抗體用HRP進行標記，建立了直接競爭ELISA檢測M.bovis抗體的方法，與其他兩種商品化ELISA試劑盒比較，該方法具有更好的特異性和更高敏感性。以P48蛋白作為包被抗原的ELISA方法能檢測M.bovis的所有分離株，但是不與感染牛的其他支原體發生反應，在檢測M.bovis感染上有很好的應用前景。Wawegama等[7]鑒別出一種可以具有脂肪酶活性的膜蛋白（mycoplasma immunogenic lipase A，MilA），該蛋白氨基末端與M. bovis抗體有很強的免疫反應，利用大腸桿菌誘導表達該段蛋白建立了間接ELISA方法，敏感性達到92.86%，特異性高達98.7%。金云云等[8]以M.bovis全菌蛋白經超聲波裂解后的裂解物作為包被用抗原，建立了檢測M.bovis血清抗體的間接ELISA方法。Han等[9]基于全菌蛋白建立了一種間接ELISA方法，特異性好，而且可以區分出感染牛和免疫牛，從而可以判斷牛感染程度高低、疫苗有效與否。國外商品化的檢測M. bovis抗體的ELISA試劑盒有瑞士、加拿大和比利時等國家研制的試劑盒。國內劉洋等[10]將純化后的P28重組蛋白作為抗原建立了檢測M.bovis血清抗體的間接ELISA方法并組裝成試劑盒，填補了國內ELISA試劑盒的空白。該試劑盒具有良好的敏感性、特異性和穩定性，能在一次反應中對M.bovis和MmmSC作鑒別診斷，與加拿大商品化試劑盒的檢測結果符合率高達92%，各種技術指標相當，認為可作為進口試劑盒的替代品用于M.bovis的臨床診斷與流行病學調查。

2.2 間接血凝試驗（IHA）

IHA是一種經典的免疫學診斷技術，因其操作簡單、穩定、成本低，具有較高的敏感性和特異性，且對試驗條件要求低，可被廣泛應用于獸醫實驗室檢測、田間血清學調查和基層獸醫部門的輔助診斷。簡瑩娜等[11]以純化的P48重組蛋白致敏醛化-鞣酸化的綿羊紅細胞并對其工藝進行優化，建立了檢測M. bovis抗體的IHA方法。該方法與國外商品化的ELISA試劑盒比較，平均符合率為96.15%。對833份田間血清和1 084份乳清進行檢測，陽性率分別是15.37%和19.56%。該方法敏感性高、特異性強和重復性好，可用于M. bovis抗體水平監測、牛支原體病的輔助診斷和流行病學調查。

2.3 膠體金免疫層析試紙條

簡瑩娜[12]利用牛支原體P48重組蛋白，建立了檢測M. bovis抗體的膠體金免疫層析試紙條。應用該試紙條檢測臨床血清200份，乳清108份，陽性率分別是21.50%、17.59%，與IHA方法相比符合率為96.53%。表明該試紙條敏感、特異、快速，適合于M. bovis抗體的快速檢測。

2.4 免疫組化技術

免疫組化技術是一門將免疫學與組織化學相結合的技術，可在組織細胞原位通過抗原-抗體特異性結合反應和組織化學顯色反應、借助可見的標記物對相應抗原或抗體進行定位、定性和定量檢測，不僅能準確地判斷是否有病原感染，而且還能清晰地反映病原在組織器官和細胞中的定位及分布。該方法操作簡便、不需要專門的儀器設備，適合于基層臨床的快速診斷，并且對于研究病原在機體內的致病機制及分布規律有一定的輔助作用。Adegboye等[13]基于單克隆抗體建立了免疫組化方法檢測犢牛肺組織中的M.bovis，與殊異支原體陽性、牛鼻支原體陽性以及牛支原體陰性的牛組織切片等沒有交叉反應，且直觀反映出病原的分布。Haines等[14]建立了M.bovis免疫組化技術，對牛場M.bovis感染所致的急慢性呼吸道疾病、肺炎、乳腺炎等進行了病原體檢測，其檢測結果提示，病原體數量、定植部位與病理損傷程度、致病機理等之間可能存在聯系。Khodakaram-Tafti等[15]采用免疫組化方法進行M.bovis的診斷，不僅能對福爾馬林固定的組織進行M.bovis檢測，還能清楚地顯示出M.bovis在病灶內的具體位置，該方法能夠定位抗原、直觀地觀察病變組織的病理變化以及M.bovis侵襲機體后的分布情況。金云云等[16]以雞抗M.bovis IgY為一抗，以HRP標記的羊抗雞IgG為二抗，建立了檢測M.bovis的間接免疫組化法。該方法可用于檢測臨床病例組織樣本及培養物中的M.bovis，為探究該病原在機體內的定位、動態分布規律及致病機理提供了手段。

