高耐性醬油酵母選育及其高密度發酵調控

陳雄，李欣，王志，代俊

湖北工業大學生物工程與食品學院，發酵工程教育部重點實驗室，工業發酵湖北省協同創新中心，武漢 430068

高耐性醬油酵母選育及其高密度發酵調控

陳雄，李欣，王志，代俊

湖北工業大學生物工程與食品學院，發酵工程教育部重點實驗室，工業發酵湖北省協同創新中心，武漢 430068

陳雄，教授，湖北工業大學生物工程與食品學院副院長，湖北省有突出貢獻中青年專家，湖北省食品安全標準審評委員會委員，湖北工業大學“南湖學者”特聘教授?！渡镔Y源》、《化學與生物工程》雜志編委，曾榮獲“湖北省先進工作者”、“湖北五一勞動獎章”、“湖北師德標兵”、“湖北青年五四獎章”等榮譽。主要研究領域為酵母工程、釀造工程和食品生物技術。主持縱橫向科研項目40余項，發表三大檢索收錄論文30余篇，榮獲國家、省級科技成果獎勵6項，其中國家科技進步二等獎1項，湖北省科技進步一等獎1項。E-mail：cx163_qx@163.com，chenxiong@ mail.hbut.edu.cn

高耐性酵母廣泛應用于食品、釀造、飼料、生物能源等行業，酵母的耐受性對其生產和應用有著決定性影響。高耐性酵母菌種改良是酵母資源利用的關鍵步驟，高密度發酵是克服耐性酵母產業化的主要瓶頸技術。對傳統釀造食品醬油生產中常用的耐高鹽酵母菌株的選育、耐性機制及其高密度發酵技術研究進展進行了綜述。

高耐性醬油酵母；選育；抗逆機制；高密度發酵

酵母是目前唯一年產量超過百萬噸的微生物制品，其應用范圍覆蓋了食品和化學工業、健康產業、基礎生物學、生物醫藥工程和環境工程等多個領域[1]。我國是世界上醬油產銷量最多的國家，2015年產量約1000萬噸，約占世界總產量的65%。在傳統釀造醬油發酵過程中，存在7個屬23個種的耐鹽酵母菌[2]，其中與醬油質量關系最密切的是魯氏酵母、易變球擬酵母、埃契氏球擬酵母和醬醪接合酵母等。在醬油高鹽稀態醬醪發酵過程中，主要使用的耐鹽產香酵母是T酵母（Torulopsis versatilis）、S酵母（Zygosaccharomyces rouxii）和C酵母（Candida versatilis）[3]。魯氏酵母是生產醬油、日本味（miso）和泰國發酵魚制品（plaa-som）等發酵制品的重要菌株[4-5]。作為醬油發酵過程中的主發酵酵母，魯氏酵母參與醬油釀造中后期風味物質形成，可產生乙醇、異戊醇等小分子醇類和甘油、阿拉伯糖醇等糖醇類，以及4-基呋喃酮類等風味成分[6]。球擬酵母是后熟酵母，通過合成4-乙基愈創木酚、4-乙基愈苯酚等酚類物質，賦予醬油主體香味[7]。

1 高耐性醬油酵母選育

魯氏酵母具有典型的酵母菌落形態特征，是最常見的嗜高滲透壓酵母菌。在18%NaCl條件下生長正常，在24%NaCl濃度時仍具有生長能力；能在Aw0.62的果糖溶液以及Aw0.65的葡萄糖/甘油溶液中生長[8]。球擬酵母，多邊芽殖，菌體呈球形、卵形或略長形。在液體培養基中培養時有沉渣及環產生，有時生成菌璞，不形成孢子[9]。

受限于食品工業中對微生物菌種安全的要求，高耐性酵母菌的育種技術主要是基于傳統的方法和原理，如直接篩選、誘變育種和原生質體融合等。耐性釀造酵母天然存在于腌制品（如醬菜、醬類等）、醬油、蜜餞和一些高糖分的水果中，因此基于高效的篩選策略從這些原料中獲取優良菌株是最直接的途徑，而且，能保證菌株的安全性。施安輝[10]在醬菜中分離出一株耐鹽產酯酵母（編號為產酯酵母8號），產乙酸乙酯能力為119.14mg/ dL，在12%～14%NaCl培養基中生長良好。陳雄等[11]利用高通量篩選技術從我國不同地區的不同民間釀造食品中獲得能在24%鹽濃度下生長，且具有0～60%葡萄糖耐受能力的風味魯氏酵母菌株CCTCC M 2013310，可產生苯乙醇、正丁醇等風味物質。

