黃曲霉毒素的生物降解研究進展

趙春霞+王軼+呂育財+程薇+郭鵬+崔宗均

摘要：黃曲霉毒素（Aflatoxins）是黃曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（Aspergills parasiticus）等真菌的次級代謝產物，具有高毒性和致癌性，是飼料中主要的污染物之一。近年來黃曲霉毒素的降解成為研究熱點，對黃曲霉毒素的特性、脫毒方式尤其是生物降解及其機理和降解產物的研究進展進行了綜述。

關鍵詞：黃曲霉毒素；生物降解；微生物；脫毒方式

中圖分類號：Q936 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）20-5172-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.002

Abstract： Aflatoxins are the secondary metabolites of Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus，and one of the major toxins in food and feed with high toxicity and carcinogenicity. In recent years，the research on aflatoxins is becoming a hotspot. The review focuses on the characteristics and detoxification methods of aflatoxins，especially the biodegradation process and degradation products.

Key words：aflatoxin； biodegradation； microorganism； detoxification way

黃曲霉毒素（Aflatoxins）最早發現于1960年，當時在英國，大量火雞因喂食發霉的花生餅粕而死亡，1961年科學家從花生餅粕中培養分離出一種霉菌，經鑒定其為黃曲霉（Aspergillus flavus），后來證實是該菌產生的黃曲霉毒素導致了火雞突發性死亡[1]。自此，科學家們開始了對黃曲霉毒素的深入研究。黃曲霉毒素主要是由黃曲霉和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）等真菌產生的一類高毒性的次生代謝物[2]。1993年世界衛生組織（WHO）將黃曲霉毒素劃定為1級致癌物質。黃曲霉毒素廣泛存在于谷物與飼料原料中。畜禽食用被黃曲霉毒素污染的飼料會引發疾病，通過食物鏈進入人體的毒素仍然具有高致癌性，嚴重威脅人類健康。因此，控制和解決飼料和糧食中黃曲霉毒素的污染對人類健康具有十分重要的意義。

由于黃曲霉毒素嚴重威脅人類健康，不少科學家致力于黃曲霉的脫毒研究。目前已經報道多種物理和化學的脫毒方式，這些脫毒方式在一定程度上可以降低或者消除黃曲霉的毒性。但不論是單獨使用或者聯合使用這些方式脫毒，都難以達到所期待的安全、高效、低成本和營養成分低損失的效果。而生物脫毒法因具備以上優勢而成為黃曲霉毒素脫毒技術的新方向。本研究對黃曲霉毒素的特性、脫毒方式尤其是生物脫毒方式及其機理和生物降解產物等方面進行了綜述。

1 黃曲霉毒素的特性

1.1 黃曲霉毒素的結構和性質

黃曲霉毒素大概有20多種結構，這些結構均是雙呋喃香豆素的衍生物，基本結構中都有二呋喃環和氧雜萘鄰酮（香豆素），前者為基本毒素結構，與黃曲霉毒素的毒性有關，后者與致癌有關，該結構在紫外光照射下可產生熒光。目前已經分離鑒別出的結構主要有發藍色熒光的B類和發綠色熒光的G類，在糧油制品中主要以B1、B2、G1與G2的形式存在，在動物體內會轉化產生M1、M2兩種異構體[3]。6種主要的毒素結構如圖1。黃曲霉毒素中毒性最強的是黃曲霉毒素B1（AFB1），其次毒性從強到弱依次為M1、G1，B2和G2[4]。因此，對于黃曲霉毒素的脫毒研究一般是以AFB1的去除率為評價指標。

1.2 黃曲霉毒素B1

黃曲霉毒素B1分子式為C17H12O6，純品為白色結晶，相對分子質量為312.06，裂解溫度為268 ℃。AFB1結構中主要有3個毒性位點，見圖2。其中，第一個毒性位點是呋喃環上的8、9位雙鍵，該位點是黃曲霉毒素B1形成AFB1-pro、AFB1-DNA等復合體的作用位點，也是導致基因突變和致癌致畸的主要功能基團，這也是AFB1是黃曲霉毒素家族中毒性最強的原因；第二個毒性位點是10、11、15號位點，即AFB1中的香豆素的內酯環部分，這個位點容易發生化學水解，因而成為較為活躍的毒素降解位點；第三個位點是AFB1環戊烯酮環上的1、2、3、14號位點，該位點上的一些取代基團的存在與否也對AFB1的毒性有一定的影響[5]。

2 黃曲霉毒素的限量標準

WHO/FAO規定存在于食品和飼料中毒素的最大限量為（B1+B2+G1+G2）15 μg/kg，牛奶中AFM1的最大限量為0.5 μg/kg。1996年，美國FDA公布牛奶中AFM1的最大允許量為0.5 μg/kg，動物飼料中的最大允許量為300 μg/kg；食品中毒素的總量（B1+B2+G1+G2）不能超過20 μg/kg。2000年，歐盟制定了有關黃曲霉毒素的標準含量：直接食用的花生仁中AFB1的含量不得超過2 μg/kg，總量（B1、B2、G1、G2）小于4 μg/kg；而非直接食用花生仁中AFB1的含量不得超過8 μg/kg，總量小于10 μg/kg；奶制品中AFM1的含量不得超過0.05 μg/kg。這被稱為國際上最為嚴格的限量標準。