2.5 其他血清學方法

其他血清學檢測方法有應用兔源高免疫血清鑒定M.bovis的抗體檢測方法，包括生長抑制試驗（GI）、生物膜形成抑制試驗（FI）、熒光抗體試驗（FA）和新陳代謝抑制試驗（MI）等。由于這些試驗無商品化抗血清，需在實驗室自行制備，因此操作時較為費時費力。

3 分子生物學方法

由于牛在養殖場環境中停留2～4周后都存在可檢測滴度的M.bovis抗體，所以血清學檢測方法無法對牛肺炎病例是否由M.bovis引起進行準確的診斷。分子生物學方法相對快捷方便，而且靈敏度高，已被廣泛應用于M.bovis的實驗室檢測。

3.1 PCR技術

早期Hotzel等[17]、Ayling等[18]利用PCR方法擴增16S rRNA用來檢測M. bovis的感染，但是由于M.bovis與無乳支原體（Mycoplasma agalactiae，M.agalactiae）的16S rRNA同源性高達99.8%，在不結合其他方法的情況下無法區分這兩種病原的感染。于是Johansson等[19]通過16S rRNA的PCR和酶切系統來鑒別這兩種支原體。Subramaniam等[20]選取了DNA修復基因uvrC作為靶基因進行特異性擴增，可以直接應用于臨床患病牛的病原學檢測。Pinnow等[21]建立了套式PCR的方法，能夠快速、準確地鑒定是否由M.bovis引起的乳腺炎。Bashiruddin等[22]建立了ATP結合蛋白oppD/F基因作為靶基因的PCR方法。Foddai[23]等根據M.bovis的p81基因，設計建立了多重PCR和PCR-RFLP方法，能夠在一次反應中對M.bovis和M.agalactiae作鑒別診斷。我國從2008年開始對M. bovis進行深入研究，P81蛋白是M.bovis和M. agalactiae共有的蛋白，但兩者的同源性僅為67%。李媛等[24]根據P81基因引物，建立了PCR方法。該方法可以從人工感染牛的鼻拭子和臨床發病牛肺中擴增出目的片段，與分離培養結果完全符合，為國內首次建立的敏感、特異、快速的牛支原體PCR檢測方法。同年利用oppD/F為靶基因，設計2對引物，建立了套式PCR檢測方法，成功鑒別了M.bovis和M. agalactiae。李彥芹[25]利用通用引物擴增16S rRNA建立了能夠快速鑒別診斷MmmSC、M.bovis、M. agalactiae和綿羊肺炎支原體的多重PCR方法，可以對臨床病例中懷疑支原體感染的病料進行病原診斷。劉洋等[26]建立了可以同時鑒別檢測M.bovis 和MmmSC的雙重PCR方法，為我國的牛肺疫認證以及M. bovis相關疾病診斷提供了技術支持。李大偉等[27]也建立了一種可一次性區分上述三種支原體的三重PCR方法，用于臨床診斷和流行病學調查。胡國明[28]根據牛支原體P48基因設計引物，建立了M.bovis與M.agalactiae、MmmSC、滑液支原體、雞毒支原體等病原的PCR鑒別診斷方法，經對西固、臨洮、武威等地的臨床病料進行檢測，證明具有很高的特異性和敏感性，對M.bovis感染的臨床快速、準確診斷具有較高的實用價值。

