人參莖葉提取物及配伍石菖蒲揮發油的大鼠在體腸吸收動力學的研究

鄭夢成+杜守穎+賈山+馬軍明+張晴+白潔+陸洋

[摘要]該試驗通過研究復方金思維方中君藥人參莖葉提取物配伍使藥石菖蒲揮發油后有效成分人參皂苷 Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rd腸吸收的變化，驗證該方中佐藥石菖蒲能否協助君藥人參莖葉總皂苷加強其療效。試驗采用大鼠在體單向腸吸收模型考察3種皂苷成分及配伍石菖蒲揮發油后的腸吸收情況，以高效液相色譜法測定灌流液中人參皂苷 Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rd的質量濃度，計算其腸吸收動力學參數；人參莖葉提取物中人參皂苷Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rd在小腸上段吸收速率較大；藥物濃度對其吸收速率沒有顯著性影響，提示吸收機制為被動擴散；石菖蒲揮發油對其在小腸的吸收有顯著促進作用，說明方中人參皂苷提取物與石菖蒲的配伍科學合理。

[關鍵詞]人參莖葉提取物； 石菖蒲； 在體單向腸吸收

[Abstract]To investigate the changes in intestinal absorption of ginsenosides Rg1， ginsenosides Re and ginsenosides Rd after combined administration of Ginseng Radix et Rhizoma extract and Acori Tatarinowii Rhizoma， in order to confirm whether the combined administration is scientific and rational， and provide experimental basis for pharmaceutical studies of the formula. Anin vivosingle-pass perfusion method was performed to study the effect of various concentrations of ginsenosides Rg1， ginsenosides Re， ginsenosides Rd on the intestinal absorption at duodenum， jejunum， ileum and colon. The concentrations of ginsenosides Rg1， ginsenosides Re， ginsenosides Rd were determined by RP-HPLC.The absorption rate constant （Ka） and the apparent absorption coefficient（Papp） of ginsenosides Rg1， ginsenosides Re， ginsenosides Rd were calculated.The result showed that ginsenosides Rg1， ginsenosides Re， ginsenosides Rd had a high absorption rate on upper portion of the small intestine. The drug concentration had not significantly impact on the absorption rate， suggesting that ginsenosides Rg1， ginsenosides Re， ginsenosides Rd were absorbed via passive diffusion.Volatile oil of Acori Tatarinowii Rhizoma had obvious effect in enhancing intestinal absorption of ginsenosides Rg1， ginsenosides Re， ginsenosides Rd， indicating that the combined administration of Ginseng extract and Acorus tatarinowii Schott is scientific and rational.

[Key words]extracts of Ginseng Radix et Rhizoma； Acori Tatarinowii Rhizoma；in vivosingle-pass perfusion method

doi：10.4268/cjcmm20162124

中醫方劑中有使用“藥引子”的歷史，即在君臣配伍時添加使藥作為“藥引”起到“引藥上行”“助藥效”之作用，而芳香類中藥因其辛香走竄之性多作為使藥應用到臨床組方中，如冰片、石菖蒲等。復方金思維來源于臨床經驗方，主要以人參莖葉提取物配伍石菖蒲治療老年癡呆癥。人參莖葉具有大補元氣、安神益智^[1]之功效，為方中君藥。人參皂苷 Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd是人參的主要活性成分，現代研究表明其具有改善記憶功能^[2]、抗腫瘤抗衰老^[3-4]、抗菌抗病毒^[5]、促進細胞增殖^[6]等作用。其腸道吸收受其自身性質、胃腸道酸性環境、場內菌群、肝臟首過效應等多重因素的影響，口服生物利用度很低^[7-10]。石菖蒲為方中使藥，具有芳香開竅、引藥上行的作用，揮發油是其有效成分?，F代研究表明其在治療阿爾茨海默病方面具有確切療效^[11-12]，對腦自由基損傷有保護作用，并提高血腦屏障通透性。人參莖葉提取物配伍石菖蒲后能否改善有效成分的腸吸收情況，是處方設計的重要依據。

課題組前期對復方金思維的藥效學研究，確定了最佳提取工藝，并根據臨床給藥的需要制成顆粒劑。對于口服給藥劑型來說，藥物的腸吸收特性能直接反應口服后的吸收效果。因此本文擬根據處方配比，采用大鼠在體腸吸收模型研究人參莖葉提取物及配伍石菖蒲后有效成分的吸收動力學特征探討人參莖葉提取物中人參皂苷 Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd的吸收機制及配伍石菖蒲后的腸吸收變化情況，旨在為復方金思維的制劑研制提供生物藥劑學依據。

