SNP分子標記技術在經濟甲殼動物中的應用進展

趙 蓮，薛 蓓，高 煥,2,3，閻斌倫,2,3

(1．江蘇省海洋生物技術重點實驗室，淮海工學院，連云港 222005； 2. 江蘇省海洋生物產業技術協同創新中心，連云港 222001; 3. 江蘇省農業種質資源保護與利用平臺，南京 210014)

·綜述·

SNP分子標記技術在經濟甲殼動物中的應用進展

趙 蓮1，薛 蓓1，高 煥1,2,3，閻斌倫1,2,3

(1．江蘇省海洋生物技術重點實驗室，淮海工學院，連云港 222005； 2. 江蘇省海洋生物產業技術協同創新中心，連云港 222001; 3. 江蘇省農業種質資源保護與利用平臺，南京 210014)

作為第三代分子標記，單核苷酸多態性標記(SNP)具有豐富度高、密度大、穩定性強、共顯性等特點，成為目前蝦、蟹等經濟甲殼動物中應用最廣泛的分子標記技術。本文對經濟甲殼動物中SNP技術的發展及其在高密度遺傳連鎖圖譜的構建、種質資源遺傳多樣性分析、分子輔助育種等方面的應用進展進行了綜述，并提出了未來有待加強的研究方向，以期為經濟甲殼動物種質資源的開發和利用提供理論指導。

SNP； 經濟甲殼類； 研究進展； 種質資源

作為第三代分子標記的典型代表，單核苷酸多態性標記(single nucleotide polymorphism，SNP)與傳統分子標記(RFLP、RAPD、SSR)相比，不僅具有多態性高、分布廣、遺傳穩定性強等特點，而且可以實現高通量、自動化檢測，具有低成本、高效率的優點[1]，因而成為研究生物表型與基因型之間關系的重要橋梁[2]。隨著分子標記及其檢測技術的不斷發展，SNP分子標記技術發展迅速，已廣泛應用于畜牧業種質資源的鑒定[3]、植物遺傳圖譜的構建[4]、人類疾病的防控[5]等諸多研究領域。

近年來，SNP標記技術在水產生物研究中也得到了廣泛應用，已經用于藻類品種鑒定[6]、魚類遺傳結構及多樣性分析[7-8]以及貝類基因多態性關聯研究[9]等方面，并取得了重要進展。目前，該標記技術在經濟甲殼動物中也得到了廣泛的應用，在甲殼類生物遺傳圖譜的構建、種質資源遺傳結構與遺傳多樣性分析以及分子標記輔助育種等方面都取得了重要的研究進展。本文對此進行綜述，以期為甲殼類生物優良品種的開發及其資源的可持續發展提供新的思路和理論指導。

1 甲殼類生物中應用到的SNP標記檢測技術

作為新型分子標記技術，SNP的檢測技術也在不斷地推陳出新，包括以單鏈構象多態性[10](single-strand conformational polymorphism, SSCP)、酶切擴增多態性序列[11](cleaved amplified polymorphic sequences, CAPS)、片段差異等位基因特異[12](fragment length discrepant allele specific PCR, FLDAS-PCR)等基于凝膠電泳技術的傳統檢測方法，以焦磷酸測序[13](pyrosequencing)、微測序[14](SNaPshot)等直接測序法以及高分辨率熔解曲線分析[15](high resolution melting, HRM)等基于高通量、自動化程度較高的新興檢測技術。與魚類、貝類等其它水生動物相比，SNP標記在甲殼類生物中的開發與應用較晚，但發展迅速。目前甲殼類中應用到的SNP檢測技術主要有SSCP、直接測序、HRM等。

1.1 SSCP

SSCP檢測技術依據單個或多個核苷酸的差異而引起單鏈DNA的空間構象的差異，使得長度相同或相近的單鏈DNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(native-PAGE)中的遷移速率不同，從而檢測出基因的多態性。隨著PCR技術的發展，SSCP被廣泛用于PCR產物的檢測，即PCR-SSCP[10]，該檢測技術由于成本低廉、操作簡單，被認為是SNP最為經典的檢測方法之一[16]，近年來，也成為甲殼類生物SNP多態性檢測常用的技術手段[17-18]。

但是，該檢測技術對于引物設計、PCR產物、制膠等方面均有嚴格的要求[19]，因此存在操作繁瑣、耗時等缺點。此外SSCP檢測技術只能定性地判斷基因片段的多態性，不能對突變位點進行準確定位與分型，因此該檢測技術不適用于高通量的SNP檢測與分型，因而研究者轉而開發更為快速、實用的SNP分型技術。

