不同來源大豆毛油磷脂組成的核磁檢測及磷脂酸含量比較

俞 樂，叢 芳，王興國，金青哲，姜元榮

(1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122； 2.豐益(上海)生物技術有限公司，上海 200137)

檢測分析

不同來源大豆毛油磷脂組成的核磁檢測及磷脂酸含量比較

俞 樂1，叢 芳2，王興國1，金青哲1，姜元榮2

(1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122； 2.豐益(上海)生物技術有限公司，上海 200137)

植物毛油中存在一定量以磷脂為主的膠質。為保證后續物理精煉順利進行，植物毛油需先經過脫膠處理。綜合考慮原料產地、加工工藝、生產批次等因素，收集了25種不同大豆毛油，利用31P NMR 技術對其進行磷脂組成分析，并研究了毛油中的磷脂酸含量與其他雜質間的關系。結果表明：不同品種大豆制備的毛油在磷脂組成上存在顯著性差異(p<0.05)，而磷含量沒有顯著性差異；隨著儲藏溫度升高，毛油磷脂中磷脂酸占比有一定程度上升；大豆毛油中磷脂酸的含量與金屬離子含量極顯著正相關(p<0.01)，與游離脂肪酸含量(以酸值表示)不存在顯著性關聯(p>0.05)。

大豆毛油；磷脂組成；核磁檢測；磷脂酸

毛油脫膠處理中，水化磷脂通常易于分離，非水化磷脂則難以通過常規水化脫膠、酶法脫膠[1]去除。毛油中的非水化磷脂主要由磷脂酸(PA)的鈣鎂鹽組成[2]，毛油磷脂的PA比例過高，則不利于脫膠進行，影響成品油品質。油料運輸、儲存、生產過程中，由于其中磷脂酶(如磷脂酶A、磷脂酶D等)[3]的作用，毛油磷脂中磷脂酰膽堿(PC)等水化磷脂含量下降。在磷脂酶A的作用下，水化磷脂被水解為溶血磷脂及游離脂肪酸[4]。磷脂酶D作用于磷脂質的磷酸二酯鍵，能夠將PC等磷脂水解為PA和羥基化合物[5]。

磷脂檢測的常用方法主要有薄層色譜法(TLC)和高效液相色譜法(HPLC)。TLC很難將所有組分完全分開；HPLC對樣品需要進行復雜的前處理，存在檢測器選擇等問題[6-7]。近年來隨著核磁檢測技術的進步，利用31P核磁共振(31P NMR)檢測磷脂逐漸受到人們關注，該方法對含磷組分的選擇具有唯一性，不受其他元素的干擾，具有預處理簡便、分析快捷、分辨率高等優點[8]。

目前，國內鮮有將31P NMR運用于植物毛油磷脂組成檢測的報道。施邑屏等[9]曾利用該法檢測大豆磷脂并進行了重復性定量驗證，證實了31P NMR檢測混合磷脂中單體組分的可行性。但實驗中未很好地控制pH，檢測過程中發生磷脂單體水解等不良副反應[10]，影響磷脂組分定量的準確性。而且施邑屏等[9]所使用的核磁工作頻率僅為90 MHz，單峰信號的分離度不足。龐思勉等[11]運用該法檢測了堅果中磷脂的組成，并對該法的定量性及檢出限進行驗證，結果同樣存在檢測工作頻率低造成分離度不足的問題。近年來，國外一些學者研究了將31P NMR運用于植物毛油磷脂組成檢測的方法[12]，但這些方法都需要先對毛油中的磷脂進行富集，再進行檢測。

本文采用31P NMR檢測25種不同來源大豆毛油中磷脂的PA含量，并探討了PA含量與毛油中游離脂肪酸、金屬離子含量的相關性，以期為脫膠方法的選擇提供簡單有效的判斷依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

25種大豆毛油由益海嘉里集團提供；氘代氯仿、99.5%一水合氫氧化銫由Aldrich Chemical公司提供；其余試劑為分析純，由國藥集團化學試劑有限公司提供。鈣鎂檢測時樣品以10倍航空煤油稀釋，實驗用航空煤油由蘭州煉油廠提供。

Bruker Ascend 400型超導核磁共振波譜儀，安捷倫7700x型ICP-MS。

1.2 實驗方法

1.2.131P NMR檢測磷脂組成[12]

稱取80～90 mg油樣，添加以氯仿稀釋的磷酸三甲酯(TPP)溶液(體積比1∶50)為內標，添加量為5 μL。依次加入氘代氯仿，甲醇，pH為8.5、濃度為0.2 mol/L EDTA-Cs各600 μL，混勻后加入核磁共振管。

分析條件：31P NMR工作頻率600 MHz；檢測探頭PABBO NMR；溫度25℃；脈沖寬度11.2 μs；脈沖延遲時間2 s；掃描次數16；31P NMR的譜寬64 102 Hz；采樣點數65 536。