1 材料

Agilent 1260高效液相色譜儀；DDB-300電子蠕動泵（上海之信儀器有限公司）；TGL-16G飛鴿離心機（上海安亭科學儀器廠）；VORTEX-5旋渦混合器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；賽多利斯 BSA 224S型電子分析天平（北京賽多利斯公司）。

人參皂苷Rg1對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110703-201430）；人參皂苷Re對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110754-201425）；人參皂苷Rd對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號111818-201302）；人參莖葉提取物（南京澤朗醫藥科技有限公司）；石菖蒲揮發油（處方量石菖蒲經水蒸氣蒸餾，至油量不再增加）；乙腈（Sigma，色譜純），甲醇（Sigma，色譜純），娃哈哈純凈水，其他試劑為分析純。

SD大鼠，雄性，220～240 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證編號SCXK（京）2012-0001。

2 方法

2.1 試液配制

2.1.1 Krebs-Ringers營養液的配制 參考文獻[13]配制Krebs-Ringers營養液。

2.1.2 腸循環液的配制 灌流液A：分別精密稱取人參莖葉提取物125，250，500 mg于250 mL量瓶中，K氏液溶解并稀釋至刻度，作為低、中、高濃度的藥物腸灌流液。

灌流液B：精密稱取人參莖葉提取物250 mg于250 mL量瓶中，另取50 μL石菖蒲揮發油，用50 μL乙醇溶解后加入量瓶中，K氏液溶解并稀釋至刻度，作為石菖蒲揮發油配伍中濃度人參莖葉提取物的腸灌流液。

2.1.3 對照品儲備液的配制 精密稱取人參皂苷Rg1 10 mg，人參皂苷Re 15 mg，人參皂苷Rd 10 mg，置25 mL量瓶中，用K氏液溶解并稀釋至刻度，搖勻，得人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd對照品儲備液。

2.2 灌流液樣品處理方法

吸取灌流液1 mL，加入甲醇3 mL沉淀蛋白，吸取上清液，氮氣吹干，1 mL甲醇復溶，經0.45 μm微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液。

2.3 腸灌流液中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd的含量測定

2.3.1 色譜條件 CAPCELL PAK C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫，0～28 min，20% A，28～58 min，20%～39% A，58～60 min，39% A；檢測波長203 nm；柱溫30 ℃；流速1.5 mL·min^-1。對照品溶液及灌流供試品溶液的色譜圖見圖1。

2.3.2 標準曲線的制備 分別精密量取人參皂苷Rg1、人參皂苷Re及人參皂苷Rd對照品儲備液0.5，1，2，4，6，8 mL于10 mL量瓶中，用空白腸灌流液稀釋并定容至刻度，分別得到一系列質量濃度的人參皂苷Rg1、人參皂苷Re及人參皂苷Rd對照品溶液，按2.2項下方法處理，測定峰面積，以峰面積為縱坐標（Y），濃度為橫坐標（X），進行線性回歸。人參皂苷Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rd的回歸方程分別為Y=1.338 2X-2.030 3，r=0.999 9；Y=1.390 3X-2.706 9，r=0.999 9；Y=1.92X-4.720 1，r=0.999 9。表明人參皂苷Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rd分別在20.26～405.20，25.02～500.40，20.26～405.20 mg·L^-1與峰面積線性關系良好。

2.3.3 精密度試驗 分別精密稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd對照品適量，用空白腸灌流液稀釋至不同倍數，得低、中、高（人參皂苷Rg1依次為81.04，162.08，324.16 mg·L^-1，人參皂苷Re依次為100.08，200.16，400.32 mg·L^-1，人參皂苷Rd依次為81.04，162.08，324.16 mg·L^-1）3個質量濃度的對照品溶液，按2.2項下方法處理，每個濃度重復進樣3次，低濃度組人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd的RSD分別為1.4%，1.2%，0.40%，中濃度組RSD分別為1.5%，2.0%，1.1%，高濃度組RSD分別為0.40%，0.50%，0.80%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 回收率試驗 取大鼠空白腸液1 mL，分別加入1 mL低、中、高濃度的人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd對照品溶液，按2.2項下方法處理分析測定，計算回收率，低濃度組人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd分別為96.61%，97.26%，96.38%，中濃度組分別為98.22%，98.68%，97.91%，高濃度組分別為96.37%，96.48%，96.78%，RSD均小于5.0%，符合藥動學試驗要求。

