拉曼光譜研究兩面針活性成分誘導肝癌細胞的凋亡

毛曉麗+覃禹+陳相宜+鄺曉聰+黃庶識+劉華鋼

[摘要]運用拉曼光譜法對兩面針活性成分誘導的肝癌細胞凋亡進行分析，肝癌細胞7404分別經10 mg·L^-1氯化兩面針堿及3 g·L^-1兩面針提取液處理后，收集經藥液處理12，24，36，48 h的各組細胞的拉曼光譜后，通過Hochest33342/PI熒光染色法鑒定細胞并保留熒光染色陽性（發生凋亡活細胞）的光譜，并在OriginPro8.0系統中比較各組平均光譜的差異。收集肝癌細胞的拉曼光譜依次進行背景扣除、平滑、歸一化等方法處理。Hochest熒光染色后空白組細胞核染色均勻，而藥物處理48 h后，核碎裂，拉曼光譜結果顯示兩面針提取液處理肝癌細胞12，24，36，48 h后，與核酸及蛋白質相關的峰均有降低，其中785，1 002，1 175，1 660 cm^-1峰強度隨兩面針藥物作用時間的延長而降低，表明兩面針活性成分能夠誘導肝癌細胞凋亡，凋亡的肝癌細胞中核酸和蛋白質的含量均低于活細胞。兩面針活性成分作用時間與藥效呈一定的相關性。拉曼光譜能夠反映中藥兩面針活性成分作用后的肝癌細胞內物質變化的信息，對實時監測細胞凋亡過程及藥物的臨床應用具有重要意義。

[關鍵詞]拉曼光譜； 肝癌細胞； 兩面針

[Abstract]The apoptosis of mono-hepatocellular induced by the active ingredients of the Zanthoxyli Radix was investigated using laser Raman spectroscopy. Hepatoma cells （BEL-7404） were treated with 10 mg·L^-1 nitidine chloride and 3 g·L^-1 the extracts of Zanthoxyli Radix， respectively， then were divided into two parts， one for fluorescence staining， the other for determination of Raman spectroscopy. The acquired spectra were then processed by background elimination， smoothing， and normalization. Fluorescence staining results showed that the nucleuses from untreated group were uniformly stained， while those from the group treated for 48 hours were densely stained and broken. The spectra results revealed that the intensity of peaks associated with nucleic acid and protein decreased after the cells were incubated with the extracts of Zanthoxyli Radix for 12， 24， 36 and 48 hours. The intensity of peaks at 785，1 002，1 175，1 660 cm^-1 was decreased with the time of the cells were incubated by the extracts of Zanthoxyli Radix. The results indicated that the extracts of Zanthoxyli Radix could induce the apoptosis of hepatoma cells and reduce the amount of nucleic acid and protein in the cells. There is a certain relevance between the drug treatment time and the efficacy. The above results suggest that Raman spectra can provide abundant information about the changes in biological macromolecules within the cells after incubated by the extracts of Zanthoxyli Radix and serve as an effective method for the real time measurement of apoptosis.

[Key words]Raman spectroscopy； hepatoma cell； Zanthoxyli Radix

doi：10.4268/cjcmm20162119

兩面針系蕓香科花椒屬藤本植物兩面針Zanthoxylum nitidum（Roxb.）DC.的干燥根，又名入地金牛、蔓椒、雙面針、雙背針等。兩面針是廣西道地藥材，富含生物堿、木質素、香豆素和揮發油等，具有活血化瘀，行氣止痛，祛風通絡，解毒消腫等功效，用于跌撲損傷，胃痛，牙痛，風濕麻痹，毒蛇咬傷等^[1]?，F代研究發現氯化兩面針堿為主的生物堿活性成分發揮抗腫瘤作用，其主要作用機制是抑制拓撲異構酶活性、阻滯細胞周期、逆轉腫瘤細胞多藥耐藥、誘導腫瘤細胞凋亡等^[2]。

細胞凋亡是細胞在一定的生理或病理條件下，由基因控制的細胞自主的有序死亡?，F代研究發現中藥誘導腫瘤細胞凋亡已成為治療癌癥的新途徑，紫杉醇通過抑制癌細胞有絲分裂誘導細胞凋亡，對子宮癌、乳腺癌、卵巢癌等具有特殊療效^[3]。細胞凋亡時會發生一些特征性的形態和生化改變，現在常用的檢測細胞凋亡的方法有電子顯微鏡、流式細胞術、核酸電泳等^[4]。拉曼光譜技術是通過拉曼光譜特征峰的位置和強度來反映分子的精細結構和振動結構，從分子水平上對細胞進行檢測，拉曼光譜已成為研究細胞內分子結構變化的有效工具^[5-6]。拉曼光譜具有非破壞性，非侵入性，不需要對樣品進行預處理，一般的生物樣品，細胞、活體組織、DNA以及RNA都可以直接測量。拉曼光譜主要是測定細胞內核酸、蛋白質、脂質等生物大分子的變化過程，藥液對激發拉曼散射的可見光只有很弱的吸收，這使得拉曼光譜技術適合于研究溶液體系如藥物培養液中的細胞^[7]。近年來拉曼光譜也廣泛用于乳腺癌、肝癌等癌癥診斷以及治療的研究中^[8-11]。

