膽酸鹽外排泵研究的最新進展

趙 晶,陳曼玉,李 磊

(大連醫科大學藥學院，遼寧 大連 116044)

膽酸鹽外排泵研究的最新進展

趙 晶,陳曼玉,李 磊

(大連醫科大學藥學院，遼寧 大連 116044)

膽酸鹽外排泵是肝細胞分泌膽酸鹽進入膽汁的主要轉運體，其變異和功能抑制與許多膽汁淤積癥和藥致肝損傷有關。對這些疾病的分析總結加深了我們對膽酸鹽外排泵(bile salt export pump，BSEP)生理和病理功能的認識，該文將對BSEP的結構、表達調控、底物及抑制劑，及其相關疾病進行簡要綜述，以期為臨床相關疾病的治療提供進一步的理論和實驗依據。

膽酸鹽外排泵；膽汁淤積；抑制劑；調控；膽汁酸; 調節因子

膽汁持續不斷的分泌進入十二指腸對于脂類營養物質和脂溶性維生素的吸收具有重要作用。在腸道中，膽酸鹽會被重新吸收經肝門靜脈返回肝臟；然后通過肝細胞血管側膜的?；悄懰猁}轉運多肽吸收進入肝細胞，而進入肝細胞的膽酸鹽又會被肝細胞膽管側膜的膽酸鹽外排泵(bile salt export pump，BSEP)分泌進入膽管，并進入膽囊貯存；在食物的刺激下膽酸鹽再次進入十二指腸，如此周而復始，不斷循環。在這個循環過程中，BSEP介導的外排是膽酸鹽分泌的限速步驟，對BSEP的抑制可導致膽酸鹽在肝內蓄積達到中毒水平，從而導致膽汁淤積和藥致肝損傷，并會間接影響人體血糖穩態[1]，造成動脈粥樣硬化[2]，甚至引起癌變[3]。鑒于BSEP在維持體內膽酸鹽平衡中的重要作用，歐洲醫藥管理局(European Medicines Agency，EMA)已將其列入研究藥物相互作用的指南中。因此，對BSEP結構、表達調控的研究引起人們極大的關注。

1 BSEP的結構

BSEP的基因符號為ABCB11，屬于ATP-結合盒(ATP binding cassette，ABC)轉運家族中的一員。BSEP與P-糖蛋白家族具有49%～50%氨基酸序列同源性， ABCB11基因包含有28個外顯子，定位于人染色體2q24位點。人BSEP由1 321個氨基酸組成，分子量為160 kDa[4]。BESP含有12個跨膜螺旋區域(Fig 1)。N-端和C-端均位于細胞質側，序列分析顯示在第1個細胞外環有4個N-端糖基化位點，在BSEP的穩定及功能上扮演著重要的角色。

Fig 1 Schematic view of topological arrangement of BSEP

2 BSEP的表達與調控

BSEP主要分布于肝細胞膽管側膜，盡管有報道在其它組織中檢測到低水平的BSEP mRNA，但從未在蛋白水平上檢測到。細胞內新合成的BSEP會經高爾基體中轉運至近細胞膜頂側的囊泡室(內涵體)中。在最終轉運到頂側膜之前，BSEP將在其中停留數小時。BSEP/Bsep(BSEP表示人體內蛋白，Bsep表示動物體內蛋白)在頂側膜上的停留半衰期為4～6 d，其在頂側膜和近頂側囊泡室之間不斷的往復循環[5]。實驗證實，BSEP/Bsep的循環具有微管依賴性，對肌動蛋白抑制劑敏感。另外也有一些蛋白能夠錨定在Bsep的作用位點上，對其產生影響，如肌球蛋白II的調控輕鏈(myosin Ⅱ regulatory light chain，MLC2)能夠與Bsep的核苷結合區域相互作用，對其轉運至漿膜側具有重要作用。MLC2的抑制劑Blebbistatin可使MLC2處于非磷酸化形式，從而會降低BSEP在漿膜側的表達水平[6]。