2.4 人參皂苷Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rd在空白腸灌流液中的穩定性研究

用空白腸灌流液配制 1.0 g·L^-1的人參莖葉提取物溶液3 份，37 ℃水浴孵育4 h，分別于0，0.5，1，2，3，4 h取樣，按2.2項下方法處理，分析比較不同時間的濃度變化。結果在37 ℃水浴中放置4 h，樣品中人參皂苷Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rd的RSD分別為1.1%，1.3%，1.5%，灌流液樣品基本穩定（RSD<3.0%）。

2.5 蠕動泵管路的物理吸附情況考察

以灌流液A，37 ℃水浴恒溫，于體外空循環3 h，在0，0.25，0.5，1，2，3 h取樣測定，考察人參Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd在蠕動泵管路的吸附情況。結果人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd的RSD分別為0.50%，0.20%，1.7%，說明管路對樣品中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd沒有吸附（RSD<3.0%）。

2.6 大鼠在體單向腸灌流試驗

大鼠手術^[14]后，以37 ℃預熱的生理鹽水以1 mL·min^-1沖凈腸內容物，排凈生理鹽水，用預熱37 ℃的灌流液以0.2 mL·min^-1灌流30 min平衡，收集流出液并開始計時，于15，30，45，60，75 min收集灌流液，并精確稱量流出液質量。試驗結束后，參考文獻方法^[14]測量腸段長度及內徑。

2.7 吸收動力學參數的計算

參考文獻[14]采用重量法計算藥物吸收速率常數Ka和表觀吸收系數Papp。

2.8 統計方法

采用SPSS 17.0軟件對數據進行單因素方差分析（ANOVA），當P<0.05時判定具有顯著性差異。

3 結果

用SPSS 17.0軟件對數據進行ANOVA檢驗，結果表明在0.5～2.0 g·mL^-1，藥物質量濃度對人參莖葉提取物中人參皂苷Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rd在小腸的吸收速率沒有顯著性影響，吸收機制為被動擴散。人參皂苷Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rd在各腸段的吸收速率常數大?。菏改c≈結腸>空腸≈回腸，表明其在小腸上端吸收較好。配伍石菖蒲揮發油后，可使人參皂苷Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rd的Ka分別增加7.8，6.3，3.8倍，表明石菖蒲揮發油對其小腸吸收有明顯的促吸收效果，見表1～4。

4 討論

復方金思維是中醫臨床經驗方，治療老年癡呆癥療效顯著。人參莖葉提取物為方中君藥，石菖蒲為使藥。配伍石菖蒲后能否改善方中主要有效成分人參莖葉皂苷的腸道吸收是本研究的主要內容。

本試驗首先采用大鼠在體單向腸灌流模型對人參莖葉提取物單味組吸收動力學特征進行了初步探究，證實人參皂苷Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rd的腸內吸收機制為被動擴散，提示可將含人參皂苷Rg1，Re，Rd的藥物設計成藥物緩釋系統，且在小腸上端吸收較好的成分可以通過靶向給藥技術（如漂浮、黏附滯留技術等）提高制劑的生物利用度。

人參皂苷Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rd是君藥人參莖葉的主要成分，石菖蒲揮發油是方中使藥石菖蒲的主要成分，文獻報道，中藥揮發性成分對相伍成分的吸收及生物利用度存在不同程度的影響^[15]，多有促透劑的作用，能促進其他藥物成分的吸收^[16]。本試驗利用大鼠在體腸灌流模型考察配伍石菖蒲后人參皂苷Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rd在小腸不同腸段的吸收情況，試驗結果顯示，石菖蒲對人參皂苷Rg1，Re，Rd的小腸吸收具有明顯的促進作用，這符合文獻結果的推斷，也驗證了復方金思維配伍的合理性。究其作用機制，動物實驗證明^[17]芳香開竅藥不僅自身具有良好的細胞通透性，還能促進其他藥物在某些器官組織的細胞通透性。另外，胡園等^[18]證實了石菖蒲作為使藥可“醒腦開竅”的藥理作用，其作用機制是使內皮細胞間的緊密連接松弛，導致血腦屏障通透性增加，因而可以提高腦組織中配伍藥物的含量。該研究提示石菖蒲促進人參皂苷在腸道的吸收機制也可能與此類似，石菖蒲可能通過調節胃腸道多肽激素或緊密連接蛋白，使胃腸壁細胞間緊密連接松弛，通透性增加，從而促進藥物胃腸道運動、透過和吸收。本文只對石菖蒲揮發油對人參皂苷Rg1，Re，Rd的促腸道吸收作用做了初步探討，其確切的作用機制還有待進一步研究的推進。

