野生白芨再生體系的建立及抗性篩選

余磊磊+周京龍+高中南

摘要：建立白芨的再生體系和優化抗性篩選的最佳條件，為野生白芨高效遺傳轉化體系的建立奠定基礎。以野生白芨種子為外植體，研究野生白芨種子在萌發、愈傷組織誘導、叢生芽分化和增殖以及不定根誘導的最佳培養基，并利用梯度篩選出其對卡那霉素（Kan）和氨芐青霉素（Amp） 的抗性。種子萌發最佳培養基為1/2MS+0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+100 g/L 馬鈴薯；不定芽分化最佳培養基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+8 mg/L硝酸銀+50 g/L馬鈴薯，誘導率高達95%；誘導生根最佳培養基為1/2MS+0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+100g/L 馬鈴薯。100 mg/L Kan和100 mg/L Amp為野生白芨遺傳轉化的最佳篩選壓；培養過程中添加外源有機物可以有效地促進愈傷組織和不定芽的分化與增殖。建立了野生白芨種子的再生體系，發現了野生白芨種子的第3條發育途徑——愈傷組織分化途徑，并篩選出了適宜于野生白芨遺傳轉化體系的Kan和Amp篩選壓。

關鍵詞：白芨；愈傷組織分化途徑；再生體系；抗性篩選

中圖分類號：S567.23+9.043 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2017）01-0043-04

白芨為蘭科（Orchidaceae）白芨屬（Bletilla）多年生草本植物。因其花色和形狀等形態的不同，又被分為黃花白芨（B. ochracea）、華白芨（B. sinensis）、小白芨（B. formosana）和白芨（B. striata）4種[1]。在我國白芨主要分布于長江流域地區，其獨特的藥用價值，使其遭遇多年的掠奪式采挖，野生資源日益減少，瀕臨滅絕邊緣，現已被國家列為重點保護的野生藥用植物資源。白芨果莢內種子多呈紡錘形，僅僅由幾個發育不完全的胚細胞構成，無胚乳，無貯藏的營養物質供給種子萌芽[2]，因而其在自然條件下萌發率極低。構建其再生體系，可以初步有效解決育苗難題。白芨屬植物因其花色艷麗多彩，花型引人注目而具有較高觀賞價值和經濟價值，其地下假鱗莖中含有的白芨膠具有收斂止血、清熱解毒、消腫生肌之功效[3]，同時還具有較強的抗氧化和抗衰老作用，可用于保健、護膚及美容養顏等[4-5]。而野生白芨資源本身稀缺，加之含有的藥用成分白芨膠較少，野生采挖的白芨假鱗莖根本無法滿足目前的提取需求?，F有的研究大多集中在其再生體系的建立上，很少通過生物技術增加白芨膠的含量，因此要以白芨種子為基礎，篩選出葉芽對卡那霉素（Kan）、氨芐青霉素（Amp）的抗性臨界點，通過基因工程途徑構建其遺傳轉化體系，培育白芨膠含量更高的白芨品種。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

白芨蒴果采自湖北神龍架林區，蒴果采期為花期結束后約120 d，蒴果未開裂且內部白芨種子成熟。

1.2 蒴果消毒及種子萌芽

將果莢用自來水沖洗10 min，在超凈工作臺上先用75%乙醇消毒30 s，再用4%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，消毒期間不停地翻動果莢，使其消毒徹底，無菌水漂洗3次，然后用無菌濾紙吸干果莢表面的水分待用。在無菌條件下剖開蒴果，將種子均勻地抖落到培養基表面。本實驗室篩選的白芨種子萌芽培養基：1/2MS+0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA（pH值5.8），然后置于溫度為（25±2） ℃的恒溫培養室中培養[6]，前2周為暗培養，2周之后轉為光暗交替培養，光照度為2 000～2 500 lx，光—暗周期14 h—10 h。

1.3 白芨愈傷組織的誘導

愈傷組織的形成有2種方式，一是在種子萌發培養基中，有部分種胚直接發育形成愈傷組織。二是將培養60 d的野生白芨的無菌幼苗切去根部和子葉，留下原球莖或者根狀莖，切成0.3～0.5 cm2 小塊，用不同質量濃度的細胞分裂素6-BA與生長素NAA組合誘導形成愈傷組織，愈傷誘導培養基在預試驗的基礎上設計如下：（1） 1/2MS+0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+2 mg/L硝酸銀+50 g/L馬鈴薯；（2） 1/2MS+0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+4 mg/L硝酸銀+50 g/L馬鈴薯；（3）1/2MS+0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+6 mg/L硝酸銀+100 g/L馬鈴薯；（4）1/2MS+0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+8 mg/L硝酸銀+100 g/L馬鈴薯；所有培養基的pH值均為5.8，愈傷組織的誘導在黑暗條件下進行。

