芍藥內酯苷和芍藥苷對慢性束縛應激大鼠神經營養因子以及一氧化氮影響的研究

朱映黎++王林元　王成龍　趙丹萍　王莎　費文婷　張建軍

[摘要] 研究芍藥內酯苷、芍藥苷對慢性束縛應激肝郁大鼠的作用及機制。以氟西汀及逍遙丸為對照，檢測體重，糖水消耗量，并進行曠場行為學實驗；格瑞斯比色法檢測海馬一氧化氮（NO）的含量；酶免法（ELISA）檢測海馬腦源性神經營養因子（BDNF）的含量；RTqPCR法檢測海馬神經元一氧化氮合酶（nNOS）mRNA表達；Western blot法檢測海馬中nNOS以及BDNF的蛋白表達。與模型組相比，30 mg·kg-1芍藥苷、30 mg·kg-1芍藥內酯苷明顯升高穿行次數（P<0.05；P<0.01）；芍藥苷、芍藥內酯苷明顯降低NO水平（P<0.05，P<0.01；P<0.05，P<0.05）；30 mg·kg-1芍藥苷與30 mg·kg-1芍藥內酯苷明顯升高BDNF水平（P<0.05）。與模型組相比，芍藥苷、芍藥內酯苷明顯降低nNOS mRNA表達（P<0.01；P<0.05）；30 mg·kg-1芍藥苷、30 mg·kg-1芍藥內酯苷明顯升高BDNF 蛋白表達（P<0.05）。芍藥內酯苷、芍藥苷為白芍柔肝解郁功效的有效成分，其作用機制與調節海馬NO含量以及BDNF的表達有關。

[關鍵詞] 芍藥內酯苷； 芍藥苷； 肝郁證； 一氧化氮； 腦源性神經營養因子

Investigation of effects of albiflorin and paeoniflorin on hippocampal BDNF and NO in chronic restraint stress rats

ZHU Yingli， WANG Linyuan， WANG Chenglong， ZHAO Danping， WANG Sha， FEI Wenting， ZHANG Jianjun*

（Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

[Abstract] This paper aimed to investigate the antidepressantlike effects and the mechanism of the albiflorin， paeoniflorin on rats with chronic restraint stress model. Fluoxetine and Xiaoyao group served as the positive control， body weight， sucrose preference test and the open field behavioral experiment were measured， the levels of nitric oxide （NO） in hippocampus were detected by Greg colorimetric method. Furthermore， the levels of brain derived neurotrophic factor （BDNF） in hippocampus were detected by ELISA. Finally， the expressions of nNOS mRNA in hippocampus detected by RTqPCR， the protein levels of nNOS and BDNF in hippocampus were detected by Western blot. Compared with the model group，the pass counts of paeoniflorin group（30 mg·kg-1） and albiflorin group（30 mg·kg-1） were obviously increased（P<0.05，P<0.01）. Furthermore， compared with the model group，the levels of NO in paeoniflorin groups（30 mg·kg-1 and 15 mg·kg-1） and albiflorin groups（30 mg·kg-1 and 15 mg·kg-1） were all significantly decreased（P<0.05，P<0.01； P<0.05， P<0.05）. BDNF levels of paeoniflorin group（30 mg·kg-1） and albiflorin group（30 mg·kg-1） were obviously increased（P<0.05）. Finally， compared with the model group， the expressions of nNOS mRNA of paeoniflorin groups（30 mg·kg-1 and 15 mg·kg-1） （P<0.01， P<0.01） and albiflorin groups（30 mg·kg-1） were significantly decreased（P<0.05）. Compared with the model group， the protein exprsssions of BDNF of paeoniflorin group（30 mg·kg-1） and albiflorin group（30 mg·kg-1） were obviously increased（P<0.05）. Albiflorin and paeoniflorin have the effects of smooth the liver and dispel stagnation， the mechanism has the relevant with adjusting and controlling the expression of NO and BDNF in hippocampus.