中國衛生部在1982年頒布了AFB1在食品中的限量標準：花生仁、花生油、玉米中不得超過20 μg/kg；玉米及花生仁制品中含量小于20 μg/kg；大米和其他食用油中含量小于10 μg/kg；其他食品、豆類和發酵食品中含量小于5 μg/kg；嬰兒乳制品不得檢出。

3 黃曲霉毒素的生物脫毒方式

傳統的黃曲霉毒素的脫毒方式有物理和化學方法。物理方法主要包括高溫法、輻射法和物理吸附法。其中，采用高溫法要加熱至300 ℃才能使AFB1有明顯的分解，顯然成本太高；對于輻射法輻射除毒的研究比較多，沈祥震[6]、Youssef等[7]和遲蕾等[8]的研究表明輻照法去除真菌毒素效果明顯，但輻照技術本身的放射性污染問題，輻射機理的認知不全，輻照對食物、飼料的安全性問題使輻射除毒技術的應用受到限制[6]?；瘜W法主要包括堿處理法和氧化法，但化學法本身存在不穩定性，例如，在堿性條件下，AFB1的內酯環被打開，變成了香豆素鈉鹽或銨鹽，黃曲霉毒素毒性消失，但從堿性恢復到中性時，打開的內酯環會重新連接成毒素[9]。再者，化學法安全性有待于評估，對產品的其他成分也有一定程度的破壞。因而其應用也受到限制。

生物脫毒方法可以分為以下兩大類：微生物本身的吸附作用和微生物的代謝產物，例如酶或者抗氧化劑對毒素的降解作用。吸附作用和生物降解有本質區別，所以，兩者的區分是研究微生物降解毒素的一個重要的基礎工作[10]。

3.1 生物吸附法去除黃曲霉毒素

自然界部分微生物可通過非共價方式與黃曲霉毒素結合，形成菌體-黃曲霉毒素復合體，形成復合體的微生物自身吸附能力下降，復合體的狀態穩定，很難被機體吸收，大部分排出體外，從而達到脫毒目的[11]。迄今為止，已經發現對黃曲霉毒素有結合吸附能力的微生物以乳酸菌（Lactobacilli）和酵母（Saccharomycetes）居多[12，13]。研究表明，乳酸菌和酵母菌對毒素的吸附能力與它們的細胞壁結構有關，它們主要通過細胞壁吸附毒素。原理是在乳酸菌和酵母的細胞壁上存在特殊的結合位點能結合不同的分子，例如金屬離子和大分子的物質[12，13]。因而，死亡的細胞也和毒素有結合能力。研究表明，酵母細胞壁上的葡聚糖在吸附毒素上起重要作用，葡聚糖特有的螺旋狀分子結構可以與多種毒素形成特異的互補結構[14]。與酵母細胞不同，乳酸菌對AFB1的結合能力有高度的種特異性，主要與細胞上的肽聚糖成分有關。這種以微弱的非共價鍵形式的結合是可逆的，反復的洗脫或者加入有機溶劑都能使毒素重新游離出來。而且菌株種類、處理方式、環境條件等都可以影響復合物的穩定性[12，15]。生物吸附和物理化學吸附一樣，只是把毒素吸附在吸附劑的表面，讓所檢的樣品中毒素含量下降。而且是一個可逆的過程，并不能從本質上脫去毒素的毒性。

3.2 生物降解法去除黃曲霉毒素

黃曲霉毒素的生物降解是指黃曲霉毒素分子的毒性基團被微生物產生的次級代謝產物或者所分泌的酶分解破壞，同時產生無毒或者低毒的降解產物的過程[16]。真菌、細菌、放線菌等均有報道對AFB1有不同程度的降解。

真菌對黃曲霉毒素降解作用的發現最早是20世紀70年代末，Detroy等[17，18]發現，樹狀指孢霉（Dactylium dendroide）能夠降解AFB1環上的酮羰基。后來，Cole等[19]研究發現，少根根霉（Rhizopus arrhizus）可以將AFB1異構成其羥基化合物從而降低毒性。后來又相繼發現寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）[20]、莖點霉（Phoma sp.）[21]、白腐菌（Trametes versicolor）[22]、假密環菌（Armillariella tabescens）[23]和黑曲霉（Aspergillus niger）[24]等均能產生降解黃曲霉毒素的物質，且一般是酶的作用。