3.2 熒光定量PCR技術

實時熒光定量PCR技術也被用于M.bovis檢測的研究。Cai等[29]應用雜交探針和退火溫度建立了擴增16S rRNA基因序列的實時定量PCR方法，用于檢測奶牛牛乳以及肺組織中的M.bovis。在檢測牛乳時，其敏感性達100%，檢測肺組織時，其敏感性達96.6%。Sachse等[30]針對oppD基因，設計了實時定量PCR引物及探針，在患乳腺炎及呼吸道疾病的病牛中，能夠靈敏特異地鑒別出M.bovis，檢測限能夠達到100cfu/mL。Rossetti等[31]根據uvrC基因設計引物，建立了實時定量PCR方法，該方法不需要處理牛乳及組織樣品即可獲取純化的DNA，可直接用于實時定量PCR檢測，具有良好的特異性和高度敏感性，方便用于M.bovis的檢測。

3.3 環介導等溫擴增（LAMP）技術

LAMP方法具有操作簡便、快速、高效、敏感、特異、經濟等特點，適于基層實驗室監測的廣泛使用。Saito等[32]利用LAMP對肺炎支原體進行檢測，相同時間內LAMP檢測法的靈敏度遠高于實時定量PCR法。在對70例患者及25例正常人咽試紙檢測中，陽性率100%，無假陽性。Churchward等[33]同時用競爭性ELISA、套式PCR及LAMP對絲狀支原體進行診斷，結果顯示，LAMP法的敏感性遠高于競爭性ELISA和套式PCR。國內白智迪[34]、侯軒等[35]先后根據M.bovis的uvrC基因設計引物，建立了LAMP方法，敏感性較PCR方法高100倍。在對167個臨床鼻拭子樣本的檢測中，LAMP方法檢測結果的陽性率（26.95%）高于PCR方法檢測結果的陽性率（19.16%）。金云云等[36]根據P81基因設計引物建立了LAMP方法，最低檢出限為1.1ng/L。

3.4 雙向電泳技術

陳維等[37]成功建立了M.bovis蛋白質組學雙向電泳技術，由于國際上目前尚無M.bovis蛋白組學的相關報道，所以該方法的建立，可以鑒定出相應的致病性蛋白，為M.bovis致病機理的研究提供了蛋白質組學信息。

4 小結

隨著規?；B牛業的不斷發展，牛支原體病的流行范圍越來越廣，發生頻率也越來越高，嚴重威脅了我國養牛業的發展?，F階段國內外對該病原的研究還不透徹，特別是對牛支原體疫苗及其遺傳穩定性的研究幾乎處于零階段，加之我國對于本病的研究起步較晚，并且國際上尚無公認的特異性診斷方法，以及目前對于該病致病機制的研究尚未達成共識，從而為該病的預防控制帶來了不便。因此建立快速、準確的檢測方法，開發新型疫苗等防控產品，是控制該病發生的基礎和關鍵，具有十分重要的意義。上述M.bovis的各種檢測方法各有優點和實用性，實際應用中需根據不同的場合、條件等選擇使用其中的一種或者多種方法。隨著人們對M.bovis研究的深入，相信現有的檢測方法將不斷得到改進，更簡便化、快速化和準確化的檢測方法也將很快被研制出來。

[1] Hale HH，Helmboldt CF，Plastridge WN，et al. Bovine mastitis caused by Mycoplasma species[J]. Cornell Veterinarian, 1962,52:582-591.

[2] 黎濟申. 牛的霉形體性乳房炎[J]. 上海畜牧獸醫通訊,1983,4:46.

[3] 辛九慶,李媛,郭丹,等. 國內首次從患肺炎的犢牛肺臟中分離到牛支原體[J]. 中國預防獸醫學報,2008,30(9):661-664.

[4] Brank Marion，Grand Dominique，Poumarat Francois，et al. Development of a recombinant antigen for antibodybased diagnosis of Mycoplasma bovis[J]. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology,1999,6(6):861-867.

[5] Robino P,Alberti A,Pittau M,et al. Genetic and antigenic characterization of the surface lipoprotein P48 of Mycoplasma bovis[J]. Veterinary Microbiology,2005,109(3-4):201-209.