[Key words] albiflorin； paeoniflorin； liver stagnation syndrome； nitric oxide； brain derived neurotrophic factor

doi：10.4268/cjcmm20162225

白芍[1]為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的干燥根，味苦、酸，微寒，歸肝、脾經，養血斂陰，柔肝止痛。赤芍[1]為毛茛科植物芍藥P. lactiflora Pall.或川赤芍P. veitchii Lynch的干燥根，味苦、微寒，歸肝經，清熱涼血，散瘀止痛。白芍與赤芍來源相似，都含有芍藥苷、芍藥內酯苷等單萜苷類成分[2]，研究表明芍藥內酯苷、芍藥苷具有補血、抗應激作用[39]。本實驗通過芍藥內酯苷和芍藥苷對束縛應激致肝郁大鼠藥理作用以及對海馬腦源性神經營養因子（BDNF）以及NO的研究，探討白芍特征成分芍藥內酯苷與赤芍與白芍的共同有效成分芍藥苷的作用機制及特點。

1 材料

1.1 動物 雄性Sprague Dawley大鼠，體重（180±20） g，由北京維通利華實驗動物有限公司提供，合格證號SCXK（京）20160002。

1.2 藥品 實驗用芍藥內酯苷、芍藥苷均為自制，純度均高于96%。氟西汀購自PATHEON FRANCE，產品批號5169A（分包裝廠禮來蘇州制藥有限公司，分包裝批號5169AA）。逍遙丸（濃縮丸）購自九芝堂股份有限公司，產品批號201510006，經本實驗室HPLC測定，本品芍藥苷質量分數為4.19 mg·g-1，芍藥內酯苷質量分數為2.68 mg·g-1。

1.3 儀器與試劑 大鼠不銹鋼束縛器：筒長20 cm、內徑6 cm，可通過移動底板調節其長度；大鼠行為學觀察敞箱（自制）；熒光定量PCR儀（ABI，批號7300）；Trizol 試劑（Invitrogen Life Technologies，批號15596026）；紫外分光光度計（上?，F科儀器有限公司，批號752P）；RIPA裂解液（武漢谷歌生物科技公司，批號G2002）；HRP標記山羊抗兔（武漢谷歌生物科技公司，批號GB23303）；HRP標記驢抗山羊（武漢谷歌生物科技公司，批號GB23404）；HRP標記山羊抗小鼠（武漢谷歌生物科技公司，批號GB23301）；HRP標記山羊抗大鼠（武漢谷歌生物科技公司，批號GB23302）。

2 方法

2.1 分組與給藥 將80只SD大鼠隨機分成8組，即空白組、模型組、氟西汀組（2.0 mg·kg-1，相當于人用量15 mg·d-1）、逍遙丸組（4.032 g·kg-1，相當于逍遙丸中白芍人用量4.32 g·d-1，相當于芍藥苷18.1 mg·d-1、芍藥內酯苷11.6 mg·d-1）、芍藥內酯苷組（30，15 mg·kg-1）、芍藥苷組（30，15 mg·kg-1），每組10只。持續給藥21 d，按每100 g體重灌胃1 mL給藥，每日1次?？瞻捉M、模型組每天灌胃等量蒸餾水。

2.2 造模方法 動物適應數天后[10]，除空白組每籠5只常規飼養外，剩余大鼠進行常規單籠適應性喂養5 d。除空白組外，各組大鼠進行孤養結合束縛應激模型復制：將大鼠放入自制筒長為20 cm、內徑為6 cm，并可以調節長度的不銹鋼束縛器中；以不影響大鼠正常晝夜節律為前提，可通過移動束縛筒內底板的位置，使大鼠無損傷完全固定，限制大鼠進退和掉頭，以不產生壓迫感、不影響呼吸和排泄為度。每天定時束縛3 h（8：00—11：00 am），連續3周。

2.3 樣品處理 實驗第22天，SD大鼠快速斷頭處死后迅速取出腦組織，在超凈臺冰面上分離出海馬組織，置于滅菌凍存管，液氮中保存待用。

2.4 體征觀察與體重檢測 觀察大鼠的口唇、眼睛、皮毛、尾巴的顏色、精神狀態等變化；并于第1，7，14，21天稱重，記錄并分析各組大鼠體重變化。

2.5 糖水消耗試驗 在實驗前48 h，對所有的大鼠進行1%蔗糖水攝取訓練；隨后斷水斷食24 h，進行第1次糖水消耗量基線測定；于實驗的第7，14，21天分別于8：00—11：00 am測定大鼠1 h內的蔗糖水攝取量，最后計算糖水消耗量=糖水消耗量（mL）/（去離子水+糖水消耗量）（mL）。