1.2 直接測序技術

直接測序技術通過對比不同樣本的同一基因或基因片段的PCR擴增產物的測序結果進行直接對比來發掘SNP位點[20]。與SSCP相比，直接測序技術具有高通量、自動化程度高且能夠準確檢測出突變類型和突變位點，同時也避免了電泳等繁瑣程序，使染色體數量較多的甲殼類生物的SNP檢測水平得到了極大的提高。CIOBANU等[21]利用直接測序技術將凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)、斑節對蝦(Penaeusmonodon)以及日本囊對蝦(Penaeusjaponicus)的基因組序列進行對比分析，最終在凡納濱對蝦基因組中篩選出了1221個候選SNPs；LIU等[22]通過直接測序在凡納濱對蝦的ESTs中發掘出17 225個候選SNPs。直接測序技術為甲殼類生物高密度SNP遺傳連鎖圖譜的構建提供了技術條件。

與傳統克隆測序相比，直接測序技術具有快速、直接、穩定等優點[23]，但是該技術對PCR產物的特異性要求較高，同時也受模板大小及用量的影響；此外該技術應用于高通量的SNP檢測與分型，所耗成本較高，因此限制了SNP標記的大量開發、利用和推廣。

1.3 HRM

高分辨率熔解曲線分析(high resolution melting, HRM)，最早由猶他大學和愛德華科技公司聯合開發，是以常規高分辨率曲線分析技術、飽和熒光染料(ResoLight 、LCGreen、SYT09)以及采集熒光信號的儀器相結合而發展起來的新型SNP檢測及其分型技術。該技術在PCR結束后，直接進行高分辨溶解曲線分析，通過飽和染料監控核酸溶解過程得到特征性溶解曲線，再根據熔解曲線的變化來判斷核酸性質的差異[24]。在國內，吳瑩瑩等[25]首次將該技術應用到中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)免疫相關基因SNP的檢測，并把不同SNP基因型與抗WSSV的特性進行了關聯分析，這為甲殼類生物優良品種的快速選育奠定了良好的基礎。

與SSCP、直接測序等其它檢測技術相比，該技術不僅能夠實現SNP的高通量與自動化檢測，而且能對純合子、雜合子基因型進行準確區分[20,26-27]。該檢測技術用于SNP分析時主要有兩種方法可供選擇，一是非標記探針法，其過程是先進行不對稱PCR，擴增出的目的條帶再與互補探針進行雜交，加入熒光染料，通過Light Scanner系統可顯示不同的溶解曲線；二是小片段法，使用了與雙鏈DNA結合的飽和熒光染料，熒光信號強度與DNA雙鏈濃度成正比，通過逐步增加溫度同時監測每一步的熒光信號來產生熔解曲線，該熔解曲線的一階導數圖在DNA雙鏈的Tm值上有一特征峰，具有不同Tm值的DNA雙鏈形成的特征峰的位置存在差異[28]。非標記探針技術對于已知SNP位點可以快速地進行檢測，但在SNP位點分布較為密集的片段區域，其分析存在一定的困難，此外該分型技術在探針的設計與不對稱PCR的過程均有著嚴格的要求，因此存在既耗時又繁瑣的缺點，不利于該分型技術的推廣。相較于非標記探針法，小片段法不僅特異性強，避免了前者復雜的操作過程，而且降低了SNP的開發成本，提高了開發效率[29]。

1.4 其它檢測方法

理論上，任何用于檢測單個堿基突變或者多態的方法均可用于SNP的識別與檢測。甲殼類生物染色體數目較多，其基因組中SNPs分布廣泛，但隨著檢測技術及檢測設備的迅速發展，實現對這些SNPs高通量、自動化檢測已成為可能。自2005年以來，以羅氏公司研發的454測序儀(Roch GS FLX sequencer)、美國Illumina公司的Solexa基因組分析平臺(genome analyzer platform)等為代表的高通量測序技術相繼誕生[30]，這為甲殼類生物中龐大數量的SNP標記開發奠定了重要基礎。ZHANG等[31]在454高通量測序系統的基礎上，針對中國明對蝦設計引物，最終篩選出180個SNP標記，首次建立了中國明對蝦的SNP連鎖圖譜；李希紅[32]基于Illumina HiSeq 2000 雙端測序，然后進行序列對比分析，最終分別在中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)的肝胰腺和幼體轉錄組中分別篩選出60 517和49 555個SNPs。