[6] Fu P,Sun Z,Zhang Y,et al. Development of a direct competitive ELISA for the detection of Mycoplasma bovis infection based on a monoclonal antibody of P48 protein[J]. BMC veterinary research,2014,10:42.

[7] Wawegama NK,Browning GF,Kanci A,et al. Development of a recombinant protein-based enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of Mycoplasma bovis infection in cattle[J]. Clinical and Vaccine Immunology,2014,21(2):196-202.

[8] 金云云,剡根強,王靜梅,等. 牛支原體間接ELISA檢測方法的建立[J]. 畜牧與獸醫,2014,46(2):10-14.

[9] Han XX,Khan FA,Zhu XF,et al. Establishment of an antibody avidity test to differentiate vaccinated cattle from those naturally infected with Mycoplasma bovis[J]. Veterinary Journal,2015,203(1):79-84.

[10] 劉洋,陳維,宋志強,等. 3種ELISA試劑盒檢測抗牛支原體抗體的比較[J]. 中國預防獸醫學報,2011,33(6):448-451.

[11] 簡瑩娜,儲岳峰,趙萍,等. 牛支原體P48蛋白的表達及間接血凝檢測方法的建立與應用[J]. 中國獸醫科學,2015,45(3):241-246.

[12] 簡瑩娜. 基于P48重組蛋白的牛支原體抗體檢測技術研究[D].北京:中國農業科學院,2015.

[13] Adegboye DS，Rasberry U，Halbur PG，et al. Monoclonal antibody-based immunohistochemical technique for the detection of Mycoplasma bovis in formalin-fixed, paraffin-embedded calf lung tissues[J]. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，1995,7(2):261-265.

[14] Haines DM,Martin KM,Clark EG,et al. The immunohistochemical detection of Mycoplasma bovis and bovine viral diarrhea virus in tissues of feedlot cattle with chronic, unresponsive respiratory disease and/or arthritis[J]. Can Vet J,2001,42(11):857-860.

[15] Khodakaram-Tafti A，Lopez A. Immunohistopathological findings in the lungs of calves naturally infected with mycoplasma bovis[J]. Vet Med A,2004,51:10-14.

[16] 金云云,剡根強,王靜梅,等. 牛支原體間接免疫酶標組織化學檢測方法的建立[J]. 中國畜牧獸醫,2013,40(5):26-30.

[17] Hotzel H,Sachase K,Pfutzner H. Rapid detection of Mycoplasma bovis in milk samples and nasal swabs using the polymerase chain reaction[J]. Journal of Applied Bacteriolo gy,1996,80(5):505-510.

[18] Ayling RD，Nieholas RA and Johansson KE. Application of the polymerase chain reaction for the routine identification of Mycoplasma bovis[J]. Veterinary Record,1997,141(12):307-308.

[19] Johansson KE, Berg LO, Bolske G, et al. Specific PCR systems based on the 16S rRNA genes of Mycoplasma agalactiae and Mycoplasma bovis. Mycoplasma of Ruminants: Pathogenicity, Diagnostics, Epidemiology and Molecular Genetics. COST 826-Agriculture and Biotechnology[C]. European Commission, Brussels,Belgium,1998,88-90.

[20] Subramaniam S,Bergonier D,Poumarat F,et al. Species identification of Mycoplasma bovis and Mycoplasma agalactiae based of the uvrC genes by PCR[J]. Molecular and Cellular Probes,1998,12(3):161-169.

[21] Pinnow CC,Butler JA,Sachse K,et al. Detection of Mycoplasma bovis in preservative-treated field milk samples[J]. J Dairy Sci, 2001,84:1640-1645.

[22] Bashiruddin JB, Frey J, Konigsson MH, et al. Evaluation of PCR Systems for the identification and differentiation of Mycoplasma agalactiae and Mycoplasma bovis:aeollaborativetrial[J]. VetJ, 2005,169(2):268-275.

