ARTP生物育種技術與裝備研發及其產業化發展

吳亦楠，邢新會，，張翀，，李和平，王立言

ARTP生物育種技術與裝備研發及其產業化發展

吳亦楠1，邢新會1，2，張翀1，2，李和平2，3，王立言2

邢新會，清華大學教授，博士生導師，“百人計劃”入選者。主持“國家自然科學基金重大儀器專項”項目、中以國際合作項目，“十二五”科技支撐計劃項目，日本JST CREST等項目；發表SCI論文150余篇，合作著書8本，譯著教材2部，申請發明專利100余項，獲得發明專利60余項，其中1項國際專利。擔任《Journal of Bioscience and Bioengineering》主編，《Biochemical Engineering Journal》副主編，《食品科學》、《生物產業技術》及5個英文學術期刊編委。獲得第17屆全國發明展覽會獎銀獎（2007年），北京市科學技術獎三等獎（2008年），中國石油和化學工業協會技術發明獎二等獎（2009年），中國僑界貢獻獎（創新人才）（2010年），高等學?？茖W研究優秀成果獎（科學技術）科技進步獎二等獎（2015年）。E-mail：xhxing@mail.tsinghua.edu.cn

1.工業生物催化教育部重點實驗室，清華大學化工系生物化工研究所，清華大學合成與系統生物學研究中心，北京 100084

2.清華大學無錫應用技術研究院生物育種中心，無錫 214072

3.清華大學工程物理系，北京 100084

安全高效的微生物誘變和高通量篩選技術與裝備是生物技術科研及產業發展的核心，具有重要的研究價值和廣泛的應用前景。筆者研究團隊成功將基于大氣壓射頻輝光放電的常壓室溫等離子體（ARTP）應用于生物誘變育種領域，對其與生物大分子、細胞之間的作用機理進行了系統研究，并研發了具有自主知識產權的ARTP生物育種儀。因操作安全簡便、突變快、突變率高、獲得的突變體性狀穩定等特點，ARTP育種儀已成功應用于百種以上微生物的誘變育種，在行業引起了廣泛關注，并實現了的國際出口。綜述了ARTP生物育種技術的原理、裝備研發現狀及其近年來的研究和應用進展，并對其今后的發展趨勢進行了展望。

ARTP；篩選；生物育種；誘變

自19世紀30年代以來， 生物發酵技術以其節能高效、綠色無害的特點被廣泛用于生產各類化學品，服務于食品、醫藥、材料、環保、能源等領域。以化石資源為基礎的現代工業面臨著日益嚴重的資源短缺、環境污染、氣候變化和能源危機，因此人類對工業生物技術及其綠色可持續發展工業給予極大的期待，生物經濟呼之欲出[1]?？焖龠x育具有高產、高魯棒性、高穩定性、高安全性表型的工業微生物成為生物經濟發展的關鍵技術。

微生物育種技術是生物經濟的核心。近年來，隨著分子生物學、代謝工程學、系統生物學及合成生物學等學科的快速發展，菌株的理性和半理性設計得到了長足的進步。分子育種技術具有一定的定向性，且因其引入了外源基因和合成途徑，能極大地拓寬微生物生產的產品種類和效率，但由于細胞的復雜性，即使采用理性設計，仍無法完全準確預測結果，因此需要采用設計-構建-測試-學習循環（DBTL）的模式，但理性設計存在技術難度高、周期長，適用微生物種類有限、生物安全性等問題，在實際應用時仍面臨著很多挑戰。相比之下，具有悠久歷史的誘變育種技術因其操作簡單、成本相對較低、產生突變容易、適用范圍廣、屬于非轉基因操作等，仍是微生物育種研究和產業應用的平臺技術。因此，發展安全高效的新型生物誘變技術具有重要的研究價值。