采用內標法定量計算毛油中磷脂各組分的含量以及各磷脂組分在毛油的總磷脂中的占比。

1.2.2 指標測定

鈣鎂離子含量的測定參照AOCS檢測方法Ca 20-99；酸值的測定參照GB/T 5530—2005；磷含量的測定參照GB/T 5537—2008。

1.2.3 數據處理

采用SPSS19.0進行顯著相關性、顯著差異性分析，相關性分析采用Person分析(p<0.05)，差異性分析采用ANOVA分析(p<0.05)。

2 結果與分析

2.1 大豆毛油磷脂的31P NMR分析

大豆毛油中的磷脂組分主要為磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)，此外還存在少量溶血磷脂酰膽堿(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、N-?；字Ｒ掖及?APE)等組分。影響磷脂31P NMR化學位移的主要因素為相連X基團的電負性、共軛性以及鍵角[13]，以磷原子為中心，相連各基團對稱性越強，化學位移越向高場(正為低場，負為高場)移動，通過檢測條件的優化，實現大豆磷脂各組分的有效檢測。

圖1為2015年6月份由益海嘉里南天工廠提供的以巴西大豆為原料的大豆毛油的31P NMR檢測圖譜。由圖1可以看出，除了4種主要磷脂外，含量較低的溶血磷脂、APE等也均在圖上得到了分開的單峰信號。各主要峰分離度高，峰型規整，檢測效果良好。

圖1 大豆毛油的 31P NMR檢測圖譜

2.2 大豆毛油的PA占比、磷含量、金屬離子含量、酸值

本實驗涉及25種毛油使用了來自4個不同國家的大豆，由益海嘉里集團下屬的8個不同地區工廠生產提供。其中14種大豆毛油以巴西大豆為原料，4種大豆毛油以美國大豆為原料，4種大豆毛油以國產大豆為原料，2種大豆毛油以阿根廷大豆為原料，1種大豆毛油的原料為美國大豆和巴西大豆的混合大豆。25種大豆毛油的PA占比(以在磷脂中計)、磷含量、鈣鎂離子含量和酸值見表1。

表1 25種大豆毛油的PA占比(以在磷脂中計)、磷含量、鈣鎂離子含量和酸值

由表1可以看出，25個油樣中有7個樣品的PA占比超過30%，這些樣品均以來自巴西的大豆為原料。巴西大豆制得毛油的磷脂中，PA占比極顯著高于其他地區大豆生產的毛油(p<0.01)。美國大豆為原料制取的毛油中，PA在磷脂中的占比顯著低于其他大豆毛油(p<0.05)，兩種PA占比最低的樣品，均使用了來自美國的大豆為原料。中國及阿根廷的大豆制得的毛油PA在磷脂中的占比處于中等水平，大部分在20%～25%之間。不同地區大豆生產的毛油在磷含量上不存在顯著性差異。

對采集的25種毛油進行鈣、鎂、鐵、銅、鎳等全金屬離子分析后發現，所有毛油中鈣、鎂離子的含量均遠遠高于其他金屬離子，因此可以用鈣鎂離子含量代表毛油中的金屬離子含量。25個樣品中，鈣鎂離子含量超過300 mg/kg的3種大豆毛油，均由巴西大豆制得，同時也有一些巴西大豆毛油的鈣鎂離子含量較低，其中3種大豆毛油的鈣鎂離子含量低于200 mg/kg，總體而言，巴西大豆毛油與其他來源大豆生產的毛油，在鈣鎂離子含量上不存在顯著性差異。與其他毛油相比，美國大豆毛油的鈣鎂離子含量顯著偏低(p<0.05)，其中最高的美國大豆毛油鈣鎂離子含量僅為226.70 mg/kg。

不同來源大豆毛油在酸值上同樣存在顯著性差異。巴西大豆毛油的酸值顯著高于其他大豆毛油(p<0.05)，美國大豆毛油的酸值顯著低于其他來源大豆毛油(p<0.05)。就所采集樣品而言，巴西大豆毛油的平均酸值(KOH)為2.57 mg/g，美國大豆毛油平均為1.08 mg/g，阿根廷大豆毛油平均為2.36 mg/g，中國大豆毛油平均為1.43 mg/g；美國、巴西混合大豆所制毛油的酸值(KOH)為 3.11 mg/g，高于美國大豆毛油和巴西大豆毛油的平均值。

值得注意的是，10號、11號、14號樣品均由同一家工廠提供，且原料為同批進口大豆，生產時間分別為2015年7月、8月、6月。3批毛油中，7月份生產的大豆毛油PA占比略高于另外兩個月生產的大豆毛油。根據當地氣象資料，該地區2015年7月份平均氣溫為全年最高，為32℃左右，其他月份的平均氣溫均未超過30℃，7月份大豆內磷脂酶酶活力最高[14]，這可能是該樣品的磷脂組成中PA占比略高的原因。