研究表明，在膽酸鹽高負荷時，大鼠肝臟的分泌能力會迅速上調。因此，BSEP表達的增加是一種急性調節方式，可促使膽酸鹽轉運量迅速增加。這其中，磷脂酰肌醇-3激酶介導的磷酸肌醇脂磷酸化可能參與了BSEP轉運活性的調節。另外，BSEP也存在轉錄及轉錄后調節機制。低滲和糖皮質激素可誘導BSEP mRNA表達水平的上調，而高滲作用則相反。細胞的低滲狀態能夠刺激膽酸的分泌可能跟Erk-1/2和p38 MAP激酶的激活有關。雌二醇-17β-葡糖苷酸，lithocholate，脂多糖等可導致Bsep內化返回進入頂側膜附近的囊泡室[7-8]。

人類的BSEP表達水平存在著明顯的個體差異，其表達水平受轉錄機制的高度調控[9]。BSEP/Bsep的主要調節器是法尼醇X受體(Farnesoid X receptor, FXR)。FXR/Fxr能夠激活人和動物BSEP/Bsep的近端啟動子。膽酸即是FXR的生理受體，能夠調節自身對應轉運體的轉錄。Fxr對于Bsep表達的關鍵作用可以通過Fxr基因敲除小鼠實驗證明，給予此種小鼠膽酸鹽不能誘導Bsep的表達。

BSEP除了受FXR調節外，許多其它轉錄因子也參與其中(Fig 2)。例如，BSEP啟動子活性受肝細胞特異性受體LRH-1的誘導，在Lrh1基因敲除小鼠肝中Bsep的表達會降低；BSEP啟動子也受核調節因子NRF2的調節，NRF2在氧化應激響應中有重要作用[10]。

3 底物與抑制劑

盡管與P-gp同屬ABC轉運家族，但BSEP對底物的選擇性很高，僅有一小部分P-gp底物可被其轉運。例如，BSEP并不外排P-gp底物長春新堿、正定霉素、紫杉醇、地高辛和羅丹明123，但轉運普伐他汀、長春花堿等藥物[11]。BSEP對人膽汁中的主要膽酸鹽類物質如甘氨鵝脫氧膽酸鈉，甘膽酸鹽和?；蛆Z膽酸鹽等具有很高的親和性。BSEP主要負責單價膽酸鹽的外排，多藥耐藥相關蛋白MRP2則主要負責二價膽酸、硫酸化或葡糖醛酸化膽酸鹽的外排。另外，多藥耐藥蛋白MDR3負責將磷脂轉運至肝細胞微管膜的外側，而異質二聚體ABCG5/ABCG8轉運體則負責將膽固醇外排出去，所有這些轉運體促成了包含有膽酸、膽固醇和磷脂成分的混合膠束的形成，從而對膽酸鹽可能對膽管細胞產生的“去垢危害”產生防護作用。

對BSEP的抑制將導致微管膜膽酸鹽分泌的減少，從而造成膽汁阻塞形成肝損傷。藥物誘導的肝損傷臨床上很常見，嚴重的時候甚至不得不進行肝移植[12]。臨床上藥物導致肝損傷有30%的比例跟膽汁阻塞有關[13]。通過給予肝損傷患者BSEP抑制劑來評估BSEP在多大程度上起作用是非常困難的，因為有時藥物的代謝產物會造成肝管上皮細胞的損傷。利用表達Bsep的Sf9體外細胞模型可以對藥物對Bsep的抑制作用進行研究，并且其計算得到的Ki值與在大鼠微管膜上計算得到的Ki值具有可比較性。利用表達BSEP的昆蟲細胞也證實了環孢素A、利福平、格列苯脲等對人BSEP有競爭抑制作用。Tab 1列舉了不同抑制劑對Bsep的抑制情況。