誘變育種是將這些高產菌種經過一些物理（紫外線、等離子、γ射線等）或者化學誘變（氯化鋰、亞硝基胍等）處理后再逆境篩選。實際使用的菌株大多采用此方法選育。王弋博等[12]從天水市秦安縣和甘谷縣鹽堿地分離出的YB-9菌株經紫外線與亞硝酸復合誘變后，得到具有240g/L耐鹽度的YB-9-N1菌株，比出發菌株的耐鹽度提高了84.6%。通過對產酯酵母（Saccharomyces sp.）用紫外線、硫酸二乙酯復合誘變處理和TTC培養基篩選，于同立等[13]共篩選出代謝活力強的菌株385個，通過耐鹽性、嗜熱性實驗，篩選出4株可在7%～13%NaCl和42℃培養條件下，正常生長、繁殖代謝能力強的優良菌株。司曉光等[14]以產丙酮酸的光滑球擬酵母（Torulopsis glabrata）Tp19為出發菌株，采用常壓室溫等離子誘變系統（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）進行誘變，根據CaCO3篩選平板透明圈與菌落直徑比以及100孔板產酸量快速篩選丙酮酸高產突變株。最后通過搖瓶發酵復篩，選育出一株遺傳穩定的突變株A214，丙酮酸產量達到37.43g/L，比出發菌株提高了13.69%。因此，以ARTP技術為代表的新一代高通量誘變篩選技術能快捷安全高效地獲得目標菌株，在高耐性酵母細胞育種中的應用有望逐漸展開。

原生質體融合/雜交技術于20世紀60年代建立，通過將遺傳性狀不同的兩個細胞的原生質體進行融合/雜交以獲得兼有雙親優良遺傳性狀的穩定重組子，現已成為一種常用的微生物育種技術，也是工業酵母選育的有效途徑之一。韓德權等[15]對一株耐鹽性魯氏接合酵母的原生質體化及再生條件進行了實驗研究，發現較好的原生質體化條件為：在1.5mol/L山梨糖醇、細胞壁溶解酶Zymolyase20T濃度為0.5mg/mL（10unit/mL）、0.1mol/L磷酸鉀緩沖液（pH6.0）中，30℃處理60min，魯氏酵母原生質體化率可達99%以上, 再生率達30%以上?；谧贤饩€及甲基磺酸乙酯誘變和原生質體融合技術，通過NaCl梯度逆境篩選，獲得了具有更高耐鹽性的釀酒酵母S3-4菌株，其耐鹽性由100g/L提高到180g/L，可以有效提高乙酸乙酯、乙醇、乳酸乙酯、乙酸等物質的含量[16]。Kim等[17]通過魯氏接合酵母和易變球擬酵母雜交獲得一株能在醬油中產生一些特征性香味化合物的新的雜交種。部分醬油酵母菌種如表1所示。

表1 醬油酵母的選育

2 醬油酵母抗逆機制

作為一種典型的耐性酵母，醬油酵母在細胞和代謝水平上的耐鹽機制被廣泛研究。Watanabe等[18]總結了魯氏酵母耐鹽機制主要有：一是合成胞內滲透壓調節物；二是通過Na+/H+-反向轉運蛋白和Na+-ATP酶，維持胞內陽離子的動態平衡。鹽脅迫下，以甘油為主的多元醇和海藻糖被誘導合成作為魯氏酵母抗滲物；細胞形態維持結構也發生變化，細胞膜麥角固醇的含量和種類發生改變，細胞壁變得更薄，細胞壁幾丁質含量下降，脂類組成也發生變化以降低甘油的滲漏[19-22]。同時，鹽對魯氏酵母的脅迫除表現為胞內積累鈉離子脅迫和滲透壓脅迫外，還會產生次級的氧化脅迫，即產生活性氧（ROS）造成氧化損傷[23]。

很多學者對魯氏酵母耐鹽機理從分子水平進行了研究[24-27]。魯氏酵母耐鹽性是個多基因現象，相關基因主要有ZrSOD2、ZrSOD22、SAT1、HOG1、ZrATP2、ZrPMA1、ZrNHA1和ENA1/PMR2A等。其中，由ZrSOD2編碼的Na+/H+-反向轉運蛋白對魯氏酵母耐鹽性起到非常重要的作用。Iwaki等[24]對ZrSOD2克隆和基因缺失的研究表明，該轉運蛋白依賴質膜上ATP酶產生的跨膜H+梯度，將細胞質內的Na+外排，實現魯氏酵母在高鹽環境中的生長。有趣的是，耐鹽魯氏酵母只有一種類型的序列高度相似、不同等位基因的反向轉運蛋白基因，如Zr-SOD2、ZrSOD22和ZrSOD2-22，其中，ZrSOD2-22存在于魯氏酵母CBS732T，而ZrSOD2和ZrSOD22存在于魯氏酵母ATCC42981，這兩者都能增強釀酒酵母鹽敏感菌株的耐鹽性，但是只有ZrSOD2能在魯氏酵母中轉錄。

