重離子束輻照在優良工業微生物新菌株創建中的應用實踐

陳積紅，胡偉，李文建

中國科學院近代物理研究所，蘭州 730000

重離子束輻照在優良工業微生物新菌株創建中的應用實踐

陳積紅，胡偉，李文建

中國科學院近代物理研究所，蘭州 730000

陳積紅，中國科學院近代物理研究所正研級高級工程師，碩士生導師，主要從事重離子束輻射生物學以及高附加值甜高粱生物產品的應用基礎研究。主持包括科技部農業成果轉化項目，中國科學院科技支甘工程項目，中國科學院STS項目子課題，以及企業委托項目等在內的國家和省部級課題8項；以第一作者或通訊作者在國內外期刊發表20余篇論文，其中SCI論文6篇；完成了2項科技成果轉化應用；取得省部級科技進步獎2項。E-mail：chjh@impcas.ac.cn

性能優良的工業微生物菌種是企業保持競爭力的重要保障，因此培育優質、高產的微生物新菌種依舊是生物育種產業創新發展的核心內容之一。重離子束輻照作為一種高效的誘變手段，現已廣泛應用于我國工業微生物育種實踐中。重點回顧了重離子束輻照誘導生物體DNA突變的分子機制研究以及重離子束微生物育種的研究進展。同時，也展望了我國重離子束育種專用裝置的產業化前景。

重離子束；工業微生物；育種

1 重離子束輻照微生物育種的技術優勢

工業微生物與現代生物釀造工業、生物化工工業以及食品工業等行業的關系極為密切[1]。常用的物理誘變手段，如X射線誘變、紫外線誘變、激光誘變、快中子誘變等，已經在微生物育種領域占據越來越重要的位置[2]，但傳統物理誘變育種手段存在的缺點也隨之顯現，如突變率低、突變譜窄或突變表型不穩定等。因此，開發高效的誘變源，提高微生物突變率，擴大突變譜，已成為育種工作者要解決的首要問題。

近年來，隨著物理學科與生命學科相互交叉和滲透，一些高效的新型物理誘變手段相繼涌現，例如重離子束輻照誘變和ARTP等離子體誘變等，現已廣泛應用于工業微生物的育種實踐（黑曲霉[3]、微藻[4]以及阿維鏈霉菌[5]等），并表現出極大的育種優越性。

重離子束即剝離或部分剝離原子序數大于2的原子核外圍電子形成具有能量的帶電離子束[6]，按照輻射類別和電離方式來分，重離子束屬于粒子輻射和直接電離輻射的范疇。為了區別其他學科中正電荷離子，通常采用“束”對其界定。重離子束與常用的物理誘變手段相比，如X射線誘變、γ射線誘變和快中子誘變等，在物理學效應和生物學效應上表現出很大的不同，也與帶負電荷、質量很輕的電子束差別很大。重離子束在穿越介質過程中，具有較高的LET，在其離子穿透徑跡上有較大的能量沉積，屬致密電離輻射，能夠誘發更多的生物損傷。因此，相同劑量輻照情況下，重離子束與低LET的誘變手段相比（如X射線誘變、γ射線誘變和快中子誘變等），具有更高的相對生物學效應（relative biological effectiveness，RBE）。重離子束在能量沉積過程中，其射程末端存在一個尖銳的能量損失峰，即Bragg峰（圖1）。在峰值范圍內，注入離子與生物體的相互作用是局部的、多重的和不易修復的。因此，重離子束用于誘變育種時可能在輕損傷的情況下獲得較高的突變率[7-11]。簡而言之，重離子束輻照穿透誘變是一種具有能量沉積、動量傳遞、質量沉積和電荷交換聯合作用的誘變源，相當于一種復合誘變源，使該技術比其他誘變方法產生更為廣泛的誘變圖譜。

圖1 80MeV/u的12C6+離子束在水中的相對劑量分布

2 重離子束加速器裝置的國內外分布

重離子束的產生方式主要有兩種：一是在宇宙空間中存在的帶電粒子束；二是通過地面重離子加速器裝置將原子部分或全部外圍電子的帶電原子核剝離，這也是獲得重離子束的最重要手段。至今為止，世界范圍內僅有幾家重離子加速器裝置，主要分布在中國（中國科學院近代物理研究所）、日本（NIRS、RIKEN）、德國（GSI）、美國（LBL）、法國（GANIL）、意大利（LNS）等。

中國科學院近代物理研究所（IMP）創建于1957年，是國內最大的重離子物理研究中心，現已發展成為一家以重離子物理及其相關交叉學科為主要研究方向、相應發展粒子加速器和核技術的基地型研究所。由中國科學院近代物理所負責設計建造的國家“九五”重大科學工程——蘭州重離子加速器冷卻儲存環（HIRFL-CSR）于2008年7月通過國家驗收。HIRFL-CSR是我國目前規模最大、加速離子種類最多、能量最高、束流品質最好的重離子加速器系統。目前，蘭州重離子加速器國家實驗室能加速多種重離子種類，如16O6+、12C6+、20Ne10+、36Ar18+、40Ca12+、129Xe27+等，其中12C6+離子束主要被用于微生物育種和植物育種，它主要是由分離扇回旋加速器（SSC，K=450）加速出來，能量范圍約80～1000MeV/u[12]。