誘變育種根據其誘變源的不同可以分為化學誘變[2-3]、物理誘變[4-7]和生物誘變[8-9]。近年來，筆者研究團隊基于大氣壓射頻輝光放電原理，自主研發的常壓室溫等離子體（ARTP）誘變技術[10]及裝備作為繼離子束注入[6]和大氣壓介質阻擋放電等離子體（APDBD）體誘變技術[11-14]之后的又一安全高效誘變新方法。因不需要真空系統，設備結構簡單、成本低；放電均勻、穩定、可控，操作簡便，安全性高；等離子體產生條件溫和（常壓、室溫范圍），富含大量活性粒子，突變譜廣，突變率高等，ARTP在工業微生物育種中得到了廣泛應用并取得良好效果，引起了國內外科研機構和企業越來越多的關注。 本文重點介紹ARTP技術和裝備的研究及應用發展。

圖1 常見的APNED發生器[17]

1 ARTP生物育種技術原理

ARTP是常壓非平衡放電等離子體（APNED）[15-16]的一種。APNED由帶電粒子（電子、陰離子、陽離子）、自由基、中性粒子（激發的原子或分子）、光子（可見光和紫外線）和電磁場組成，其各組分比例因等離子體產生方式、放電電壓、氣源種類不同而略有差異。常見的APNED發生器如圖1所示[17]。APNED因去除了復雜、昂貴的真空系統且溫度較低，其熱效應影響可以忽略而越來越受關注，被廣泛用于細菌、真菌、病毒等病原體的滅活、傷口及醫療設備的消毒、細胞轉染及癌癥細胞的誘導凋亡等研究[18-21]。

大量研究表明，APNED與DNA、蛋白質、微生物細胞發生相互作用[17]，從而產生細胞的致死和亞致死效應。APNED中存在的大量活性氧化物和活性氮化物是引起DNA斷裂、真核細胞DDR響應、原核細胞SOS響應的主要因素[22-24]。APNED中常見的活性物質如表1[25]所示，活性物質與DNA的作用位點、誘導DNA斷裂的作用過程如圖2[26]和圖3[17]所示。當N-糖苷鍵受到攻擊或脫氧核糖發生脫氫反應時，DNA會由于一系列變化產生單鏈斷裂；而當不同鏈上的斷鏈位置相近時，能夠產生雙鏈斷裂。裸露的DNA雙鏈、質粒經由APNED處理后，在短時間內就會出現雙鏈斷裂和完全裂解的現象。APNED照射活細胞首先會改變細胞膜的通透性，但具有不同膜結構的細胞對APNED的耐受能力不同[13]。在膜結構被破壞之后，APNED內的活性粒子或其與水分子及胞內脂質、蛋白質等生物分子進一步反應生成的有機氧化物會引發DNA易錯性修復機制[27]。當APNED照射強度過高時，細胞會死亡；而當強度適中時，細胞則會產生基因突變，胞內基因轉錄水平、翻譯水平等都將隨之變化[28-33]。王立言和張雪等[10，34]利用黃嘌呤氧化酶法和FDG與PI熒光染料從細胞水平上解析了上述作用機制。者研究團隊首次用于微生物育種。并且研究團隊揭示了ARTP與生物作用的機理，有良好的應用成效[35]。

表1 APNED中常見的活性物質

圖2 等離子體活性物質與DNA的可能作用位點[26]

圖3 活性物質引起的DNA斷裂[17]

2 ARTP生物育種設備研發及誘變特點

AR TP生物育種技術的實驗室研究平臺如圖4所示[10]。當工作氣體經過兩個通電電極之間時，具有高能量的電子與周圍的中性粒子通過彈性碰撞和非彈性碰撞發生能量交換，使工作氣體分子分解、激發或電離，隨著電壓的升高，氣體被擊穿產生放電，形成具有一定電離度的等離子體；在氣流作用下產生的等離子體以一定的速度噴出并與空氣中的組分反應，形成含有氮、氧、羥基等其他活性粒子的等離子體射流。