對AFB1有降解作用的細菌主要包括：橙色黃桿菌（Flavobaterium aurantiacum）、分歧桿菌（Mycobacterium fluoranthenivorans）、紅串紅球菌（Rhodococcus erythropolis）、芽孢桿菌（Bacillus sp.）、嗜麥芽寡養單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）、假單胞菌（Pseudomonas sp.）等。最早在1967年，Lillehoj等[25]首先發現橙色黃桿菌能夠去除溶液中的黃曲霉毒素，經過Line等[26]和Smiley等[27]的相繼研究，證實該菌對AFB1的降解機理可能是酶促作用。2004年，Hormisch等[28]通過以熒蒽為惟一碳源篩選到了一株分歧桿菌可以降解黃曲霉毒素，Teniola等[29]用分歧桿菌胞外提取物處理AFB1，證實解毒機理也為酶促反應，同時他還發現了紅串紅球菌也有降解AFB1的能力。近年來，又相繼發現了芽孢桿菌[30]、嗜麥芽寡養單胞菌[31]、假單胞菌[32]等均有降解黃曲霉毒素的能力。

微生物降解AFB1時起作用的酶種類有多種。Michael等[33]證明了乳過氧化氫酶能降解AFB1，而且降解率與酶量有關。Motomura等[34]從白腐真菌（White-rot fungi）的糙皮側耳（Pleurotus ostreatus）中分離純化出了一種能降解AFB1的胞外酶，并通過熒光檢測證實該酶斷裂了AFB1的內酯環。Albert等[35]發現平菇對AFB1的降解能力與漆酶活性有一定的相關性，其研究表明將來源于白腐真菌的漆酶重組到了黑曲霉中，表達的重組漆酶（118 U/L）對AFB1的降解率達到55%，王會娟等[36]也篩選到了兩株降解黃曲霉毒素的漆酶菌株。劉大嶺等從假密環菌E-20中分離得到一種能降解AFB1的黃曲霉毒素解毒酶（ADTZ），其課題組后續研究發現該酶是一種氧化酶，將其改名為黃曲霉毒素氧化酶（AFO），并成功構建了重組酶rAFO在畢赤酵母中表達。該酶通過破壞AFB1的二呋喃環降解AFB1[37-41]。

4 生物降解產物

根據微生物或酶作用的毒性位點可以將產物大致分為3類。第一類產物是AFB1的毒性位點1發生降解形成，目前發現的第二類產物主要是AFB2a與AFB1-8，9-二氫二醇。Wang等[42]對白腐菌YK-624進行研究，發現此菌株所產生的錳過氧化物酶（MnP）可以高效去除AFB1。整個過程分為兩個步驟，首先，在MnP存在下，將AFB1氧化為AFB1-8，9-環氧化物，接著再被水解為AFB1-8，9-二氫二醇，另外，在降解過程中，加入適量的吐溫80有助于提高降解效率。劉大嶺等[37]在研究假密環菌降解AFB1時，也發現AFB1被AFO首先氧化為環氧化物，接著水解為AFB1-8，9-二氫二醇，最后打開呋喃環。Yu等[43]研究發現在微生物降解AFB1的過程中，產生了一種發熒光的化合物AFB2a。AFB2a是AFB1的羥化產物，它有著與AFB1半縮醛完全一致的特性，于是又稱AFB1-W[44]。據報道，AFB2a的毒性遠遠低于AFB1或AFB2，將1 200 μg AFB2a注入1日齡體重為50 g的鴨子，結果發現并沒有產生與其他黃曲霉毒素相同的作用特征，AFB2a的毒性僅剩AFB1的1/200[45]。第二類產物是AFB1的毒性位點2降解形成。Lee等[46]發現AFB1毒性位點2的內酯環易被微生物降解變成熒光強度較低的AFD1，毒性也大大降低。第三類產物是AFB1的毒性位點3降解形成。Renate等[47]發現綠色木霉（Trichoderma viride）、不明毛霉（Mucor ambiguous）和黑曲霉將AFB1的毒性位點3上的2-環戊烯酮環上的酮羰基還原，形成黃曲霉毒醇（AFL），其毒性僅剩AFB1的1/18。AFB1生物降解的產物如圖3。

5 小結與展望

生物降解法去除黃曲霉毒素具有安全、高效、環保、無毒無害等優點，是未來研究黃曲霉毒素防治的發展方向?，F有不少關于生物降解黃曲霉毒素的研究，實現了對黃曲霉毒素不同程度的降解，且對降解機理及產物做了一定研究與報道，但對于黃曲霉毒素的完整代謝途徑及相關降解酶的特性仍有待進一步深入研究和探討。在未來的研究中，黃曲霉毒素的代謝機理和相關酶系特性的研究將會是該領域的發展方向之一。只有真正研究透徹黃曲霉毒素的降解過程，才能使生物降解過程更具有可控性；在此基礎上通過將黃曲霉毒素降解酶在成熟模式生物中重組表達，以實現大規模工業生產，最終實現高純度高活性的黃曲霉毒素降解酶的食品和飼料添加劑產品的開發。

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