3 重離子束誘導生物體DNA突變的分子機制研究

近年來，重離子束輻照微生物和植物育種已經為生物發酵產業和農業做出了巨大貢獻，產生了極大的經濟效益和社會效益。重離子束誘導生物體突變的分子機制研究更是引起了國內外學者的廣泛關注，也是進一步指導重離子束誘變育種的關鍵控制點。例如，Shikazono等[13]利用220 MeV/u的碳離子束輻照擬南芥（ecotype Columbia），獲得了兩株擬南芥突變體，然后對野生型和突變型的29個等位基因進行了突變機理研究，實驗結果表明有14個基因發生了相似位點的突變，而另外15個基因則表現出發生了重組突變，包括缺失、移位、倒置和插入等突變類型，其研究結果同時也表明高LET的碳離子束輻照比其他低LET的射線輻照，表現出更豐富的基因組DNA的突變類型；Raychaudhuri等[14]利用7Li、12C和16O重離子束輻照巴氏甲烷八疊球菌DSM 804發現，古生真菌DSM 804可以修復重離子束誘導的DNA雙鏈斷裂，且修復過程與重離子束的傳能線密度相關；Okayasu等[15]的研究結果表明，與低LET X射線和γ射線相比，高LET重離子束可以誘導雙鏈DNA表現出更復雜的損傷（DNA double strand break）和團簇損傷；Matuo等[16]比較了能量為220MeV/u的12C5+離子束和60Co γ射線對釀酒酵母URA3基因的突變影響，發現12C5+離子束誘導URA3基因突變頻率是60Co γ射線的10倍，突變類型包括移碼突變（13.7%）、顛換突變（68.7%）和刪除與插入（17.6%），且突變位點主要位于核小體連接區域，而60Co γ射線引起的突變位點則貫穿整個URA3基因；Yoshihara等[17]比較了不同物理誘變手段對擬南芥的誘變效應，結果表明208 MeV/u12C5+離子束誘導擬南芥DNA大于2bp的缺失/插入突變的概率更大，γ射線則誘導擬南芥DNA的-1/-2移碼突變；Toyoshima等[18]通過比較高LET的12C5+、20Ne8+、12C6+等重離子束與低LET的γ射線對米曲霉的突變效應和致死效應，發現LET=121keV/μm的12C5+離子束誘導米曲霉的致死率是低LET的γ射線（0.2keV/μm）的3.6倍，12C5+離子束引起米曲霉移碼突變大于20bp的基因刪除突變現象更為明顯；Shi等[19]比較了太空輻照和12C6+離子束輻照對水稻基因組DNA的輻照影響，發現太空輻照和低劑量的12C6+離子束輻照都可以引起水稻基因組和表觀基因組發生明顯的突變影響。