2.6 敞箱試驗 敞箱為本實驗室自制。大鼠行為學觀察敞箱（40 cm×80 cm×80 cm）無蓋，周壁和箱底均為黑色，底面劃分面積相等的25塊方格，用白線劃分。本實驗[11]于在末次處理的1 h后，在安靜、四周由遮光簾隔離的獨立操作室里進行。操作者帶黑色手套，握住大鼠尾根部1/3處，小心放入敞箱正中格，釋放后觀察5 min的活動情況。并注意每只結束后，用毛巾蘸清水及低濃度乙醇徹底清理敞箱，待其氣味揮發擴散后，再進行下一只的測試。測定指標包括：①正中央格停留時間；②方格間穿行次數（三爪以上跨入鄰格的次數）；③豎起或修飾次數（前兩肢離地1 cm以上的次數）；④豎起或修飾時間（前兩肢離地1 cm以上的時間，包括前肢向上抬舉、抓癢、洗臉、舔足等）。

2.7 格里斯法（Griess法）測定海馬組織中NO含量 用一氧化氮測試盒進行NO含量測定，其原理是用硝酸還原酶法先將NO3-還原成NO2-，再用Griess法反應測定NO2-總量。即在弱酸性條件下，NO2-與對氨基苯磺酸重氮化后，與N1萘基乙二胺偶合形成紅色燃料，用比色法可測得NO2-總量，從而得出各組大鼠海馬組織中NO含量。

2.8 酶免法測定海馬組織中BDNF含量 采用ELISA法檢測BDNF，每一份樣本進行雙點測定， 嚴格按說明書進行操作。STAT FAX 2100全自動酶標儀檢測BDNF含量。

2.9 實時熒光定量聚合酶鏈式反應法（RTqPCR）檢測海馬中nNOS mRNA表達 每組取4只大鼠海馬組織按Trizol試劑說明抽提總RNA。取2 μg總RNA為模板，加入1 μL Oligo（dT）18和無核糖核酸酶的去離子水后于PCR儀上70 ℃保溫5 min，迅速置冰上冷卻，依次加入4 μL 5×buffer，10 mmol·L-1 dNTPs 2 μL，1 μL RNA inhibitor和1 μL反轉錄酶，于PCR儀上42 ℃保溫60 min，結束后80 ℃保溫5 min滅活反轉錄酶。取0.2 mL PCR管，配制如下反應體系，每個反轉錄產物配制3管：2× qPCR Mix 12.5 μL，7.5 μmol·L-1基因引物2.0 μL，反轉錄產物2.5 μL，蒸餾水8.0 μL。取0.2 mL PCR管，配制如下反應體系，每個反轉錄產物配制3管：2× qPCR Mix 12.5 μL，7.5 μmol·L-1內參引物2.0 μL，反轉錄產物2.5 μL，蒸餾水8.0 μL。PCR擴增預變性，95 ℃10 min；循環（40次）95 ℃，15 s到60 ℃，60 s；溶解曲線75 ℃到95 ℃，每20 s升溫1 ℃。PCR反應及數據采集在LightCycler 2.0系統上進行，記錄其循環閾值（CT），基因表達結果采用相對定量公式2ΔΔCt計算，其中ΔCt值=靶基因的Ct值-βactin的Ct值。測定海馬組織中nNOS mRNA表達水平。

引物設計使用Primer 3.0 軟件計算機輔助設計，見表1。

2.10 蛋白質印跡法（Western blot）檢測海馬中nNOS以及BDNF的蛋白表達 每組取5只大鼠海馬組織。冰浴30 min，期間用移液器反復吹打，確保細胞完全裂解。裂解30 min后，移至離心管，在4 ℃下12 000 r·min-1離心5 min，收集上清，即為總蛋白溶液。再按照常規Western blot方法操作，以βactin蛋白表達水平作為內參，以各樣本與相應內參灰度值比值為蛋白相對含量。

2.11 數據處理 數據用±s表示，采用SPSS Statistics 20.0的IndependentSample T Test或Oneway ANOVA過程（兩兩比較采用SNK）進行統計學分析，以P<0.05為有統計學意義。