本文從兩面針中提取活性成分，對體外肝癌細胞進行不同時間段的處理，利用單細胞拉曼光譜系統測定不同處理時間段細胞的光譜，并結合化學計量學方法對光譜數據進行處理和分析，以期揭示腫瘤光譜特征變化所反映的生物學內涵，促進中藥兩面針中的有效成分誘導肝癌細胞凋亡的生理過程的深入理解。

1 材料

1.1 藥物 氯化兩面針堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號1108482-200502，供含量測定用，純度>99.5%）。兩面針樣品分別采集于廣西南寧市大塘鎮和柳州市融水縣，經廣西中醫藥研究院中藥室賴茂祥研究員鑒定為蕓香科兩面針Z.nitidum的干燥根。

1.2 試劑 氯仿（國藥集團，分析純）；RPMI DMEM培養基，RPMI1640培養基（美國Gibco公司）；新生牛血清（杭州四季青生物材料研究所）；標準胎牛血清（Solarbio）；胰蛋白酶（美國Amersco公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）（美國Amersco公司）；N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸（HEPES）（美國Sanland-chem公司）；二甲基亞砜（DMSO）（廣州市新港化工有限公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）（福州邁新生物技術開發有限公司）；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）；Hochest33342/PI染色液（南京凱基生物科技發展有限公司）。

1.3 細胞株 BEL-7404人肝癌細胞購于中國科學院上海細胞庫。

1.4 儀器 Thermo Forma CO₂培養箱（美國 Forma Scientific公司）；Axiovert 200型倒置光學顯微鏡（德國Zeiss公司）；Model-450酶聯免疫檢測儀（美國 Bio-Rad公司）；超低溫冰箱（日本三洋公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設備廠）；平板振蕩器（北京海淀電子醫療儀器廠）。

1.5 拉曼系統 單光鑷拉曼系統為一束波長為785 nm的半導體激光（美國Thorlabs公司）經過濾波后進入一臺TE2000U尼康倒置生物顯微鏡（日本Nikon公司），在進顯微鏡之前，增加一對X和Y方向的電控掃描對鏡，通過信號發生器給對鏡的電機加電，通過調節電壓分別控制X和Y方向掃描的幅度，通過調節信號的頻率控制掃描的頻率。在本實驗中，X方向設定的頻率為8 Hz，即1 s掃描8次，Y方向設定的頻率為0.3 Hz，X和Y方向電壓都設定為2.6 V。光譜儀耦合到電荷耦合器件CCD上，CCD用液氮冷卻到-120 ℃，用懸浮在水中的聚苯乙烯小球做系統校正。

2 方法

2.1 兩面針樣品溶液的制備 精密稱取兩面針藥材3.00 g，加氯仿180 mL，回流提取3次，每次2 h，過濾，回收氯仿，殘渣用無水乙醇定容到5 mL量瓶中。提取物用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，取濾液300 μL，加入RPMI1640培養液1 200 μL，即得。此方法處理后的樣品溶液生藥濃度為120 g·L^-1，再將其質量濃度對半稀釋成60 g·L^-1。置于4 ℃保存待用。

2.2 氯化兩面針堿溶液的配制 精密稱取氯化兩面針堿1.00 mg，無水乙醇定容至1 mL。于超聲儀中超聲1 h后，在超凈臺上用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，取濾液300 μL，加入RPMI1640培養液1 200 μL，即得氯化兩面針堿的質量濃度為0.20 g·L^-1。

2.3 肝癌細胞的培養 人肝癌細胞7404培養于DMEM培養基中，內含10%胎牛血清、L-谷氨酰胺2 nmol·L^-1、青霉素100 IU·mL^-1和鏈霉素100 IU·mL^-1，37 ℃，5% CO₂常規培養。每天2次置于倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期細胞用于實驗。

2.4 肝癌細胞拉曼光譜的測定 取對數生長期的人肝癌細胞7404懸液接種于96孔培養板，細胞濃度為1×105個/mL，每孔190 μL；培養24 h后，分別加入兩面針提取溶液，每孔10 μL（兩面針樣品溶液和氯化兩面針堿溶液作用到肝癌細胞上的最終濃度分別是3 g·L^-1及10 mg·L^-1，此濃度是通過前期MTT法及流式細胞儀研究確定的最佳藥物作用濃度），并根據藥物對細胞的作用時間12，24，36，48 h進行分組。各組細胞經過酶消化、離心、PBS漂洗后，用PBS稀釋至適宜濃度后用于拉曼光譜的測定。