相比魯氏酵母，球擬酵母的耐性機制研究較少。Chen等[28]針對莫格球擬酵母從細胞、代謝和酶水平研究了高鹽耐受機理。結果表明酵母細胞發生了多方面的變化以適應高鹽環鏡，如細胞壁增厚、細胞膜飽和度增加、空泡化程度降低、胞內生物相容性物濃度上升及PM-ATPase活力提升等。這些變化有利于維持細胞結構的完整性，降低鈉離子對胞內代謝的毒性。徐沙等基于表達譜芯片技術和二維蛋白電泳等組學技術，研究了光滑球擬酵母（Torulopsis glabrata）在不同鹽濃度下的差異。結果表明高滲會誘導多類基因的表達和蛋白水平提升，特別是細胞壁和細胞膜合成相關基因、中心代謝途徑蛋白和相容性溶質氨基酸合成途徑蛋白[29-30]?？梢?，球擬酵母對鹽逆境的響應是多方面和多層次的過程。

3 醬油酵母高密度發酵調控技術

現代發酵工業中，細胞密度是影響目標產物最終產量的關鍵因素。高密度的細胞數能為發酵生產代謝物提供大量的合成者。隨著分子生物學和遺傳工程的崛起，高密度發酵調控技術研究領域從傳統的菌種篩選、培養基篩選與優化、發酵過程控制、補料策略研究向遺傳特性改造、外源蛋白改造等方面擴展。對于食品工業中的酵母，為保證安全性，通過分子手段改造以達到細胞高密度生長的方法受到嚴格限制，因此，發酵調控技術依然是現在的主要手段。高密度發酵調控技術的關鍵是細胞代謝流的再分配，即通過過程調控和補料策略強化細胞繁殖相關代謝的通量（圖1）。

圖1 微生物細胞高密度發酵調控

酵母高密度發酵技術最初是為了解決釀酒酵母活細胞數低的問題，現已取得巨大成功。目前，工廠規模的釀酒酵母濕重一般為180～200g/L。醬油活性干酵母能有效提升醬油生產效率[31-32]。相比釀酒酵母和畢赤酵母，醬油酵母的高密度發酵技術長期得不到足夠的關注，其活性干酵母的高效生產與制備受到極大的限制，嚴重影響了其在醬油釀造中的生產應用。筆者團隊針對高耐性醬油酵母發酵強度低的問題，研究了魯氏酵母發酵培養基，優化了10L發酵罐發酵參數，并整合營養條件-過程控制-指數流加策略，有效控制了代謝副產物的生成并提升了營養物向生物量轉化效率，最終建立了高耐受性酵母高密度發酵過程[33-35]。在搖瓶階段，魯氏酵母活菌數超過100億，比已報道的文獻[36]提高近10倍；10L機械攪拌通風發酵罐，最大生物量超過70g/L（干重）[35]。更重要的是，該酵母的耐鹽能力在高密度繁殖后沒有降低，為大規模生產應用奠定了良好的基礎。

4 展 望

隨著人們生活質量的提高，傳統釀造食品正處于技術升級的新階段。優良的耐逆境酵母菌株能有效提升醬油生產效率和產品品質及風味，高耐性酵母的高密度發酵技術是體現經濟效益和工作效率的關鍵。因此，基于新技術誘變篩選高品質醬油酵母及其高密度細胞發酵技術將為釀造食品的升級換代提供堅實的基礎。

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Breeding and high density fermentation control research of high tolerance soy sauce yeast

CHEN Xiong，LI Xin，WANG Zhi，DAI Jun

Key Laboratory of Fermentation Engineering (Education Ministry), Hubei Collaborative Innovation Center for Industrial Fermentation, Bioengineering and Food Science College, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China

High tolerance yeast is widely used in many industries, especially in food, brewing, feed, and bio-energy f eld. The tolerance capability of yeast has a decisive inf uence on its production and application. The improvement of yeast strains is the key step in the utilization of yeast resources, and high density fermentation technology is the main bottle-neck for the yeast industrialization. In this paper, the breeding, tolerance mechanism, and high density fermentation of the halophilic yeast strains used in the traditional brewing food soy sauce are reviewed.

soy sauce yeast; breeding; resistant mechanism; high density fermentation

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.01.011

湖北省自然科學基金重點項目（2012FFA058）