黃鱔醛酮還原酶的羰基解毒作用初探

代海艷+江翱+李偉

摘要：醛酮還原酶（aldo-keto reductase，AKR）是機體依賴NAD（P）H的一類重要的氧化還原酶，在細胞有毒羰基化合物代謝中具有重要作用。迄今為止，國內外尚無魚類醛酮還原酶基因及其功能的報道。為了解魚類醛酮還原酶在細胞抗有毒羰基化合物脅迫過程中的作用，筆者比較了含重組黃鱔AKR基因的陽性菌株和不含該重組基因的陰性對照在丙酮醛及2，3-丁二酮2種羰基化合物處理后的存活率。結果表明，隨著毒性物質處理時間的延長和處理濃度的升高，陽性菌株和對照菌株存活率均呈逐漸下降趨勢；陽性菌株的存活率始終極顯著高于對照菌株（P<0.01）。結果提示，黃鱔的醛酮還原酶具有一定的羰基解毒作用。該研究為進一步深入了解魚類AKR基因的功能提供了基礎資料。

關鍵詞：黃鱔；醛酮還原酶；羰基脅迫；存活率；解毒作用

中圖分類號：S941.91 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）01-0150-03

醛酮還原酶（aldo-keto reductase，AKRs）超家族是一類廣泛存在依賴于NAD（P）H的氧化還原酶[1]。生物體內氧化應激[2]、致癌化合物降解[3]、糖尿病并發癥及腫瘤發生[4]等過程都有AKRs的參與。細胞內存在低濃度的羰基化合物如不能被及時降解，就會通過羰基化修飾使細胞內的蛋白質、核酸等生物大分子發生構象變化和功能喪失，并最終導致細胞代謝紊亂，引起癌變或壞死，這就是所謂的“羰基脅迫”[5]。醛酮還原酶可以將對細胞毒害較強的羰基化合物還原成相應的對細胞毒害作用較小或無毒性的醇類物質，承擔機體防護酶的作用[6]。研究表明，大腸桿菌[7]及藍藻[8]的AKR基因產物可有效降解丙酮醛、甘油醛等羰基化合物對細胞的毒害作用。植物的AKRs分子參與植物各種各樣的逆境脅迫反應，是植物防御系統中不可或缺的部分[9]。人類的AKR1B10基因轉化到293T細胞中后，可有效降低不飽和羰基對細胞的毒害作用[10]。老鼠的AKR7A1基因在中國倉鼠V79-4細胞中的表達也可提高細胞對丙烯醛和HNE的抵抗力[11]。這些試驗結果表明，生理狀態下的醛酮還原酶對細胞毒性羰基物質具有解毒功能。

盡管有關于高等脊椎動物、細菌和植物的醛酮還原酶分子的研究眾多，但人們對于魚類的醛酮還原酶基因及其功能卻知之甚少。苯并芘（BaP）處理羅非魚可顯著提高其肝組織醛酮還原酶AKR1A1基因的大量表達，該研究結果提示羅非魚的AKR1A1分子可能在BaP解毒過程中具有重要的作用[12]。在前期的研究中，筆者所在實驗室克隆了黃鱔肝臟醛酮還原酶基因并構建了其原核表達載體。為進一步分析黃鱔醛酮還原酶在細胞抗羰基脅迫中的作用，筆者對比了含有重組黃鱔醛酮還原酶基因和不含該基因的大腸桿菌在受到丙酮醛和2，3-丁二酮等有毒羰基化合物脅迫后的存活率，分析了羰基化合物處理時間和濃度差異對細胞毒性的影響。這為深入了解魚類的醛酮還原酶的羰基解毒作用和功能提供了重要參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株和試劑

含pET-28a-EakR1重組質粒的BL21（DE3）菌株和含pET-28a空白質粒的BL21（DE3）菌株，由長江大學生物醫藥研究所保存；丙酮醛和2，3丁二酮，購買于Aladdin公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 菌株活化及誘導表達檢測