1.4 白芨不定芽的分化誘導

當愈傷組織長到約1 cm3左右，可進行叢生芽的誘導。叢生芽的誘導培養基在預試驗的基礎上設計如下：（1）MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA；（2）MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+4 mg/L硝酸銀；（3）MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+8 mg/L硝酸銀；（4）MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+12 mg/L硝酸銀；（5）MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+8 mg/L硝酸銀+50 g/L馬鈴薯；（6）MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+8 mg/L硝酸銀+100 g/L馬鈴薯；（7）MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+8 mg/L硝酸銀+200 g/L馬鈴薯；所有培養基的pH值均為5.8，不定芽的分化誘導在光照條件下進行，光照度為2 000～2 500 lx。

1.5 白芨的生根培養

待叢生芽長到2～3 cm 時切下，放置在下列培養基進行生根誘導：（1）1/2MS+2.0 mg/L NAA；（2）1/2MS+1.5 mg/L NAA；（3）1/2MS+1.0 mg/L NAA；（4）1/2MS+0.5 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA；（5）1/2MS+0.5 mg/L NAA+50 g/L 馬鈴薯；（6）1/2MS+0.5 mg/L NAA+100 g/L 馬鈴薯；共6種不同的培養基進行誘導生根，所有培養基的pH值均為58。在光暗交替下進行誘導生根，光照度為2 000～2 500 lx，光—暗周期14 h—10 h。

1.6 培養條件的優化

由于野生白芨種子為不完全結構，其種子中僅有胚，而不含有胚乳，且種子表面被1層透明的種皮包被，使得外源營養物質很難進入到種皮內，因此對于幾乎沒有營養物質貯藏的野生白芨種子來說，添加其他物質于培養基中就可能會有助于其愈傷組織的分化增殖和防止褐化現象。本試驗以最佳芽誘導培養基為基礎添加以下物質，外源有機物馬鈴薯過濾液：10、50、100 g/L；硝酸銀：4、6、8、10 mg/L；活性炭0.8 g/L。

1.7 野生白芨對抗生素敏感性的測定

將白芨愈傷組織切成 0.5 cm3左右的小塊，分別放置到不同濃度氨芐青霉素（Amp）和卡那霉素（Kan）的再生培養基1/2MS+3% Surcose+0.3% Phytagel+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+100 g/L馬鈴薯上，觀察不同濃度的Amp和Kan對白芨愈傷組織誘導和分化的影響，以確定最優的篩選壓，篩選出適宜的濃度用于遺傳轉化。Amp的濃度梯度為0、20、50、100、150 mg/L，Kan的濃度梯度為0、25、50、75、100、125、150 mg/L，培養30 d 后統計篩選的效果。

2 結果與分析

2.1 種子的有胚率分析

成熟野生白芨的果莢顏色為黃褐色，野生白芨種子的結構，多呈紡錘形，由1層透明的種皮和乳白色的胚組成，且無胚乳，幾乎沒有營養物質的貯藏[6]，有些種子顯微鏡下觀察還可以發現其殘留的胚柄，而且經試驗統計發現有一些種子只有種皮而沒有胚，這是因為采自神龍架林區的的野生白芨果莢未完全成熟所致，這與張建霞等報道的白芨種子的胚齡為20 周（140 d）后，胚基本停止發育，有胚率不再明顯提高，而胚的成熟度達到最佳[7]基本一致。在組織培養條件下培養7 d后，含有胚的種子會逐漸膨大且轉為綠色。顯微觀察和統計結果（表1）表明，本次試驗所用野生白芨種子的有胚率為57.5%。

2.2 野生白芨種子發育情況分析

白芨種胚如圖1所示，主要以2種途徑發育成小苗，第1種是種胚轉綠膨大形成小球體，進而發育成原球莖；第2種是種胚膨大形成小球體，小球體先形成根狀莖，然后頂端逐漸轉綠分化出芽， 形成葉片[8]。本試驗發現野生白芨種胚在培養基上，還存在除了張燕等報道的2種主要的發育途徑[5]以外的第3種次要發育途徑：由種胚直接發育為淡綠色的愈傷組織，而后不斷增殖，發育為叢生芽，進而生長成完整植株。試驗初步推測愈傷組織發育途徑可能與培養基中的外源添加有機物和種子的呼吸作用有關，其發生機理有待進一步研究。對所有試驗中種胚的發生情況進行統計分析，在基本培養基相同且馬鈴薯的含量都為100 g/L的情況下，當硝酸銀的含量為6、8 mg/L時，種胚的愈傷組織為濃綠色（圖2），其愈傷組織發育率分別為26.0%和22.8%（表1），表明6 mg/L的硝酸銀是種胚愈傷組織發育的最佳含量，且當硝酸銀含量在6 mg/L以下時，其種胚的愈傷組織發育率與硝酸銀的含量呈正相關。由表1可知種胚的愈傷組織發育率和馬鈴薯的含量呈正相關。