Fig 2 Regulation of bile salt export pump(BSEP) promoter

Bile acids(BA) are major regulators of BSEP expression through activation of the farnesoid X receptor(FXR). The activating complex ASCOM is recruited by BA/FXR for the methylation(Me) of histones within the BSEP promoter. The nuclear factor erythroid 2-related factor 2(NRF2) is activated by oxidative stress, binds to a Maf recognition element(MARE) and transactivates the BSEP promoter. The steroid receptor coactivator-2(SRC2) is activated by the liver kinase B1(LKB1) and the “energy sensor kinase” AMP activated protein kinase(AMPK) and activates gene expression via acetylation(Ac) of histones. Liver receptor homolog 1(LRH1) transactivates BSEP and CYP7A1, the rate-controlling enzyme of BA synthesis. Increased BSEP transcription eventually increases BSEP protein expression and removal of intracellular BA.(FXRE: FXR response element; LRHRE: LRH response element; NTCP: Na+-taurocholatecotransporting polypeptide; ROS: reactive oxygen species; RXR: Retinoid X receptor)

Tab 1 The inhibitor of Bsep in different expression system

4 BSEP相關疾病

4.1 膽汁酸對BSEP表達的調節 BSEP的變化與肝對藥物消除、肝內膽汁酸水平、膽汁流量的變化、膽結石形成敏感性有關。BSEP缺乏可導致：① 血中膽汁酸升高；② 膽汁中磷脂成分增高，與膽汁酸上調mdr2有關；③ 膽汁酸羥化增加，水溶性增強，即膽汁酸通過孕烷受體X (pregenane X receptor，PXR)途徑使四羥膽酸生成增加，羥基越多膽汁酸水溶性越大。后兩種改變和機體的代償有關。

研究發現BSEP啟動子有一個高度保守的IR1序列，該序列是公認的FXR/ RXR的結合點。只有FXR和膽汁酸的結合，才能誘導BSEP啟動子表達。FXR的膽汁酸結合區突變時，FXR不能激活BSEP啟動子。FXR(-/-)鼠不能有效地調節膽汁酸合成和BSEP表達，其BSEP mRNA為正常鼠的70%，高膽酸喂食也不能誘導BSEP的表達。

在膽汁酸代謝調節中，FXR起著中心作用，FXR通過抑制CYP7A1和NTCP從而抑制膽汁酸合成及肝細胞對膽汁酸的攝取，FXR對BSEP的激活加速了膽汁酸分泌，避免了肝內膽汁酸堆積。FXR的激動劑或抑制劑將用于高脂血癥和膽汁淤積的治療[24]。

4.2 膽汁淤積與BSEP突變 ABCB11的突變會導致蛋白分子功能的缺失，干擾BSEP正確進入肝細胞膽小管膜，導致膽汁流量減少和膽酸鹽在肝細胞中的聚集，從而造成肝損傷，至少3種臨床肝臟疾病與此相關：II型良性復發性肝內膽汁淤積(benign recurrent intrahepatic cholestasis Ⅱ，BRIC2)、Ⅱ型進行性家族性肝內膽汁淤積(progressive familial intrahepatic cholestasis Ⅱ，PFIC2)和妊娠期肝內膽汁淤積(intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)。PFIC2是一種染色體遺傳病，表現為進行性膽汁分泌障礙，膽汁中膽酸含量降低，血膽固醇正?；蚪档??；蚍治霰砻?，PFIC2患者家族成員的ABCB11基因序列出現突變，引起其編碼蛋白BSEP異常。到目前為止，發現了100多個錯義(非同義)ABCB11基因的突變導致嚴重PFIC2。這些突變產生非功能性蛋白或導致沒有蛋白質的產生，都與PFIC2相關。

由于許多ABCB11基因的突變影響BSEP的功能活性或表達，并且增強了藥物誘導膽汁郁積的敏感性，因此從體外BSEP抑制結果預測膽汁郁積和藥物誘導肝損傷非常困難[25-27]。應用免疫組化方法測定28例PFIC2病人的肝組織，發現其中16例病人肝細胞膽小管側膜的BSEP表達為陰性，且均存在基因突變，病人膽汁中膽酸鹽濃度小于正常的1%。應用熊脫氧膽酸進行治療，不能恢復BSEP，且膽汁中不能檢測到熊脫氧膽酸。與人類不同，小鼠BSEP基因突變后總膽汁酸鹽含量降低4倍，血漿和肝臟膽汁酸鹽則分別增高5.8倍和4倍。但其膽汁中可檢測到人體罕見的四羥基膽汁酸，提示小鼠肝細胞膽小管側膜可能存在替代轉運途徑，分泌四羥基膽汁酸來減輕對肝細胞的毒性。人體由于缺乏這種替代途徑，導致病情進行性地加重。