從各組細胞中取一部分用于拉曼光譜的檢測。激光光鑷拉曼光譜系統（LTRS），激光光鑷拉曼光譜系統實驗裝置及系統描述詳見1.5項。一般而言，拉曼光譜系統激光激發光斑直徑在2 μm左右，面積約3.14 μm²，肝癌細胞的直徑一般在15～20 μm，面積大于200 μm²，入射激光僅照射細胞的局部區域不一定能獲取整個細胞的光譜信息，本實驗采用掃描方式收集細胞光譜，即設定一個區域和時間讓激光連續在設定好的區域進行運動，以累積的方式記錄光譜信號，由此獲取的細胞光譜信息較全面。為了獲得單個細胞的整體光譜，實驗采用激光束動態掃描模式，激光束在一個周期內以分別向X軸橫向和Y軸縱向運動，實驗中掃描頻率被設定為1 Hz。以20 mW激發功率和30 s曝光時間。拉曼系統實驗條件是已經通過前期研究^[12]設定，拉曼光譜的響應強度足以反映細胞的拉曼圖譜。

拉曼檢測流程：加樣，隨機選取視野，視野中每個細胞均檢測其拉曼光譜，然后用Hochest33342/PI染色法區分正常細胞、凋亡細胞和死亡細胞，最后選取凋亡細胞的拉曼光譜進行數據分析。重復以上操作直到獲得30個凋亡細胞的拉曼光譜數據。掃描的范圍是可以包括整個細胞面積的最小四邊形，來自于溶液、石英片、光學部件的背景光譜也用同樣掃描的面積取得。每掃描一個細胞光譜的同時，要掃描一次細胞周圍樣品池的背景光譜，進行背景光譜的扣除，最后得到細胞的光譜。由于每個細胞只被功率為20 mW 的激光照射了30 s，因此對細胞生物活性的影響很小^[13]。

細胞活性的鑒定：各組細胞完成拉曼檢測后將5 mg·L^-1 Hochest33342熒光染料及5 mg·L^-1 PI熒光染料加入待檢測樣品中。避光反應15 min，置于熒光顯微鏡下，在激發波長為352 nm的紫外光及激發波長為488 nm下觀察細胞的情況。

2.5 數據處理 光譜數據運用Origin 8.0進行背景扣除、平滑、拉曼光譜基線校正軟件進行基線校正，用Unscrambler 9.7對光譜數據進行歸一化處理，歸一化的方法是標準正態變量變換（standardized normal variate， SNV）。

3 結果

3.1 7404肝癌細胞的Hochest33342/PI染色結果 Hochest33342/PI在熒光顯微鏡下觀察?；罴毎募毎Y構完整；染色后其細胞核在激發波長為352 nm下呈彌漫均勻的淡藍色熒光；活細胞對PI 染料拒染，所以在激發波長488 nm下觀察不到紅色熒光，見圖1。

凋亡細胞的細胞膜完整；染色后其細胞核在激發波長為352 nm下呈亮藍色熒光，并觀察到核碎裂；凋亡細胞的細胞膜完整對PI染料拒染，所以在激發波長488 nm下觀察不到紅色熒光，見圖1。

死亡細胞的胞膜完整性被破壞；染色后其細胞核在激發波長為352 nm下觀察到藍色熒光；在激發波長488 nm下觀察到紅色熒光，見圖1 。

在激發波長為352 nm下是不能區分凋亡細胞和死亡細胞的。只有在激發波長488 nm下，凋亡細胞的細胞膜完整對PI染料拒染，觀察不到紅色熒光；死亡細胞細胞膜被破壞，PI染料進入細胞在激發波觀察到紅色熒光，見圖1?？梢詤^分對應凋亡細胞和死亡細胞。

