花生Clp家族成員的篩選、聚類和鹽脅迫響應分析

鄭春花+孔祥遠+陳冠旭+隋炯明+喬利仙+王晶珊+趙春梅

摘 要：Clp蛋白酶是一種ATP依賴的絲氨酸型蛋白酶，廣泛存在于原核和真核生物中，在生物抗逆脅迫中發揮重要作用。為分析花生中Clp基因的情況，我們構建了花生葉片轉錄組數據庫，通過生物信息學手段鑒定出28個Clp基因，分別位于花生A組野生種的9條染色體上；聚類分析表明，花生的28個Clp基因分別聚到已報道的ClpB、C、D、X、P、R和S 7個亞類中。利用花生耐鹽突變體（S2）和對照（S4）構建了鹽脅迫處理前后各時間段的表達譜數據，進行Clp基因鹽脅迫表達分析，結果表明16個Clp基因在S2和（或）S4中受鹽脅迫誘導表達。該研究為花生Clp基因的功能研究與利用奠定基礎。

關鍵詞：花生；Clp基因；RNA測序；鹽脅迫

中圖分類號：S565.203.53文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）12-0001-05

Abstract Clp is a kind of ATP-dependent protease widespreading in prokaryote and eukaryote， which plays an important role in resisting biotic and abiotic stresses in plants. To improve the understanding of Clp genes in peanut，28 Clp genes were screened by one transcriptome library constructed with peanut leaves. These 28 Clp genes distributed on 9 chromosomes respectively of A genome of wild peanut. Clustering analysis showed that these 28 Clp genes were assorted to ClpB， C， D， X， P，R， S groups reported previously. To analyze the response to salinity stress of 28 Clp genes，digital gene expression profiles were constructed using a mutant with higher salinity resistance （S2） and its control （S4） before and after treated with 250 mmol/L NaCl. The results showed that 16 Clp genes were responsive to salinity stress in S2 and/or S4. This study provided bases for functional researches and application of Clp genes in peanut.

Keywords Peanut （Arachis hypogaea L.）；Clp gene；RNA sequencing；Salinity stress

Clp蛋白酶是一種ATP依賴的絲氨酸型蛋白酶，屬于AAA+類ATP酶超級家族。Clp家族基因在植物中廣泛存在，有些成員在受到非生物脅迫時可被誘導表達。藍藻在強光、低溫、UV-B等外界脅迫下的生長狀況與Clp蛋白酶密切相關[1]。擬南芥和玉米胞質ClpB基因能夠恢復其突變體的耐熱性[2-4]。超表達擬南芥胞質ClpB基因后，擬南芥生長速度加快，而且能夠耐45℃的高溫脅迫[5]。反義抑制番茄的葉綠體類ClpB基因后，轉基因植株對高溫更為敏感，表明葉綠體類ClpB基因可能是植物耐熱過程中的重要蛋白[6]。擬南芥ClpA類似物在水分脅迫下被誘導表達，在植株衰老時表達量有所增加[7]。但Clp基因與植物耐鹽性關系的報道非常少。

花生是重要的油料和經濟作物，培育高產耐鹽花生品種不僅可以豐富育種資源，同時對花生耐鹽的分子機理研究也具有重要作用。然而花生缺乏耐鹽種質資源[8]，利用常規雜交方法難以選育出耐鹽品種。因此挖掘花生的耐鹽基因并進行功能研究是花生抗逆分子育種的重要任務之一。

目前，關于花生中Clp基因的研究相對較少。紀鴻飛等[9]利用花生品種魯花14號種子不同發育時期混合cDNA文庫，篩選到1個AhClpP蛋白酶基因，但未報道該Clp基因是否受脅迫誘導。為了探究Clp基因在花生中是否受鹽脅迫誘導表達，本研究從轉錄組整體水平上分析花生Clp基因的染色體定位和分類，并利用構建好的表達譜尋找鹽脅迫響應的Clp基因，為進一步研究它們的功能以及利用它們改良花生抗逆性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

前期我們以平陽霉素為誘變劑進行了花生離體誘變，經篩選獲得一批穩定遺傳的突變體[10]，其中1個突變體（S2）在0.7% NaCl溶液中的發芽率可達到50%以上，而對照花育20（S4）在0.7% NaCl溶液中的發芽率只有6.7%，且S2比S4具有更高的SOD和POD值。本研究即以花生耐鹽突變體（S2）和花育20（S4）為材料。