4 我國重離子束微生物育種的研究進展

目前，僅有日本和中國在開展相應的重離子束育種工作。其中，日本主要是進行花卉和農作物育種；中國僅有中國科學院等離子所的低能離子束注入裝置以及中國科學院近代物理所的中、高能重離子束輻照裝置可以開展相應的重離子束育種工作，且在微生物改良、花卉輻照育種以及農作物育種方面做出了巨大的貢獻。利用蘭州重離子加速器國家實驗室提供的中能重離子束（能量為80～126MeV/u12C6+離子束）輻照誘變微生物菌株，為生物發酵產業提供高產能、高轉化率以及低耗能的微生物新菌種并使之產業化，已顯示出極大的優勢和先進性。例如，嚴亞平等[20]利用能量為100MeV/u的12C6+離子束對出發酒精酵母菌YY進行輻照處理，以紅四氮唑作為篩選指示劑進行篩選，最終獲得了一株突變酵母菌T4，基于優化的培養條件，10L發酵罐實驗發現，以甜高粱汁為原料，突變酵母菌T4比出發酵母菌YY產酒精能力和發酵率都提高了12%；王菊芳等[21]利用80MeV/u的12C6+離子束輻照黏紅酵母AY 91015，建立了磺基-磷-香草醛快速篩選高產油脂酵母菌模型，最終篩選出一株突變菌株M16，相對于出發菌株AY 91015，其生物量增加了8.8%，油脂濃度增加了68.8%；薛林貴等[22]利用能量為80MeV/u，LET為 35.5keV/μm的12C6+離子束輻照處理芽孢桿菌P-9，利用尼羅藍熒光染料輔助篩選，最終獲得一株突變株G15，與出發菌株相比，其β-羥基丁酸酯（PHB）的產量增加了1.5倍；李師翁等[23]利用80MeV/u的12C6+離子束輻照土曲霉CA99，最終篩選獲得一株突變株Z15-7，與出發菌株相比，其洛伐他汀產量提高了4倍，最大洛伐他汀產量達916.7μg/mL；胡光榮等[24]利用12C6+離子束輻照產油微藻Desmodesmus sp. S1，借助50μmol（photons）/（m2·s）低亮度光輻照篩選，最終獲得了一株產油率提高了20.6%的突變株D90G-19；馬玉彬等[25]利用80MeV/u的12C6+離子束輻照微擬球藻IMET1，同樣也借助50μmol（photons）/（m2·s）低亮度光輻照篩選，最終也得到了一株突變株HP-1，與出發微藻相比，其最大生長率提升了6%、生物量提高了19%、油脂濃度提高了28%；王芝瑤等[26]利用80MeV/u的12C6+離子束對微擬球藻NannochloropsisoceanicaOZ-1進行輻照處理，借助儀器Imaging-PAM 和酶標儀進行篩選，獲得了兩株生長速率明顯加快的微擬球藻突變株，HP-1 和 HP-2，進一步分析了突變株HP-1和HP-2的生物量積累和油脂積累，與出發藻種相比，發現HP-1生物量升高了18%，油脂產率提升到295mg/（L·d），HP-2生物量升高了26%，油脂產率提升至275mg/（L·d）；Zhou等[27]利用207MeV/u和162MeV/u的12C6+離子束輻照酪丁酸梭菌ATCC 25755，實驗結果證實12C6+離子束輻照可以誘導酪丁酸梭菌的酸耐受力發生變化，增加丁酸的生物代謝生產。胡偉等[3，28]利用80MeV/u的12C6+離子束輻照處理檸檬酸生產菌，最終成功選育出一株高產突變菌株H4002，以玉米淀粉為原料，該菌株可以快速積累檸檬酸；將玉米液化糖濃度控制在163～170g/L，與野生型菌株相比，H4002號菌株積累檸檬酸的速率顯著增加，糖酸轉化率也顯著增強；進一步調高玉米液化糖濃度至200～237g/L，高產H4002號菌株仍擁有快速積累檸檬酸的能力，尤其當玉米液化糖濃度為210g/L時，高產H4002號菌株能積累（187.5±0.7）g/L的檸檬酸，產酸率高達3.13g/（L·h）。成果通過甘肅省科技廳組織的成果鑒定，達到了同類研究的國際先進水平；2012年8月，課題組成功地將該成果技術的使用權轉讓給了我國著名檸檬酸生產企業，目前科研成果技術已經在大生產中得到了很好的應用。

綜上所述，正是基于重離子束對生物體DNA的損傷具有多樣性以及復雜性，重離子束誘變微生物育種是完全可行的，而且能誘發微生物表現出高產的特性，已有的研究結果表明重離子束輻照育種是近年來我國工業微生物育種領域發展起來的新型誘變手段，已經為我國生物發酵產業注入了新的發展動力。

5 展 望

基于重離子束可誘導微生物表現出突變譜寬、突變率高以及突變易穩定等技術優勢，越來越受到科研人員的青睞。正是在這樣的研究背景下，依托中國科學院近代物理研究所先進的重離子加速器設備和其他公用工程條件，充分發揮輻照育種方面的技術優勢，甘肅省輻照誘變育種工程實驗室獲得了甘肅省發展和改革委員會批復，正在甘肅省武威市籌建。該工程實驗室主要從事包括育種專用輻照終端的建設和植物、微生物誘變育種的研究。育種專用輻照生物實驗終端主要包括束流控制系統（束流照射系統、束流掃描系統）、在束實時監控系統（劑量和照射位置）、樣品固定和定位系統、軟件系統、樣品自動換樣系統和輻射輻照防護系統，還包括劑量檢測、監控系統、自動換樣系統、劑量標定設備、樣品定位裝置等（圖2）。該工程實驗室建成后將是一個便捷、高效的輻照育種專用平臺，必將為微生物育種添加有用的利器，服務于我國生物發酵產業。

圖2 甘肅省輻照誘變育種工程實驗室生物育種平臺

工程實驗室另一主要研究內容是從技術和原理上完善重離子束輻照誘變技術，并開展重離子束誘變育種高突變率的機理研究。以制藥、能源、環境微生物為研究對象，探討微生物的突變率、突變譜與重離子的種類、能量、劑量等參數的關系，為制定微生物育種最佳誘變方案提供參考數據，結合基因組、轉錄組測序等方法，探討重離子束誘變機理，為后續研究提供分子生物學基礎。

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The application of heavy ion irradiations for creating promising new strains of industrial microorganisms

CHEN Jihong，HU Wei，LI Wenjian

Institute of Modern Physics, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China

The excellent performance of the industrial microbial strains is important for enterprise to keep a sustainable competitive advantage. Therefore, it is still one of the core content to cultivate new microbial strains of high quality and high yield for the innovation and development of biological breeding industry. As an effective mutation method, heavy ion irradiations have been widely used in biological breeding industry. This paper mainly reviews the molecular mechanism of DNA mutation induced by heavy ion irradiations in living organism, and relative research progress of microbial breeding in China. Meanwhile, the application of special equipment for heavy ion breeding is dicussed.

heavy ion beams; industrial microbial strains; breeding

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.01.007

國家自然科學基金（11605259）