將重組陽性菌株和對照菌在含50 μg/mL Kan的LB平板上劃線，在37 ℃過夜培養。挑取于單克隆LB液體培養基中，在37 ℃、250 r/min恒溫搖床上培養4 h后，加入終濃度為 0.1 mmol/L 的IPTG，誘導培養3 h，取適量菌液用12%的 SDS-PAGE電泳檢測。

1.3 羰基化合物濃度大小對大腸桿菌存活率的影響

挑取陽性重組菌單克隆于6 mL含50 μg/mL Kan的LB液體培養基中，37 ℃、250 r/min培養3 h后，加入終濃度為 0.5 mmol/L 的IPTG，繼續誘導表達1 h。將誘導培養液分裝至6只EP管中，然后在EP管中加入丙酮醛（或2，3-丁二酮），使其終濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L，進一步在37 ℃靜置1 h。離心收集菌體，滅菌水洗滌3次后用1 mL新鮮液體LB重懸。取10 μL菌液進行101、102、103、104、105、106…倍梯度稀釋。取稀釋后的系列菌液50 μL涂布在含Kana的LB平板上后于37 ℃培養箱中恒溫培養12 h。選擇菌落數在100～500的平板，用Shineso公司的平板菌落計數儀進行菌落計數，根據相應稀釋倍數推算稀釋前的總菌落個數。計算出不同濃度丙酮醛（或2，3-丁二酮）處理后大腸桿菌的存活率（SC）。對照菌同樣處理，重復3次。

SC=各濃度丙酮醛（2，3-丁二酮）處理后的總菌落個數不添加丙酮醛（2，3-丁二酮）處理的總菌落個數×100%。

1.4 羰基化合物處理時間長短對大腸桿菌存活率的影響

按照“1.3”節進行重組菌株誘導培養。誘導后的菌液中加入終濃度為2 mmol/L的丙酮醛（或2，3-丁二酮），分別在37 ℃靜置培養0、10、20、30、40、50、60 min。每個時間點取出菌液0.1 mL，離心收集菌體并進行梯度稀釋。稀釋后的菌液取50 μL涂布在含Kana的LB平板上后于37 ℃培養箱中恒溫培養12 h。選擇菌落數在100～500的平板，用Shineso公司的平板菌落計數儀進行菌落計數，根據相應稀釋倍數推算稀釋前的總菌落個數。計算出丙酮醛（或2，3-丁二酮）處理不同時間大腸桿菌的存活率（ST）。對照菌同樣處理，重復3次。

ST=丙酮醛（2，3-丁二酮）處理不同時間后的總菌落個數不添加丙酮醛（2，3-丁二酮）處理的總菌落個數×100%。

1.5 數據處理和分析

數據處理采用SPSS 20.0軟件中的單因素方差分析（A-NOVA）進行，存活率結果用 x±s表示，并進行Duncans多重比較檢驗。當P<0.05時為差異顯著，當P<0.01時差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 SDS-PAGE檢測誘導表達結果

由圖1可知，相對于陽性重組質粒，空白質粒菌株在用IPTG誘導前后均沒有表達外源蛋白；而含有EakR1的重組菌株用IPTG誘導后與未誘導相比明顯表達了EakR1。EakR1分子量大約為37 ku，與醛酮還原酶理論分子量大小相符。這說明黃鱔AKR基因可以實現在大腸桿菌BL21（DE3）中的融合表達。

2.3 羰基化合物濃度大小對大腸桿菌存活率的影響結果

由圖2可知，丙酮醛的處理對大腸桿菌細胞有著極強的毒害作用；隨著丙酮醛濃度升高，2組大腸桿菌的存活率都極顯著下降。當培養環境中丙酮醛濃度達到2.5 mmol/L時，陰性對照菌株的存活率極低（10-3%～10-4%），而陽性重組菌株的存活率（約1%）與陰性對照相比有極顯著提高，約為陰性對照菌株存活率1 000～10 000倍。