1.2 花生葉片轉錄組數據庫構建

用250 mmol/L NaCl處理耐鹽突變體S2和對照S4，在0、6、12、24、48 h取葉片分別提取總RNA，S2的5個樣品分別命名為S2_0、S2_6、S2_12、S2_24和S2_48；S4的5個樣品分別命名為S4_0、S4_6、S4_12、S4_24和S4_48，每個樣品包含2個生物學重復。將所有樣品RNA混合后構建轉錄組文庫，送交北京諾和致源公司進行雙向測序，組裝處理后獲得非冗余Unigene序列，在NCBI數據庫注冊（注冊號：SRR311451）。用NR、NT、SwissProt、PFAM、KOG、GO、KEGG數據庫進行基因功能注釋。

1.3 鹽脅迫處理前后花生葉片表達譜數據庫構建

對上述樣品采用Solexa技術分別進行數字化表達譜測序，構建花生葉片鹽脅迫處理前后的表達譜數據庫（NCBI注冊號：SRR3210665和SRR3210666），并以上述轉錄組數據庫為參考，對整理去雜后的表達譜數據庫Unigene序列進行分析。

1.4 Clp家族基因的篩選、結構分析和染色體定位

根據上述7大數據庫的基因功能預測搜索Clp基因。利用SMART在線工具進一步分析結構域，去除無典型結構域的基因。蛋白的分子量和理論等電點利用http：//www.expasy.org進行分析。從花生全基因組數據（http：//www.peanutbase.org）下載A組野生種基因組序列，進行基因序列比對，取相似度最高的序列作為目標基因，并根據數據庫的預測和比對結果進行外顯子-內含子結構分析。根據與基因組比對后基因位置的顯示結果，標示每個基因在染色體上的位置，得到各個基因在染色體上的分布狀況。

1.5 系統發育樹的構建

通過Clustal X程序對花生和擬南芥Clp蛋白進行多序列聯配分析，序列聯配結果使用MEGA4.0程序構樹。采用鄰接法生成Clp基因的系統進化樹，bootstrap值設置為1 000。

1.6 Clp基因的鹽脅迫響應分析

應用DESeq R package （1.10.1）對S2或S4樣品中某一基因在脅迫處理0、6、12、24、48 h的任意2個時間段間的表達量進行比較，如果達到顯著上調或下調（應用Benjamini和Hochberg的方法調整P值，調整后的P<0.05）水平，則認為該基因對鹽脅迫有響應。

2 結果與分析

2.1 花生Clp基因家族的鑒定

根據7大數據庫的基因功能預測結果，我們從花生葉片轉錄組數據庫中篩選出多個候選Clp基因，將其與公布的花生A組野生種基因組序列進行比對，去除比對到同一位置的Clp基因，最終得到28個花生Clp基因。根據比對的基因位置顯示結果得到28個Clp基因在花生A組野生種染色體上的位置信息，這些基因分布在9條染色體上，第1號染色體分布的成員數量最多，有6個；其次為第3號、4號和8號染色體，各有4個Clp基因；而第6號染色體上不含有Clp基因；第4號染色體在63 kb范圍內有3個緊密連鎖的Clp基因（c52883_g1、c50546_g1和c61473_g1）?；ㄉ鶦lp氨基酸殘基個數在不同成員間差別很大，長度范圍為142～1 118個殘基，其等電點范圍從5.59到9.82，基因編碼產物全部定位在葉綠體或線粒體上?；蚪Y構分析顯示，外顯子個數從2個到15個不等（表1）。

2.2 花生Clp家族基因的聚類分析

擬南芥至少有26個Clp基因，可分為ClpB、C、D、X、P、R和S 7個亞類[11]。根據Clp蛋白家族成員長度差異、含不同特征的結構域等特點，對花生28個Clp蛋白與擬南芥的Clp蛋白進行多重序列比對和系統進化分析。結果表明，花生的28個Clp蛋白都能聚到ClpB、C、D、X、P、R和S 7個亞類中，這7個亞類分別包含6、2、1、4、5、3個和7個花生Clp蛋白。在擬南芥中ClpP亞類有6個成員，其中ClpP1由質體編碼，其它由核基因編碼，我們在花生中篩選到5個ClpP蛋白，分別與擬南芥的ClpP2、3、4、5、6聚到一類。

2.3 花生Clp家族基因的鹽脅迫響應分析

我們利用鹽脅迫處理前后S2和S4的數字表達譜，對28個Clp基因在脅迫處理前后任何2個時間段間的表達量進行比較，根據調整后的P值，確定其是否受鹽脅迫誘導表達，結果列于表2和圖2?？梢钥闯?，在S2中，與脅迫處理前相比，脅迫處理6 h后，差異表達的基因最多，有2個上調，2個下調；而在S4中，與脅迫處理前相比，脅迫處理12 h后，差異表達的基因最多，有2個上調，4個下調。