有研究顯示，BSEP的突變也可能參與膽固醇結石病的發生。Bsep突變小鼠肝臟分泌膽汁酸鹽減少，而膽汁中膽固醇和磷脂的含量明顯升高，這種改變可能達到易于成石的狀態，使膽汁中膽固醇飽和度升高。

4.3 BSEP與肝癌的關系 膽汁分泌對于維持肝臟的正常生理代謝功能至關重要, 若膽汁形成或分泌出現問題, 將對肝臟造成炎癥性的損傷，甚至產生致癌作用。Wang等[28]用基因敲除的小鼠來考察轉運體與肝癌發生的關系，發現Bsep基因敲除小鼠肝癌的發病率極低，推測原因可能與Mdr1、Mrp3和Mrp4代償性增多有關。BSEP功能缺陷可顯著提高肝臟惡性腫瘤的發病率，有研究表明，15%的BSEP功能缺陷患者可發展為肝癌或膽管上皮癌[29-30]。

4.4 BSEP與藥物誘導的肝損傷 藥物誘導的肝損傷(drug-induced liver injury，DILI)在臨床上很常見，嚴重的時候甚至不得不進行肝移植。由于BSEP是一個能量依賴性蛋白，負責膽汁酸從肝細胞的流出，可以認為當人服用同時使線粒體能量和BSEP功能活性損傷的藥物時，能表現出比單一損傷更為嚴重的DILI的臨床反應[28]。臨床上藥物導致肝損傷有30%的比例跟膽汁阻塞有關。例如，曲格列酮作為一種胰島激素類藥物因為其肝毒性而被撤出市場。有研究顯示其肝毒性與膽汁淤積有關。曲格列酮和它的硫酸結合物(曲格列酮膽汁排泄的主要代謝物)競爭性抑制由BSEP介導的?；悄懰猁}能量依賴性的轉運。這種對膽鹽泵出的抑制造成人肝中膽汁淤積，從而產生肝毒性。對大鼠進行實驗，曲格列酮和其硫酸結合物均能抑制BSEP，Ki值分別為1.3和0.23 μmol·L-1?！岽笫篌w內曲格列酮硫酸結合物的濃度比♀大鼠的濃度高(因為♂大鼠的磺酸轉移酶活性較高)，因而給予曲格列酮后♂大鼠將出現比♀大鼠更為嚴重的膽汁淤積。

5 總結與展望

BSEP在肝微管膽酸鹽的分泌中起著決定性的作用，其病變和功能抑制與多種膽汁淤積癥密切相關。BSEP轉運體在正常的肝細胞中調節膽酸鹽平衡，當BSEP活性受損后會造成膽汁淤積和藥物誘導的肝毒性，這些充分表明體外評價BSEP與藥物相互作用的重要性，因此對BSEP轉運的評價方法成為研究的熱點[28]。目前，很多公司已經將BSEP抑制劑合并入藥物發現的篩選程序中，即用體外測定方法來評價藥物或化學實體作為BSEP的底物或抑制劑的潛力。膜囊泡和基于肝細胞的BSEP測定是目前用于藥物或藥物候選物篩選的最主要的方法。相對于其它試驗方法，BSEP膜囊泡測定相對容易實施，對于底物/抑制劑的測定和動力學分析也是確證有效的。采用這種方法可以研究由BSEP引起的藥物相互作用，同時在藥物發現過程中有利于大量化合物的的高通量篩選[28]。但是采用膜囊泡體系缺乏實驗化合物的在體代謝，這有可能會影響BSEP抑制，因此當將測定結果外推到體內時有可能會造成誤導。對BSEP結構功能、抑制劑及基因變異的詳細研究方法可加深人們對膽汁形成機制的認識，開發出新的相關疾病治療策略。

[1] Thomas C, Gioiello A, Noriega L, et al. TGR5-mediated bile acid sensing controls glucose homeostasis[J].CellMetab, 2009, 10(3): 167-77.