由圖3可知，2，3-丁二酮處理對大腸桿菌細胞也有較強毒害作用，但效果比丙酮醛低得多。隨著2， 3-丁二酮濃度升高，2組大腸桿菌菌株存活率也出現明顯降低。當培養基

中2，3-丁二酮的濃度達到2.5 mmol/L時，陰性對照菌株的存活率只有約5%，而陽性重組菌株存活率達到44%，約為空質粒對照菌株存活率的9倍。

2.5 羰基化合物處理時間長短對大腸桿菌存活率的影響結果

由圖4可知，當與2 mmol/L丙酮醛共同培養時，隨著時間延伸，陽性重組菌及對照菌株的存活率都呈逐漸下降的趨勢；且丙酮醛對陰性對照菌株的毒害作用要明顯高于陽性重組菌株。當處理時間達到60 min時，陰性對照菌株的存活率約為10-3%，而重組菌株的存活率約為1.4%，約為對照菌株的 1 400 倍。

相似地，如圖5可知，2，3-丁二酮對細胞的毒害作用要低于丙酮醛，隨著處理時間延長，2組菌株的存活率也呈下降趨勢；當處理時間達到60 min時，陰性對照菌株的存活率約為6.8%，而陽性重組菌株的存活率約為55.8%，約為對照菌株的8倍。

3 討論

醛酮還原酶在自然界分布廣泛且結構相對保守；具有多樣化的功能，可能參與了細胞內各種各樣羰基化合物的代謝作用[1]。作為羥化類固醇脫氫酶（HSD），它們參與了高等哺乳動物的類固醇代謝平衡調節和致病過程[13]；作為醛糖還原酶，它們與多種慢性疾病或并發癥的發生發展密切相關[14]；作為酮還原酶或醛還原酶，它們是機體細胞外源性或內源性毒性物質代謝的重要分子[15]。盡管不同來源的醛酮還原酶具有相類似的（α/β）8桶裝二級結構和催化四分體氨基酸，它們在底物識別和催化機理上還是存在非常大的差異[16]。作為醛酮還原酶超級家族中一個新的成員，黃鱔醛酮還原酶的功能有待深入研究。

甘油醛是細胞甘油代謝途徑產生的對細胞有高毒性的化合物，它可修飾或改變細胞內大分子化合物的構象及功能[17]?，F有研究表明，大多數細胞的甘油醛解毒作用是通過Ⅰ型和Ⅱ型乙二醛酶的轉化來實現的[18]；越來越多的試驗也證實醛酮還原酶可將甘油醛轉化為低毒的丙酮醇以實現解毒作用，是細胞抗羰基脅迫的重要分子。細菌的醛酮還原酶分子在體內對甘油醛具有明顯的降解作用[19-20]，低等的藍藻也對醛酮還原酶降解丙酮醛有較強的依賴作用[8]。

筆者研究表明，丙酮醛和2，3-丁二酮等羰基化合物對大腸桿菌的生長均具有較強的毒害作用；且丙酮醛的毒害作用遠大于2，3-丁二酮，其對大腸桿菌致死率約為2，3-丁二酮的6 000倍。重組黃鱔EakR1的菌株能夠顯著提高細菌抵抗羰基化合物毒害作用的能力。其中，在丙酮醛脅迫試驗中能夠將大腸桿菌的存活率提高1 000～10 000倍；在2，3-丁二酮脅迫試驗中能夠將大腸桿菌的存活率提高約9倍。表明，黃鱔EakR1基因在大腸桿菌中的表達產物能夠有效降解丙酮醛和2，3-丁二酮等有毒羰基化合物，起到保護酶的作用。當然，目前對于醛酮還原酶在黃鱔羰基化合物脅迫和其他生理過程中的具體作用和機制尚不可知，需要進一步深入研究。該試驗結果為人們深入了解魚類醛酮還原酶的功能并應用于魚類養殖實踐提供了基礎資料。

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