3 結果

3.1 芍藥內酯苷和芍藥苷對肝郁大鼠體重的影響 與空白組比較，模型組體重從第7天開始明顯降低，差異非常顯著（P<0.001），從第21天開始，與模型組相比，逍遙丸組體重明顯升高，差異顯著（P<0.01）；氟西汀組體重明顯升高（P<0.05）；芍藥苷30 mg·kg-1組、芍藥苷15 mg·kg-1組的體重明顯升高（P<0.01，P<0.05）；芍藥內酯苷30 mg·kg-1組、芍藥內酯苷15 mg·kg-1組的體重明顯升高（P<0.05，P<0.01），見表2。

3.2 芍藥內酯苷和芍藥苷對肝郁證大鼠糖水消耗的影響 與空白組比較，模型組糖水消耗量從第21天開始明顯降低（P<0.001）；與模型組相比，各藥物組糖水消耗量有升高趨勢，但無明顯統計學差異，見表3。

3.3 芍藥內酯苷和芍藥苷對肝郁證大鼠敞箱自發活動的影響 與空白組比較，模型組修飾次數明顯降低（P<0.05）；與模型組相比，各給藥組具有升高趨勢，但無統計學差異；與空白組比較，模型組穿行次數明顯降低，差異顯著（P<0.01）；與模型組相比，逍遙丸組穿行次數明顯升高，差異顯著（P<0.01）；氟西汀組穿行次數明顯升高，差異顯著（P<0.01）；芍藥苷30 mg·kg-1組的穿行次數明顯升高（P<0.05）；芍藥內酯苷30 mg·kg-1組的穿行次數明顯升高，差異顯著（P<0.01）；與空白組比較，模型組滯留時間明顯升高（P<0.05）；與模型組相比，逍遙丸組滯留時間明顯降低（P<0.05）；氟西汀組

滯留時間明顯降低，差異顯著（P<0.01）；芍藥苷30，15 mg·kg-1組的滯留時間明顯降低（P<0.01，P<0.05）；芍藥內酯苷30，15 mg·kg-1組的滯留時間明顯降低，差異顯著（P<0.01，P<0.01），見表4。

3.4 芍藥內酯苷和芍藥苷對肝郁證大鼠海馬組織中NO含量的影響 與空白組比較，模型組NO含量明顯升高，差異顯著（P<0.01）；與模型組相比，逍遙丸組NO水平明顯降低（P<0.05）；氟西汀組NO水平明顯降低，差異顯著（P<0.01）；芍藥苷30，15 mg·kg-1組的NO水平明顯降低（P<0.05，P<0.01）；芍藥內酯苷30，15 mg·kg-1組的NO水平明顯降低（P<0.05，P<0.05），見表5。

3.5 芍藥內酯苷和芍藥苷對肝郁證大鼠海馬組織中BDNF含量的影響 與空白組比較，模型組BDNF含量明顯降低，差異顯著（P<0.01）；與模型組相比，逍遙丸組BDNF水平明顯升高，差異顯著（P<0.01）；氟西汀組BDNF水平明顯升高，差異顯著（P<0.01）；芍藥苷30 mg·kg-1組與芍藥內酯苷30 mg·kg-1組的BDNF水平明顯升高（均P<0.05），見表6。

3.6 芍藥內酯苷和芍藥苷對肝郁證大鼠海馬組織中nNOS mRNA表達的影響 與空白組比較，模型組nNOS mRNA表達明顯升高，差異非常顯著（P<0.001）；與模型組相比，逍遙丸組與氟西汀組nNOS mRNA表達明顯降低（P<0.05，P<0.05）；芍藥苷30，15 mg·kg-1組的nNOS mRNA表達明顯降低，

3.7 芍藥內酯苷和芍藥苷對肝郁證大鼠海馬組織中nNOS 蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組nNOS 蛋白表達明顯升高（P<0.05）；與模型組相比，各藥物組nNOS 蛋白表達有降低趨勢，但無明顯統計學差異，見表8。

3.8 芍藥內酯苷和芍藥苷對肝郁證大鼠海馬組織中BDNF 蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組BDNF 蛋白表達明顯降低，差異顯著（P<0.01）；與模型組相比，逍遙丸組、氟西汀組、芍藥苷30 mg·kg-1組、芍藥內酯苷30 mg·kg-1組的BDNF 蛋白表達明顯升高（P<0.05），見表9。