[2] Pols T. W, Nomura M, Harach T, et al. TGR5 activation inhibits atherosclerosis by reducing macrophage inflammation and lipid loading[J].CellMetab, 2011, 14(6): 747-57.

[3] Bernstein H, Bernstein C, Payne C M, Dvorak K. Bile acids as endogenous etiologic agents in gastrointestinal cancer[J].WorldJGastroenterol, 2009, 15(27): 3329-40.

[4] Kubitz R, Droge C, Stindt J, et al. The bile salt export pump(BSEP) in health and disease[J].CliniResHepatolGastroenterol, 2012, 36(6): 536-53.

[5] Lam P,Pearson C L,Soroka C J,et al.Levels of plasma membrane expression in progressive and benign mutations of the bile salt export pump(Bsep/Abcb11) correlate with severity of cholestatic diseases[J].AmJPhysiolCellPhysiol,2007,293(5):C1709-16.

[6] Chan W, Calderon G, Swift A L, et al. Myosin II regulatory light chain is required for trafficking of bile salt export protein to the apical membrane in Madin-Darby canine kidney cells[J].JBiolChem, 2005, 280(25): 23741-7.

[7] Fouassier L, Beaussier M, Schiffer E, et al. Hypoxia-induced changes in the expression of rat hepatobiliary transporter genes[J].AmJPhysiolGastrointestliverphysiol, 2007, 293(1): G25-35.

[8] Boaglio A C, Zucchetti A E, Sanchez Pozzi E J, et al. Phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B signaling pathway is involved in estradiol 17beta-D-glucuronide-induced cholestasis: complementarity with classical protein kinase C[J].Hepatology(Baltimore,Md),2010,52(4):1465-76.

[9] Tirona R G. Molecular mechanisms of drug transporter regulation[J].HandbExpPharmacol,2011,201: 373-402.

[10]Weerachayaphorn J, Cai S Y, Soroka C J, Boyer J L. Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 is a positive regulator of human bile salt export pump expression[J].Hepatology(Baltimore,Md), 2009, 50(5): 1588-96.

[11]Hirano M, Maeda K, Hayashi H, et al. Bile salt export pump(BSEP/ABCB11) can transport a nonbile acid substrate, pravastatin[J].JPharmacolExpTher, 2005, 314(2): 876-82.

[12]Bleibel W,Kim S,D′silva K,Lemtner E R.Drug-induced liver injury: review article[J].DigDisSci,2007,52(10):2463-71.

[13]Meier Y, Cavallaro M, Roos M, et al. Incidence of drug-induced liver injury in medical inpatients[J].EurJClinPharmacol, 2005, 61(2): 135-43.

[14]Fattinger K, Funk C, Pantze M, et al. The endothelin antagonist bosentan inhibits the canalicular bile salt export pump: a potential mechanism for hepatic adverse reactions[J].ClinPharmacolTher, 2001, 69(4): 223-31.

[15]Mano Y, Usui T, Kamimura H. Effects of bosentan, an endothelin receptor antagonist, on bile salt export pump and multidrug resistance-associated protein 2[J].BiopharmDrugDispos, 2007, 28(1): 13-8.

[16]Kis E, Ioja E, Nagy T, et al. Effect of membrane cholesterol on BSEP/Bsep activity: species specificity studies for substrates and inhibitors[J].DrugMetabDispos, 2009, 37(9): 1878-86.

[17]Horikawa M, Kato Y, Tyson C A, Sugiyama Y. Potential cholestatic activity of various therapeutic agents assessed by bile canalicular membrane vesicles isolated from rats and humans[J].DrugMetabPharmacokinet, 2003, 18(1): 16-22.

[18]Stieger B, Fattinger K, Madon J, et al. Drug-and estrogen-induced cholestasis through inhibition of the hepatocellular bile salt export pump(Bsep) of rat liver[J].Gastroenterology, 2000, 118(2): 422-30.