對于SNP檢測的方法還有很多，目前無論何種SNP的檢測技術和方法都應考慮其是否具備快速、簡便、高通量、低成本等條件。

2 SNP分子標記技術在甲殼類中的應用

2.1 高密度遺傳連鎖圖譜的構建

相比大多數魚類和貝類，經濟甲殼類動物由于染色體數量較多[33-34]，因此需要構建的遺傳連鎖圖譜群也隨之增多，這給高密度遺傳連鎖圖譜的繪制帶來了一定程度的困難。而相比于其它分子標記而言，SNP標記所具有的位點分布廣、多態性高、呈共顯性遺傳等獨特的優勢[35-36]，使其成為經濟甲殼類動物遺傳連鎖圖譜構建的強有力工具。DU等[37]在凡納濱對蝦中繪制出了首張SNPs連鎖圖譜。張建勇[38]首個構建了中國明對蝦的雌雄SNPs圖譜，由21個連鎖群組成，分別包括119、115個SNP位點，全長分別為876.2、879.7 cM，覆蓋率分別為53.77%和51.94%。

隨著越來越多的SNP被開發，其圖譜覆蓋整個染色體基因組的程度也越來越高，FOLEY等[39]利用190個SNPs在一種小型甲殼類動物海洋水蚤的250個子代個體間構建出了圖譜全長為401 cM，其覆蓋率達73.7%。BARANSKI等[40]在斑節對蝦中應用3 592個SNPs繪制了一個可覆蓋整個核基因組高達82%的連鎖圖譜。

2.2 種質資源遺傳結構及遺傳多樣性研究

目前，SNP標記技術主要集中應用于蝦、蟹等經濟甲殼類群體品種鑒定[41]、基因組遺傳結構變異[42]及多樣性分析[43]等領域的研究與應用。SNP標記在甲殼類種質鑒定、遺傳結構及遺傳多樣性分析方面也得到了廣泛應用。高天翔[44]利用部分線粒體DNA(12S rRNA)試圖將中華絨螯蟹和日本絨螯蟹(Eriochierjaponica)這兩個品種區分開來，但由于該區域的保守性，無法將其區分；隨后，孔曉瑜等[45]基于線粒體DNA的COI基因，尋找其單核苷酸多態性，結果顯示該兩種絨螯蟹確實來自于兩個不同的品種。此外，ZHANG等[41]最終在中華絨螯蟹、合浦絨螯蟹(Eriocheirhepuensis)的Cytb和COI區分別找到了能夠穩定遺傳的SNP位點，并成功開發出基于SNP標記的DNA條形碼。

由于過度捕撈，野生群體資源在不斷地減少，利用SNP標記技術對自然群體或者不同部分地理群體的遺傳結構進行分析，評估其遺傳多樣性情況，可為后續的種質資源管理與保護提供指導作用。FENG等[46]在擬穴青蟹的轉錄組中成功開發出91個SNPs，其中40個標記已在30個野生個體間得到了分型與標記，為該群體遺傳多樣性的追蹤奠定了重要基礎。BATTA等[42]在南極大磷蝦(Euphausiasuperba)mtDNA的Cytb區中發現了能穩定遺傳的SNP位點，并對2001～2002年間南極半島區域該生物的線粒體結構進行了差異分析，結果顯示該區域的群體存在分化現象，為進一步研究其它區域該群體的進化歷程(起源、遷入、遷出、遺傳、漂變)奠定了重要基礎。

2.3 分子標記輔助育種

利用分子標記技術進行輔助育種，已成為動物育種過程中重要的手段和方法。SNP標記由于在基因組中分布廣，如在人類中每1 000 bp就存在一個SNP位點[47]，因此，這些標記與特定性狀基因關聯的潛在可能性很高[48]，這為篩選與該分子標記連鎖的特定性狀相關功能基因提供了機會，進而為展開相應的分子標記輔助育種奠定了基礎。

2.3.1 生長性狀相關功能SNP位點篩選

與魚類、貝類等其它水產動物相比，甲殼類動物有其獨特的生長發育史，受多個基因共同調控，因此其生長發育調控機制也會相對復雜。目前，與甲殼類生長相關基因有淀粉酶基因[49-50](AMY)、組織蛋白酶基因[18,51](CTSL)、蛻皮抑制激素[52](MIH)、肌肉生長抑制素基因[53](MSTN)等，但是這些基因的多態性與其相應的功能關聯研究還不多，僅集中于AMY、CTSL等少數幾個基因上。辛靜靜[18]在凡納濱對蝦AMY基因外顯子區發現A4、A5、A6基因座以及CTSL基因外顯子區C6基因座均存在SNP位點，對這些基因多態性與生長性狀的關聯進行分析，結果顯示AMY與CTSL基因多態性對該生物的生長發育均有一定程度的影響。