3.2 各組細胞拉曼光譜 經兩面針藥液處理0，12，24，36，48 h的肝癌細胞的平均拉曼光譜見圖2，各峰歸屬見表1。從圖2可以觀察到A組不加藥物處理的肝癌細胞平均拉曼光譜隨時間的變化沒有發生明顯的變化趨勢，而加入藥物處理后的B，C，D組的肝癌細胞的拉曼光譜隨時間的變化發生了一些規律性的變化。與核酸相關的譜峰，785 cm^-1代表核酸U，C，T堿基環呼吸振動和磷酸二酯鍵O-P-O伸縮振動，此峰值隨著藥物作用時間的推移逐漸降低。與蛋白質相關的譜峰，1 002 cm^-1代表苯丙氨酸面內振動，1 080 cm^-1代表蛋白質C-N伸縮振動，1 175 cm^-1代表蛋白質分子的酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸等殘基中的C-O基團氫鍵結合力，1 259 cm^-1代表蛋白質酰胺Ⅲ帶，1 610 cm^-1代表絡氨酸的C=C伸縮振動，1 660 cm^-1代表蛋白質酰胺Ⅰ帶。1 002，1 175，1 259，1 660 cm^-1峰強度隨兩面針藥物作用時間的延長都有不同程度的降低。1 610 cm^-1峰強度隨兩面針藥物作用時間的延長而升高。與脂質相關的譜峰，1 443 cm^-1代表脂質CH₂/CH3變形振動，1 300 cm^-1代表脂質CH₂扭曲振動，這2個峰沒有發現明顯的變化趨勢。

為了定量描述肝癌細胞中生物大分子的含量隨著兩面針藥液處理時間的變化規律，從拉曼光譜圖中提取785，1 002，1 660，1 610 cm^-1這4個表征細胞內物質變化的特征峰相對峰強度百分比，結果見表2～4。785，1 002，1 660 cm^-1相對峰強度隨藥物作用時間的延長而顯著，由此說明肝癌細胞在凋亡過程中細胞內核酸、蛋白質類等生物大分子顯著降低。

4 討論

785 cm^-1峰值隨藥物處理時間延長顯著的降低，是反映細胞凋亡程度的敏感指標。785 cm^-1峰強度代表細胞內磷酸二酯鍵以及C，T，U堿基含量，由此可以推論兩面針藥物作用后，肝癌細胞的DNA的磷酸根骨架有一定的斷裂，細胞內含氮堿基含量逐漸下降，從而導致癌細胞的分裂繁殖失去有效的控制。這和目前對細胞凋亡的認識是一致的^[12]。細胞凋亡時，內源性的核酸內切酶被激活，在核小體的連接處將DNA切斷為200 bp整數倍的小片段，細胞在凋亡晚期DNA降解加劇，因此核酸堿基的含量也會下降。DNA是許多抗癌藥物作用的靶標^[15-16]，應用共振拉曼光譜研究抗癌藥物與DNA的相互作用，能夠得出相互作用的位點和連接方式等重要信息。據現有的研究及相關報道^[17]，兩面針提取液作用于肝癌細胞后其可能的機制是兩面針活性成分能夠嵌入DNA，影響拓撲異構酶介導的DNA鏈的切割/連接過程，造成細胞內大量DNA雙鏈斷裂，進而導致腫瘤細胞周期阻滯于G₂/M期，并誘導腫瘤細胞凋亡。

1 002，1 175，1 660 cm^-1峰強度隨兩面針提取物作用時間的延長而降低，而1 610 cm^-1峰隨著提取物作用時間的延長而升高，表明細胞內蛋白質分子側鏈氨基酸殘基發生改變，酪氨酸增多，苯丙氨酸減少，同時蛋白質分子中酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸等殘基中的C-O基團結合的氫鍵受到破壞，蛋白質酰胺Ⅰ及蛋白質酰胺Ⅲ的峰高降低，蛋白質的空間結構發生變化。1 610 cm^-1峰強度并未隨氯化兩面針堿作用時間的延長而升高，說明氯化兩面針堿是單一生物堿藥效成分，而兩面針提取物含多種生物堿混合藥效成分，兩者總體上誘導肝癌細胞凋亡的機制是一致的，但也存在微小的差別，這種差異的原因有待進一步的研究。

兩面針抑制腫瘤細胞的增殖，一方面與細胞增殖相關的蛋白質表達降低有關，使蛋白質的合成代謝減弱；另一方面，凋亡的過程確實會伴隨著一些蛋白的水解，因此蛋白質含量會下降。細胞發生凋亡時半胱氨酸蛋白酶家族的成員被水解激活，活化的酶可以催化其他底物蛋白的水解，造成細胞內蛋白質含量的降低。

5 結論

肝癌細胞經兩面針提取物處理后，利用顯微拉曼光譜技術測定不同處理時間后肝癌細胞拉曼光譜的變化，結果表明肝癌細胞中核酸和蛋白質含量隨藥物處理時間的延長而顯著降低，說明凋亡的肝癌細胞中核酸和蛋白質的含量均低于活細胞，并與藥物處理時間呈一定的相關性。拉曼光譜能夠反映經中藥兩面針提取物作用后肝癌細胞內核酸、蛋白質等生物大分子物質變化的信息，對實時監測細胞凋亡過程及藥物的篩選乃至臨床應用具有重要意義。

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[責任編輯 陳玲]