[19]Lang C, Meier Y, Stieger B, et al. Mutations and polymorphisms in the bile salt export pump and the multidrug resistance protein 3 associated with drug-induced liver injury[J].PharmacogenetGnomics, 2007, 17(1): 47-60.

[20]Bode K A, Donner M G, Leier I, Keppler D. Inhibition of transport across the hepatocyte canalicular membrane by the antibiotic fusidate[J].BiochemPharmacol, 2002, 64(1): 151-8.

[21]Kostrubsky S E, Strom S C, Kalgutkar A S, et al. Inhibition of hepatobiliary transport as a predictive method for clinical hepatotoxicity of nefazodone[J].ToxicolSci, 2006, 90(2): 451-9.

[22]Yabuuchi H, Tanaka K, Maeda M, et al. Cloning of the dog bile salt export pump(BSEP; ABCB11) and functional comparison with the human and rat proteins[J].BiopharmDrugDispos, 2008, 29(8): 441-8.

[23]Funk C, Ponelle C, Scheuermann G, Pantze M. Cholestatic potential of troglitazone as a possible factor contributing to troglitazone-induced hepatotoxicity:invivoandinvitrointeraction at the canalicular bile salt export pump(Bsep) in the rat[J].MolPharmacol, 2001, 59(3): 627-35.

[24]Alrefai W A, Gill R K. Bile acid transporters:structure, function, regulation and pathophysiological implications[J].PharmRes, 2007, 24(10): 1803-23.

[25]Maggiore G, Gonzales E, Sciveres M, et al. Relapsing features of bile salt export pump deficiency after liver transplantation in two patients with progressive familial intrahepatic cholestasis type 2[J].JHepatol, 2010, 53(5): 981-6.

[26]Evason K, Bove K E, Finegold M J, et al. Morphologic findings in progressive familial intrahepatic cholestasis 2(PFIC2): correlation with genetic and immunohistochemical studies[J].AmJSurgPathol, 2011, 35(5): 687-96.

[27]El-Guindi M A, Sira M M, Hussein M H, et al. Hepatic immunohistochemistry of bile transporters in progressive familial intrahepatic cholestasis[J].AnnHepatol, 2016, 15(2): 222-9.

[28]Wang R, Chen H L, Liu L, et al. Compensatory role of P-glycoproteins in knockout mice lacking the bile salt export pump[J].Hepatology, 2009, 50(3): 948-56.

[29]Pawlikowska L, Strautnieks S, Jankowska I, et al. Differences in presentation and progression between severe FIC1 and BSEP deficiencies[J].JHepatol, 2010, 53(1): 170-8.

[30]Strautnieks S S, Byrne J A, Pawlikowska L, et al. Severe bile salt export pump deficiency: 82 different ABCB11 mutations in 109 families[J].Gastroenterology, 2008, 134(4): 1203-14.

The research progress of bile acid efflux pump (BSEP)

ZHAO Jing, CHEN Man-yu, LI Lei

(CollegeofPharmacy,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China)

Bile acid efflux pump(BSEP) is the major transporter of bile salts secreted by liver cells into the bile, the variation and inhibition of which are connected with cholestasis and drug-induced liver injury. A deep understanding of the physiological and pathological function of BSEP IS achieved by analysis and summary of diseases. The paper briefly illustrates the structure, expression, regulation, substrates, inhibitors and diseases of BSEP, in order to provide further theoretical and experimental basis for the clinical treatment.

BSEP; cholestasis; inhibitor; regulation; bile acid； regulatory factor

時間：2016-12-27 16:13

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161227.1613.008.html

2016-08-21;

2016-11-08

國家自然科學基金資助項目(No 81202484)

趙 晶(1992-)，女，碩士生，研究方向：藥物傳遞系統，Tel: 0411-86110420, E-mail: zhaoj0109@163.com; 李 磊(1976-)，女，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：藥物傳遞系統，通訊作者，Tel: 0411-86110420, E-mail:ll_wht@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.01.004

A

1001-1978(2017)01-0018-05

R-05；R322.47；R394.2；R575；R735.7