2.3 大豆毛油的PA含量與金屬離子含量及酸值間的相關性分析

考察25種大豆毛油中PA含量與鈣鎂離子含量的關系，結果如圖2 所示。

圖2 大豆毛油中PA含量與鈣鎂離子含量的關系

經分析，大豆毛油中PA含量與金屬離子含量存在極顯著正相關關系，相關系數為0.738(p<0.01)。PA的結構中有兩個羥基，與二價金屬離子，如鈣、鎂離子等，有很強的親和力[2]，當其他條件相仿時，大豆毛油中的PA含量增高通常會導致金屬離子含量的上升。

阿根廷大豆制取的毛油與其他樣品相比，每毫克PA結合到的鈣鎂離子量極顯著偏高(p<0.01)，每毫克PA平均結合到0.082 mg鈣鎂離子。巴西大豆和國產大豆生產的毛油每毫克PA平均結合到0.050 mg左右鈣鎂離子，美國大豆毛油每毫克PA平均結合到0.060 mg 鈣鎂離子?？梢姶蠖沟钠贩N、生長環境等條件可能會影響PA含量與金屬離子含量間的關系[15]。

毛油生產工藝也可能對PA含量與金屬離子含量間的關系造成影響。本實驗收集的毛油絕大多數為浸出法制備的毛油，但21號大豆毛油通過壓榨法生產得到，該毛油中每毫克PA結合到的鈣鎂離子與其他浸出法國產大豆毛油相比，顯著偏高，正常國產浸出大豆毛油每毫克PA平均結合鈣鎂離子為0.037 mg 左右，壓榨大豆毛油每毫克PA平均結合鈣鎂離子為0.066 mg。此外，大豆品質也可能影響PA與金屬離子結合能力，劣質國產浸出大豆毛油(19號樣品)每毫克PA平均結合量達0.058 mg(以鈣鎂離子計)。

考察25種大豆毛油中PA含量與酸值的關系，結果如圖3所示。

圖3 大豆毛油中PA含量與酸值的關系

經分析發現，大豆毛油所含PA的含量與游離脂肪酸含量(以酸值表示)不存在顯著性關聯(p>0.05)。

3 結 論

以收集到的25種以不同來源大豆為原料，對由不同工廠在不同時間段加工生產制得的毛油進行分析后發現，大豆的來源、儲存溫度、生產工藝等條件均可能對毛油中包括磷脂、金屬離子、游離脂肪酸在內的雜質組成和含量造成一定影響。本實驗涉及的樣品中，以巴西大豆為原料制取的大豆毛油PA占比和游離脂肪酸含量普遍較高；美國大豆制得的大豆毛油PA占比低、游離脂肪酸含量少，品質普遍較好。生產工藝對大豆毛油品質存在一定影響，當原料、生產工藝等條件相近時，環境溫度對生產的大豆毛油品質也有一定影響。

在工廠的實際生產中，磷脂組分的定量檢測存在諸多不便。本文考察了金屬離子及酸值與磷脂酸含量間的關系，發現大豆毛油中金屬離子含量與PA含量存在極顯著正相關關系，酸值與PA含量不存在顯著性關聯。對于工廠而言，可以通過金屬離子含量大致推測毛油中非水化磷脂的含量高低，指導后續脫膠方法、條件的選擇。

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Determination of phospholipids composition in crude soybean oil from different sources by nuclear magnetic resonance and comparison of phosphatidic acid content

YU Le1，CONG Fang2，WANG Xingguo1，JIN Qingzhe1，JIANG Yuanrong2

(1. School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China;2.Wilmar Biotechnology Research & Development Center (Shanghai) Co.，Ltd.，Shanghai 200137，China)

The crude vegetable oil contained a finite amount of colloid substance which was mainly composed of phospholipids. In order to ensure the smooth operation of physical refining，the crude vegetable oil needed to be degummed firstly. Comprehensive considering the factors of origin，processing technology and production batch，25 kinds of crude soybean oils were collected and their phospholipids compositions were analyzed by31P NMR.The relationships between the contents of phosphatidic acid content and other impurities in crude oil were studied. The results showed that there were significant differences in phospholipids compositions in crude oils which were made from different varieties of soybeans (p<0.05)，but there was no significant difference in phosphorus content. The proportion of phosphatidic acid in phospholipids increased with the storage temperature rising. The contents of phosphatidic acid and metal ions in crude soybean oil were markedly positive correlated(p<0.01). There was no significant correlation between the contents of phosphatidic acid and free fatty acids(p>0.05).

crude soybean oil; phospholipid composition; NMR; phosphatidic acid

2016-04-05；

2016-09-26

俞 樂(1990)，女，在讀碩士，研究方向為植物油的磷脂檢測及酶法脫膠(E-mail)lyhappyfish@126.com。

王興國，教授(E-mail)wxg1002@qq.com。

TS225.1;TQ646

A

1003-7969(2017)01-0130-04