同時，本試驗結果表明，石菖蒲揮發油對于3種皂苷成分促吸收作用的程度不同，具體表現為對于人參皂苷Rg1，Re（人參三醇型）促吸作用較人參皂苷Rd（人參二醇型）稍大，推測可能與其母核結構有關，也與其代謝后產物的種類與性質有關。皂苷類成分在體內并不是完全以原形吸收，必然受到酸堿環境，胃腸道菌群，肝臟代謝的影響而發生一系列降解和變化^[7-10]，而關于石菖蒲揮發油的促吸收作用在3種皂苷成分中顯示出差異的原因，還有待進一步的深入研究。

[參考文獻]

[1]石恩駿.人參補虛安神 除邪益智[N]. 中國中醫藥報，2015-08-31（005）.

[2]邵碧霞，白潔，孫文虹，等. 人參根和莖葉皂苷對大鼠學習記憶功能的影響[J]. 中草藥，2005（6）：895.

[3]張曉文，宋清，徐志偉. 人參莖葉總皂苷對心理應激荷瘤小鼠腫瘤生長及化療效果的影響[J]. 現代食品科技，2010（4）：348.

[4]劉佳，陳丹娜，曾琛，等. 人參莖葉總皂苷對D-半乳糖致衰老小鼠腦組織的抗氧化作用[J]. 中國老年學雜志，2015（13）：3526.

[5]姜淼，黃欣，沈亮亮，等. 2種中藥單體對念珠菌的體外藥敏研究[J]. 中國真菌學雜志，2011（1）：26.

[6]張曉曉. 人參皂苷的化學轉化和對H₂O₂誘導神經細胞損傷的保護作用及構效關系研究[D].煙臺：煙臺大學，2014.

[7]韓旻， 傅韶， 方曉玲. 三七皂苷中人參皂苷Rg1與Rb1口服吸收及其體內藥代動力學的研究和比較[J]. 藥學學報， 2007， 42（8）：849.

[8]劉霞. 人參皂苷Rd口服吸收及其體內藥代動力學的研究[D]. 蘭州：蘭州大學， 2011.

[9]陳廣通， 楊敏， 果德安.人參皂苷Re在大鼠體內的代謝研究[J]. 中國中藥雜志， 2009， 34（12）：1540.

[10]Vladimir P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers.[J]. Nat Rev Drug Discov，2005，4（2）：145.

[11]田素民，馬宇昕，孫靈芝，等. 石菖蒲不同藥效部位改善阿爾茨海默病模型小鼠的認知功能[J]. 中國病理生理雜志，2012（1）：159.

[12]馬宇昕，李國營，孫靈芝，等. 石菖蒲不同提取部位對β淀粉樣蛋白致學習記憶障礙模型小鼠的影響[J]. 神經解剖學雜志，2011（5）：521.

[13]劉怡娟，郁長治，唐輝，等. 天山花楸葉黃酮類化合物在大鼠小腸的吸收特性[J]. 中國實驗方劑學雜志，2015，21（11）：16.

[14]翟秉濤，郭東艷，史亞軍，等. 根皮苷大鼠在體吸收特性[J]. 中國中藥雜志，2016，41（13）：2527.

[15]李鳳林. 人參莖葉皂苷藥理作用的研究進展[J].貴州農業科學，2013， 41（2）：54.

[16]李揚，王陽，劉科攀. 中藥揮發油作為透皮吸收促進劑的研究進展[J]. 藥物評價研究，2011，34（6）：474.

[17]紀娟，周安，張亞中，等. 芳香開竅類中藥促進藥物體內吸收的研究進展[J]. 江西中醫藥大學學報，2016（2）：106.

[18]胡園，袁默，劉屏，等. 石菖蒲對血腦屏障超微結構及通透性的影響[J]. 中國中藥雜志，2009，34（3）：349.

[19]Liu R，Zhang L，Lan X，et al. Protection by borneol on cortical neurons against oxygen-glucose deprivation/reperfusion： involvement of anti-oxidation and anti-inflammation through nuclear transcription factor κappaB signaling pathway[J]. Neuroscience， 2011， 176：408.

[20]楊洋. 芳香開竅類藥物與P-gp相關性研究[D].西安：西北大學，2014.

[責任編輯 曹陽陽]