4 討論

肝郁，中醫認為是一種情志相關疾病，常見于現代醫學中的精神神經類疾病，與慢性應激引起的抑郁癥相似[12]。采用慢性輕度不可預知應激（CUMS）大鼠模型和嗅球損毀抑郁大鼠模型對白芍提取物（芍藥苷48.89%和芍藥內酯苷18.99%）及白芍有效成分芍藥苷進行研究，發現白芍提取物與芍藥苷均具有良好的抗抑郁作用，且機制與調節大腦皮層單胺類神經遞質和NO/cGMP通路有關[1316]。

本實驗采用目前被廣泛應用的慢性束縛應激結合孤養方法復制大鼠肝郁模型[10]。從第7天開始，大鼠體重開始急劇下降，出現毛發凌亂、色澤晦暗、喜蜷伏角落，灌胃時反抗劇烈、撕叫掙扎等現象，與肝郁證臨床表現特點相一致。從14 d開始，大鼠興奮性持續降低、探究興趣減弱，體重增長緩慢，但各給藥組與模型組之間并未出現統計學差異。第21天模型組、給藥組大鼠體重出現增長差異，糖水消耗量，行為學曠場實驗中穿行次數、修飾時間、滯留時間明顯變化。

本實驗以逍遙丸和氟西汀為陽性對照藥。氟西汀作為一種選擇性5羥色胺再攝取抑制劑類（SSRI）抗抑郁藥，常用于臨床治療抑郁癥[17]。逍遙丸作為傳統中醫名方，出自宋代《太平惠民和劑局方》，由柴胡、白芍、當歸、白術（炒）等組成，具有疏肝解郁，養血健脾之效。經HPLC檢測本次使用逍遙丸中芍藥內酯苷及芍藥苷質量分數分別為10.80，16.89 mg·kg-1。表明在本實驗給藥劑量下，逍遙丸中芍藥內酯苷及芍藥苷含量與本實驗二者的給藥劑量相近。

海馬作為與情感疾病相關的大腦邊緣系統構成組織之一，在學習、記憶、情緒、內分泌、內臟活動及介導應激反應中發揮重要作用[18]。一氧化氮參與抑郁癥的發病過程，抑郁癥患者血清及腦內一氧化氮升高，一氧化氮合酶及NMDA 受體拮抗劑對抑郁癥治療有效[19]。研究表明，NO作為一種神經信號的傳遞物質， 可以促進腦部的血流量，并可能與腦細胞的發育、腦細胞的學習和記憶過程、后腦垂體激素如血管加壓素和催產素的分泌、保護腦細胞避免毒物的攻擊及腦缺血時調整腦血供應等有關[20]。在本模型條件下，NO升高的原因可能與慢性應激激活下丘腦垂體腎上腺（HPA）軸，糖皮質激素持續高分泌以及腦內興奮性氨基酸含量增多有關[21]，芍藥內酯苷、芍藥苷均可以降低慢性束縛應激大鼠海馬NO含量水平。

神經元一氧化氮合酶（nNOS）是內源性的通過催化底物左旋精氨酸分解產生一氧化氮的一氧化氮合酶之一[18]。nNOS 已經被證實是海馬中神經元再生的抑制分子，研究表明nNOS是介導氟西汀影響神經元再生進而影響抑郁行為的關鍵分子[17]。本實驗芍藥苷、芍藥內酯苷對nNOS蛋白表達的影響卻并不明顯，這可能與NO對抑郁癥具有雙向作用有關，原因有待深入研究。

“神經營養假說”認為，人類的抑郁障礙與腦源性神經營養因子（BDNF）的表達降低及功能下調有關，臨床上對抑郁癥的治療可通過提高腦內神經生長因子水平抵抗應激引起的腦組織損傷[22]，它可能參與了抑郁癥的發病和治療機制，并可能與抑郁癥的預后密切相關。而另一方面，NO又能控制長期突觸改變中的早期基因如BDNF等表達，使樹突減少、突觸終端結構改變、神經可塑性降低， 從而導致以海馬為重要組成部分的情感調節中樞功能失常[1920]。本實驗芍藥苷、芍藥內酯苷增強海馬中BDNF 水平以及表達。

綜述以上結果，在本實驗條件下，芍藥內酯苷、芍藥苷能夠通過增加大鼠體重、提高大鼠自主活動和探索行為、降低緊張度和對新環境恐懼等方面改善大鼠抑郁樣作用；其機制與調節海馬內NO含量以及BDNF的表達有關。

[致謝] 北京中醫藥大學科研實驗中心李偉老師對本實驗提供了支持。

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[責任編輯 張燕]