進一步分析發現，6個基因（c43789_g1、c36018_g1、c31985_g1、c29574_g1、c42812_g4、c38266_g1）在S2和S4中均受鹽脅迫誘導表達；2個基因（c35026_g1、c56996_g1）只在S2中受鹽脅迫誘導表達；8個基因（c42246_g3、c42960_g1、c61473_g1、c41338_g1、c44270_g1、c49696_g1、c42812_g1、c40559_g3）只在S4中受鹽脅迫誘導表達。其中，c42246_g3、c61473_g1、c36018_g1、c42960_g3、c43789_g1這5個基因在耐鹽突變體S2和對照S4中表達模式完全一致，都為上調-下調-上調-上調；而c49696_g1、c44270_g1、c42812_g1、c31985_g1、c40559_g2、c56996_g1這6個基因在S2和S4中表現出截然不同的表達模式。

各基因FPKM值差異很大， S2中FPKM值的變化范圍為0.33～267.41， 而S4中FPKM值的變化范圍為0.43～285.92（圖2）。與脅迫處理前相比，鹽脅迫處理48 h后，c43789_g1在S2和S4中的表達量均顯著上調，log2（fold change）分別達到3.84和5.46；鹽脅迫處理12 h時與6 h相比，c36018_g1在S2和S4中的表達量均顯著下調，log2（fold change）分別達到-2.71和-3.44，而隨著鹽脅迫處理時間的增加，該基因的表達量迅速增加，48 h與12 h相比，該基因的log2（fold change）分別達到2.58和3.85。c31985_g1 和c38266_g1這2個基因的表達量在多個時間段間的表達量差異都達到顯著水平。鹽脅迫處理6 h時，c42246_g3在S2和S4間表達量差異達到顯著水平，推測該基因可能與這兩個材料的耐鹽性差異有一定聯系（結果另文發表）。

結合聚類分析結果，上述16個受鹽脅迫誘導的Clp基因涉及到除ClpR亞類外的其余6個亞類，其中ClpC（2/2）和ClpD（1/1）2個亞類中的基因均受鹽脅迫誘導表達；其次為ClpS（5/7）和ClpB（4/6）2個亞類，絕大多數成員受鹽脅迫誘導表達；而ClpP（2/5）和ClpX（2/4）只有個別成員受鹽脅迫誘導表達。

3 討論與結論

植物在生長過程中，不可避免地會受到各種逆境脅迫條件的影響。在長期的進化過程中， 植物自身已經形成了多種抵抗脅迫的機制，例如：當植物細胞經歷生化代謝或受到脅迫后， 會產生一些不可逆損傷的蛋白或多肽，這些蛋白喪失了其天然構象或活性，而生物體內的蛋白酶可以維持它們的穩定、促進其再折疊或者降解。因此，蛋白酶在調節蛋白代謝過程及清除損傷蛋白過程中起關鍵作用[12]。多數細胞內的蛋白水解作用通過依賴于能量的蛋白酶來完成，Clp蛋白酶就是其中之一。

為了分析花生中Clp家族成員的情況，我們利用構建的花生葉片轉錄組數據庫篩出28個Clp蛋白酶基因，它們位于花生A組野生種的9條染色體上，不同染色體上的Clp基因數目差異很大。根據已有報道，Clp蛋白可分為兩大類：ClpP蛋白家族和Hsp100/Clp分子伴侶家族。前者組成Clp蛋白酶的催化亞基，后者組成Clp蛋白酶的調節亞基（成員包括 ClpA、B、C、D、M、N、X 及Y等）[13]，ClpP通常與分子伴侶組合成為Clp復合物，共同行使蛋白酶的功能。在擬南芥中已經發現與ClpP 具有相似蛋白序列的基因ClpR，但它們缺乏ClpP所具有的蛋白酶活性中心。此外在擬南芥中還發現了不屬于任何已知Clp基因家族的ClpS蛋白[14]。我們對花生的28個Clp基因進行了聚類分析，結果表明這28個Clp基因分別聚到已報道的ClpB、C、D、X、P、R和S 7個亞類中，與擬南芥的Clp基因分類結果完全一樣。

我們還利用花生耐鹽突變體（S2）和對照（S4）構建了鹽脅迫處理前后各時間段的表達譜數據，進行基因鹽脅迫表達分析，結果表明16個Clp基因受鹽脅迫誘導表達，這16個基因涉及除R亞類外的其它6個亞類。ClpS和ClpB亞類中受鹽脅迫誘導表達的成員最多；同一亞家族內的基因表達模式并不完全相同，例如ClpP和ClpX只有個別成員受鹽脅迫誘導表達，暗示它們可能在進化過程中發生了功能分化。該研究可為花生Clp蛋白酶基因的耐鹽功能研究與利用提供重要參考。

參 考 文 獻：

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