2.3.2 抗病性狀SNP位點的篩選

病害是危害經濟甲殼類養殖效益的重要因素之一，因此尋找特定抗病的基因或者SNP位點已成為甲殼類分子標記輔助育種中的一個熱點。逄錦菲[54]在中國明對蝦中篩選出了與抗WSSV(white spot syndrome virus, 白斑綜合癥病毒)性狀有關的9個SNPs；隨后，劉敬文[55]在凡納濱對蝦多家系抗WSSV實驗中，發現凡納濱對蝦的一種重要免疫效應因子ALFs序列中有多個SNPs位點。近年來，在中華絨螯蟹、擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)、對蝦等甲殼類抗病性狀基因SNPs篩選進程中也取得了重要的突破。李希紅[32]在全基因組范圍內規?；Y查與抗病相關的SNP位點，結果顯示，在中華絨螯蟹重要免疫組織肝胰腺及其幼體轉錄組中分別檢測到60 517和49 555個SNP標記位點，并經過免疫實驗，發現其中一些SNP位點與中華絨螯蟹抗病有著一定的相關性；YANG等[56]和BLANCK等[57]分別在擬穴青蟹的HSP70基因、亞馬遜淡水蝦(Macrobrachiumamazonicum)HSC70基因中均發現了SNP位點。

2.3.3 其它性狀相關SNP位點的研究

近年來，育種專家們不僅篩選了一些與甲殼類生長、抗病性狀基因相關的SNP位點，據目前相關研究來看，研究者在甲殼類抗壓力、耐鹽、性早熟等性狀基因多態性的研究上也取得了一定的成果，為SNP標記用于后續優良品種的輔助選育奠定了堅實的基礎。LIU等[22]在研究凡納濱對蝦選擇性壓力性狀基因多態性關聯時篩選出了7 298個與該性狀可能有關的SNP位點；唐劉秀[58]通過探究蛻皮抑制激素基因(MIH)與性早熟性狀的相關性時，最終發現有兩個SNP位點(A3088T、C2466C)與中華絨螯蟹性早熟性狀之間存在密切關系；王渝[59]在研究與滲透壓調節密切相關的鈣網蛋白基(PtCRT)時，通過直接測序也發現該基因上存在耐鹽相關SNP位點的可能。

3 小結與展望

綜上所述，SNP標記技術在經濟甲殼動物的遺傳多樣性、高密度連鎖圖譜的構建、與生物優良性狀關聯分析等研究領域均表現出良好的應用前景，使其成為所有分子標記中最受矚目的分子標記。但我們也要看到，甲殼類生物SNP標記的開發和應用在很多方面還有待加強，比如在增殖放流標志技術和分子標記輔助育種技術的完善和應用上仍然有很長的路要走，這些問題都有待我們展開更深入的SNPs開發和應用上的研究工作。

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Progress on the SNP molecular markers in economic crustaceans

ZHAO Lian1， XUE Bei1， GAO Huan1,2,3， YAN Bin-lun1,2,3

(1.JiangsuKeyLaboratoryofMarineBiotechnology,HuaihaiInstituteofTechnology,Lianyungang222005,China;2.JiangsuCollaborativeInnovationCenterofMarineIndustryTechnology,Lianyungang222001,China;3.JiangsuConservationandUtilizationPlatformofAgriculturalGermplasmResources,Nanjing210014,China)

As one of the third generation markers, Single Nucleotide Polymorphism (SNP) marker with lots of advantages, such as rich density, high stability and co-dominance, is widely used in the crustaceans.In this paper, the development and application of SNP technology used in economic crustaceans was reviewed. The research progress on the construction of high density genetic linkage map, analysis of genetic diversity and marker assisted selection breeding in crustaceans were summarized. It will be helpful to deepen the further studies of the development and utilization of economic crustacean germplasm resources.

SNP; economic crustacean; research progress; germplasm resources

1004-2490(2017)02-0233-08

2015-12-14

國家自然科學基金(31472282)；江蘇省高校自然科學研究項目(13KJA240001);江蘇省農業科技支撐計劃(BE2013363)；江蘇省水產三新工程(D2014-17);江蘇省2015年度普通高校研究生科研創新計劃項目(KYLX15-1486)

趙 蓮(1990-)，女，四川內江人，碩士研究生，主要從事甲殼類遺傳學研究。 Tel: 0518-85895252，E-mail:zhaolianalice@163.com

閻斌倫，教授。 E-mail:yanbl@hhit.edu.cn

Q 755

A