2.3 不同激素濃度對野生白芨叢生芽的誘導

試驗結果（表2）表明不定芽的誘導率最高的培養基為A3培養基（MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+ 8 mg/L 硝酸銀+50 g/L馬鈴薯），其誘導率高達95%，增殖系數為324，誘導的叢生芽較多，呈濃綠色，較粗壯，但生長緩慢，有褐化現象出現。而A4培養基（MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+10 mg/L硝酸銀+100 g/L馬鈴薯）中不定芽的誘導率為85%，叢生芽增殖系數最高，為6.03，誘導的叢生芽，多為青綠色，生長較快且很粗壯，較少有玻璃化現象出現（圖3）。A1培養基（MS+0.2 mg/L 6-BA+1.5mg/L NAA+4 mg/L硝酸銀+50 g/L馬鈴薯）和A2培養基（MS+0.5mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+6 mg/L硝酸銀+100 g/L馬鈴薯）的分化效率和增殖系數較低，誘導率分別為22.5%和67.5%，增殖系數分別為2.12和3.11，且玻璃化現象和褐化現象嚴重。統計分析可知，A4培養基雖然叢生芽誘導率未達到最高，為85%，但其增殖系數高達6.03，可有效誘導葉芽分化和增殖，能更好地滿足植物基因工程研究的需要。

在野生白芨無菌苗的根狀莖上進行間接愈傷組織誘導發現，青綠色的愈傷組織質地較緊密，可誘導分化出粗壯的叢生芽， 且分化效率更高（圖4）。由表2數據分析可知，愈傷組織的分化誘導率和叢生芽的增殖系數與NAA的濃度、6-BA/NAA的濃度配比以及外源有機物馬鈴薯的含量呈正相關，在硝酸銀濃度不超過8 mg/L時，愈傷組織的分化誘導率和叢生芽的增殖系數會隨著其濃度的增加而提高，但當硝酸銀的濃度為10 mg/L時，其愈傷組織的分化誘導率出現下降，說明過高的硝酸銀濃度不利于其愈傷組織的誘導分化。外源有機物可以有效提高其叢生芽的增殖系數，有利于芽的生長[9]。

2.4 不定根的誘導

不定根的誘導對于植株再生體系的建立至關重要[10]，在本研究中采用的4種生根培養基中，B4培養基（1/2MS+0.8 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+100 g/L 馬鈴薯）為最佳誘導生根培養基，其不定根誘導率高達97.5%，不定根發生密集，生長速度快且粗壯，為白色或者綠色（圖5）。B1培養基（1/2MS+1.0 mg/L NAA+50 g/L 馬鈴薯）的誘導率較高，為85%，但其不定根的發生量較少。其他2種培養基B2和B3也能有效誘導不定根的分化，但也存在不定根較瘦弱的不足。經分析發現，NAA可以有效促進不定根的誘導和分化，對不定根的生長有著決定性的作用，而細胞分裂6-BA會極大抑制不定根的發生。而添加了馬鈴薯的培養基中不定根生長更為健壯，且生長速度更快，說明馬鈴薯可以提高不定根的誘導效率（表3）。

2.5 Kan 和Amp 抗性濃度的篩選

將葉芽分別置于含有不同濃度Kan和Amp的MS+05 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+100 g/L馬鈴薯培養基上培養40 d 后觀察致死率（圖6、圖7），葉芽的致死率與Amp和Kan的濃度都成反比，當Amp濃度為20 mg/L，其致死率僅為122%， 分化率高達 87.8%； 當Amp濃度增加到 150 mg/L時，其致死率高達99.2%，分化率僅為0.6%（表4）。綜合試驗的其他因素考慮，100 mg/L的Amp和100 mg/L的Kan是最佳的抗性濃度。

3 討論

野生白芨為蘭科植物，其種子發育不完整，且種子表面包被1層種皮，對于僅有種胚的種子的發芽是極大的障礙，這也使得野生白芨種子很難在自然條件下發芽。而合適的培養基和培養環境便成了其萌發的關鍵。在本試驗采用的培養基中，發現了野生白芨種胚發生的第3條途徑——愈傷組織途徑。對于野生白芨種胚直接從種子發育成愈傷組織的現象，初步猜想可能是以下原因造成的：（1）種子的不完全胚被種皮限制，種胚無法進行正常生長；（2）由于采收的種子中種胚的發育程度和成熟度不一致，導致部分種子不能提供種胚正常發育的營養物質。這也正好可以解釋白芨在野外自然條件下萌發率不足萬分之一，但是其愈傷組織途徑的發生機理還有待更進一步的研究。

蘭科植物的整個生活史中均有共生菌參與其中，這種生長的特異性也使得蘭科植物組織培養過程的各個階段都需要外源有機物。在野生白芨的再生體系中，馬鈴薯過濾液對野生白芨種子再生體系各個階段的生長都有著極大的促進作用，在培養基中添加100 g/L的馬鈴薯過濾液等外源有機物和硝酸銀等可以極大促進愈傷組織的分化和叢生芽的增殖，從而為野生白芨的再生體系建立更為優越的條件。

在本研究中成功篩選出野生白芨的葉芽對 Kan和Amp 抗性的濃度分別為100 mg/L 和100 mg/L。本研究結果為野生白芨應用于植物基因工程，尤其是為培育白芨膠含量更高的優質白芨品種提供了參考。

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