筆者研究團隊以He為工作氣體對該發生器的物理特性進行了系統深入的研究，代表性結果圖5所示。

在大氣壓條件下，ARTP溫度可控制在室溫范圍，適用于各類生物處理[10]；在適宜的電極間距內，等離子體發生器能以α和γ模式實現放電[37]。后者可以用于誘發純空氣或氧氣的持續性放電，起到降低氣耗成本的目的[38]，放電均勻、穩定[36]。等離子體含有豐富的活性粒子，紫外線強度和臭氧含量極低，具有高效誘變細胞的潛力[22]。

由于不同的活性物質作用于DNA的位點不同，造成的氧化損傷、基因突變的偏好性也會有所差異，因此，包含大量不同活性粒子的APNED基因突變范圍廣、突變率高，相比于傳統的物理誘變方法能夠產生更多的基因多樣性和突變譜。ARTP作為APNED中放電最均勻、穩定、安全、可控和更溫和的一類低溫等離子體，被筆

圖4 ARTP生物育種設備的實驗室研發平臺[10]

圖5 ARTP基本物理性質[10，22，36]

筆者研究團隊在揭示ARTP對胞外DNA損傷作用[22]的基礎上，對生產阿維菌素的阿維鏈霉菌進行了誘變育種，結果顯示誘變后的菌株菌落形態發生了明顯變化，根據菌落形態對突變后的菌株進行篩選，獲得了一株阿維菌素總產量提高18%、抗蟲活性最高的組分B1a產量提高43%的高產菌株，且具有良好的遺傳穩定性[35]。利用umu test原理和流式細胞儀，建立了各種誘變源對活細胞DNA損傷強度定量分析方法，結果顯示ARTP對活細胞DNA的損傷強度遠高于其他方法[10,34]。此外，筆者團隊還通過f uctuation test方法比較了不同強度ARTP、UV、化學誘變的DNA損傷強度與突變率的關系[34]，結果如圖6所示?；罴毎麅菵NA損傷強度與誘變率具有一定的正相關性，ARTP誘變的突變率高于其他誘變源，是一種更為高效的誘變源。

為了推進ARTP生物育種技術的廣泛應用，實現技術的裝備化及其產業化是關鍵，筆者團隊在清華大學無錫應用技術研究院建立了生物育種研發中心，并孵化了無錫源清天木生物科技有限公司，成功研制了一系列ARTP誘變育種儀，滿足不同應用需求，如圖7所示。該系列儀器獲得授權國家發明專利10余項，自2012年開始應用以來得到了學術界和工業界的廣泛關注，并已出口到新加坡和日本等國。

3 ARTP生物育種技術在微生物改造中的應用

ARTP生物育種技術以其操作便捷性、安全性和高效性等特點得到了廣泛應用，在微生物育種領域發揮著重要作用[39]。表2列舉了近三年來ARTP生物育種技術應用的部分代表性案例，其他應用案例可參考已發表的綜述論文[37,39]。

目前，ARTP生物育種技術已經成功用于百余種微生物的性能改造，包括細菌、真菌、微藻等，涉及生產能力、細胞生長速度及耐受性等表型的改變，服務于80余家國內外生物技術龍頭企業和科研院所。另外，近兩年ARTP生物育種技術在植物[51]和動物育種中的應用也初步獲得了成功，這表明ARTP生物育種技術是具有普適性的誘變方法。以此為契機，發起并聯合組建的中國生物發酵產業協會微生物育種分會為行業提供了平臺支撐。

圖6 ARTP與常規突變源的DNA損傷強度與突變率的關系（a）及突變率比較結果（b）[34]

圖7 系列ARTP誘變育種儀

表2 ARTP生物育種技術近三年的部分代表性應用實例

4 ARTP生物育種技術展望

綜上所述，基于ARTP固有的安全、簡便、可控等物理學特點，筆者團隊研發的ARTP生物育種裝備具有高效構建多樣性突變庫、實現全局突變、基因沉默及激活途徑等功能，是生物誘變育種的平臺工具。