[23] Foddai A,Idini G,Fusco M,et al. Rapid differential diagnosis of Mycoplasma agalactiae and Mycoplasma bovis based on a multiplex PCR and a PCR-RFLP[J]. Molecular and Cellular Probes,2005,19(3):207-212.

[24] 李媛,董惠,張美晶,等. 牛支原體套式PCR檢測方法的建立[J].中國畜牧獸醫學報,2009,31(9):709-711.

[25] 李彥芹. 牛支原體PCR檢測方法的建立及臨床應用[D]. 泰安:山東農業大學,2009.

[26] 劉洋,李媛,董惠,等. 牛支原體雙重PCR檢測方法的建立[J]. 中國預防獸醫學報,2010,32(8):599-602.

[27] 李大偉,黃燦平,張彥明,等. 牛支原體、無乳支原體和絲狀支原體絲狀亞種小克隆三重PCR檢測方法的建立及初步應用[J]. 畜牧獸醫學報,2011,42(2):306-310.

[28] 胡國明. 基于脂蛋白P48的牛支原體快速檢測方法的建立[D].蘭州:甘肅農業大學,2015.

[29] Cai HY,Bell RP,Parker L,et al. Development of a real-time PCR for detection of Mycoplasma bovis in bovine milk and lungsamples[J]. Vet Diagn Invest,2005,17(6):537-545.

[30] Sachse K,Helbig JH,Lysnyansky I,et al. Epitope mapping of immunogenic and adhesive structures in repetitive domains of Mycoplasma bovis variable surface lipoproteins[J]. Infection and Immunity,2000,68(2):680-687.

[31] Rossetti BC,Frey J,Pilo P. Direct detection of Mycoplasma bovis in milk and tissue samples by real-time PCR[J]. Molecular and Cellular Probes,2010,24 (5):321-323.

[32] Saito R,Misawa Y,Moriya K,et al. Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of Mycoplasma pneumoniae[J]. Journal of medical microbiology，2005,54(11):1037-1041.

[33] Churchward CP，Hlusek M，Robin AJ，et al. Ayling, Laura McAuliffe, A simplified PCR method for genotyping Mycoplasma mycoides subspecies mycoides small colony: The aetiologic agent of contagious bovine pleuropneumonia[J], Veterinary Microbiology, 2012,159(1-2):257.

[34] 白智迪. 牛支原體LAMP檢測方法的建立及體外傳代致弱菌株的特性鑒定[D]. 武漢:華中農業大學,2011.

[35] 侯軒,付萍,張海燕,等. 牛支原體的環介導等溫擴增快速檢測技術研究[J]. 農業生物技術學報,2012,20(2):218-224.

[36] 金云云,王靜梅,剡根強. 基于牛支原體P81基因環介導等溫擴增方法的建立及應用[J]. 中國獸醫學報,2014,34(4):571-577.

[37] 陳維,李媛,辛九慶,等. 牛支原體蛋白質組學雙向電泳技術的建立及初步分析[J]. 東北農業大學學報,2012,3:42-47.

Research Progress on the Detection Methods of Mycoplasma Bovis

ZHUANG Jin-qiu, MEI Jian-guo, LIU Ji-shan, YAO Chun-yang, MA Li
(Shandong Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy, Binzhou 256600)

With the development of cattle movement, Mycoplasma bovis has been became an important pathogen to damage to the breeding. Associated with a number of bovine diseases, Mycoplasma bovis is the most commonly implicated in pneumonia and mastitis, form which arthritis may result, so that it bright a huge economic loss. This paper summarized the research progress on the detection of the Mycoplasma bovis in terms of etiology, serological and molecular biology so as to provide references for prevention and control of Mycoplasma bovis infection in China.

Mycoplasma bovis; Detection; Research progress

S858.23

A

1004-4264（2017）02-0030-05

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.02.008

2016-07-29

山東省現代農業產業技術體系牛產業創新團隊項目（SDAIT-09-12）；山 東 省 重 點 研 發 計 劃 項 目（2015GSF121027）。

莊金秋（1978-），女，山東濰坊人，碩士，副研究員，主要從事細胞培養和動物用病毒疫苗研制工作。