針對微生物菌種選育過程復雜、操作周期長的問題，除了發展快速引起基因組大范圍突變技術之外，還需要將理性設計和非理性進化方法結合，系統地改造微生物細胞工廠。伴隨著測序技術和生物信息學的飛速發展，經由ARTP誘變構建的突變庫將為研究代謝網絡調控、生物信號傳導、酶促反應機制、表觀遺傳、GWAS等科學問題提供新素材，成為代謝工程和合成生物學等理性設計的重要平臺工具（圖8）。

圖8 面向菌種高效設計與改造的生物育種裝備與進化工程和合成途徑工程技術的整合研究

ARTP作為一種高效的突變工具，能在短時間內處理生物細胞并產生104以上的突變體，構建大的突變庫。如何從多樣性的大突變文庫中快速精準地篩選具有理想目的性狀的菌株是另一個急需解決的關鍵問題，這也是生物育種技術發展的前沿[52]。對于目標表型與細胞形態、顏色無關的工業微生物的篩選，高通量篩選和適應性進化技術成為未來發展的重要方向。自動化設備如移液站、Colony picker等的應用大大加快了這一研究的過程，但其通量大小和篩選效率依然有局限性，而且運行成本高。流式細胞儀[53-54]和微液滴技術[55-58]的興起與應用能夠很好的滿足突變庫的高通量篩選需求。兩者能夠通過生物傳感器或熒光檢測試劑將目的產物胞內或胞外濃度與熒光強度結合，以103～104個單菌/s的通量進行突變菌株的高效篩選。對于抗逆表型，適應性進化是有效的選擇手段[59]。但搖瓶傳代培養體系操作繁瑣，耗時耗力；恒化培養體系則對培養設備有較高的要求，而且也存在操作復雜的問題。如果微液滴技術[60]能在芯片上實現長期的恒化培養及自動化操作，開發出在芯片上自動操作的適應性進化體系，將大幅度提升突變微生物的進化通量?；诖?，本團隊提出了將ARTP高效誘變技術與微液滴技術整合的新思路，目標是研制出誘變-篩選一體化的高通量生物進化儀，以實現微生物的定制化改造，為理論進化生物學和工業微生物育種提供系統、高效的平臺，于2016年獲得了國家自然科學基金委國家重大科研儀器研制專項的支持。

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Recent progress on atmospheric and room temperature plasma(ARTP) biobreeding technology, instrumentation and its industrialization

WU Yinan1，XING Xinhui1，2，ZHANG Chong1，2，LI Heping2，3，WANG Liyan2

1. MOE Key Laboratory for Industrial Biocatalysis, Institute of Biochemical Engineering, Department of Chemical Engineering, Center for Synthetic & Systems Biology, Tsinghua University, Beijing 100084, China
2. Biobreeding Research Center, Wuxi Research Institute of Applied Technologies, Tsinghua University, Wuxi 214072, China
3. Department of Engineering Physics, Tsinghua University, Beijing 100084, China

As the core of biotechnological research and industry, development of safe and eff cient microbial mutagenesis technology and high-throughput screening as well as their instrumentation is of importance. Our research group has successfully developed a novel biological mutation breeding technology using atmospheric and room temperature plasma(ARTP) and invented the ARTP biobreeding equipment with our own intellectual property rights. Due to the benef ts of easy operation, rapid mutation capability, high mutation rate, high mutant genetic stability and high safety for the operators, ARTP biobreeding equipment has attracted extensive attention in the industry and academy and has achieved international exports. It has been successfully applied in the breeding of more than 100 kinds of microorganisms. This paper summarizes the recent progress on ARTP biobreeding technology and prospects.

ARTP; screening; biobreeding; mutagenesis

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.01.006

吳亦楠，在讀博士，主要從事代謝工程、微生物高通量育種等方面的研究。E-mail：wuyinan14@mails.tsinghua.edu.cn

清華大學自主科研計劃（20161080108），日本JST CREST項目，國家自然科學基金委國家重大科研儀器研制專項（2162780028）