高溫和低溫條件下琥珀蠶血淋巴SOD及CAT活性的變化

楊偉克+唐芬芬+劉增虎

摘要：為研究琥珀蠶在高溫和低溫脅迫條件下，血淋巴超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）的活性變化規律。對5齡琥珀蠶第3天幼蟲分別進行38 ℃高溫和4 ℃低溫脅迫處理3 h，以室溫26 ℃飼養作對照，在處理停止后0、3、6、9、12 h取血淋巴，測定SOD和CAT的活性變化。結果表明：38 ℃高溫處理，引起琥珀蠶血淋巴SOD和CAT活性均呈現出先升高后降低趨勢，在處理停止后3 h分別達到1個峰值86.30 U/mL和108.15 U/mL，隨后逐漸減弱，最終與對照組持平。4 ℃低溫脅迫，SOD活性也是在處理停止后3 h出現1個峰值59.30 U/mL，隨即開始逐漸減弱，在12 h接近對照組；而CAT酶活性先下降，并低于對照，在3 h出現1個最低值11.09 U/mL，隨后開始升高，在6 h達到1個峰值88.68 U/mL，隨后再逐漸下降并接近對照。

關鍵詞：琥珀蠶；血淋巴；低溫處理；高溫處理；超氧化物歧化酶；過氧化氫酶

中圖分類號：S885.9；S881.2+1 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2017）01-0153-02

琥珀蠶（Antheraea assamensis）屬鱗翅目（Lepidoptera）大蠶蛾科（Saturniidae）柞蠶屬（Antheraea）的絹絲昆蟲，是一種珍貴的野蠶資源，主要分布在印度東北部和印緬邊境地區，印度人稱其為姆珈蠶（muga silkworm）[1-2]。在印度，琥珀蠶未被完全馴化，目前還不能完全在室內飼養，只能在野外放養[3]。云南省農業科學院蠶桑蜜蜂研究所于2006年在云南發現琥珀蠶，并對云南野生琥珀蠶進行人工馴化飼養，經過幾年的探索，成功實現了琥珀蠶的室內馴化飼養，并對其形態特征、生物學特性及人工馴養關鍵技術作了相應的研究[4]。

目前對琥珀蠶的研究主要集中在生物學特征、飼養技術及繭絲性能和蠶絲蛋白等方面，至今還未見有關逆境條件下，琥珀蠶保護酶活性變化及生理生化特性的研究報道。本研究人工模擬逆境環境，對琥珀蠶5齡第3天幼蟲分別進行高溫和低溫處理，測定其在高溫和低溫條件下SOD和CAT的活性變化，解析高溫和低溫對琥珀蠶生理生化影響的內在機理，為后續培育琥珀蠶抗逆新品種提供生理生化鑒定參考指標。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

琥珀蠶幼蟲，由云南省農業科學院蠶桑蜜蜂研究所提供，在室內26 ℃飼養至5齡第3天。

1.2 試驗方法

試驗分為3組；高溫處理組、低溫處理組與對照組。選擇體型大小相近的5齡第3天琥珀蠶幼蟲，分別置于38 ℃高溫和4 ℃低溫條件下沖擊3 h，以室溫26 ℃正常飼養為對照。

取樣方法：分別取高溫和低溫沖擊后0、3、6、9、12 h琥珀蠶幼蟲，用脫脂棉蘸取75%乙醇進行體表消毒、晾干，冰上取已用75%乙醇消毒過的2號昆蟲針刺其腹足，擠壓蟲體使血淋巴流出，收集到預先加有苯基硫脲的5 mL離心管中，4 ℃條件下，8 000 r/min離心5～8 min，收集上清液，用于酶活測定。每5頭蠶的血淋巴收集到1個離心管為1個重復，每次取樣均設3個重復，對照組同時取材。

1.3 主要試劑及儀器

SOD測試盒和CAT測試盒（江蘇南京建成生物科技有限公司）；冰醋酸（上海聯試化工）；Thermo Scientific BioMate 3S紫外可見分光光度計（美國）。

1.4 血淋巴保護酶活性測定

1.4.1 超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定 按照SOD測定試劑盒操作。其原理是通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統產生超氧陰離子自由基（O-2· ），后者經氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現紫紅色，用可見分光光度計于波長550 nm處測其吸光度。當被測樣品中含SOD時，則對超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時測定管的吸光度低于對照管的吸光度，通過公式計算可求出被測樣品中的SOD活力。酶活定義：1 mL反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為1個SOD活力單位（U）。計算公式：總SOD活力（U/mL）=（D1-D2）÷D1÷50%×反應體系稀釋倍數×樣本測試前的稀釋倍數。式中：D1指對照管的吸光度；D2指測定管的吸光度。

1.4.2 過氧化氫酶（CAT）活性的測定 參照CAT測定試劑盒操作。其原理是：過氧化氫酶（CAT）能分解H2O2生成H2O和O2，反應可通過加入鉬酸銨而迅速中止，剩余H2O2與鉬酸銨作用產生一種淡黃色的絡合物，在405 nm處測定其變化量，可計算CAT活力。酶活定義：1 mL樣品1 s分解 1 μmol H2O2的量為1個活力單位。計算公式：樣品CAT活力（U/mL）=（D1-D2）×271×[1/（60×取樣量）]×樣本測試前稀釋倍數。式中：D1指對照管的吸光度；D2指測定管的吸光度；271為斜率的倒數；60為反應時間60 s。

1.4.3 數據處理及分析 采用Excel 2003進行數據處理及作圖，同時利用SPSS 13.0進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 高溫和低溫處理琥珀蠶血淋巴SOD活性變化

經高溫38 ℃和低溫4 ℃處理后，在測定的時間范圍內，與對照組相比，琥珀蠶血淋巴SOD活性均是先升高，在3 h達到1個峰值，隨后逐漸減弱。其中38 ℃高溫處理停止后，SOD活性上升較快，上升幅度也比較大；而低溫4 ℃處理停止后，SOD活性上升幅度相對較弱（圖1）。

2.2 高溫和低溫處理琥珀蠶血淋巴CAT活性變化

由圖2可以看出，高溫38 ℃和低溫4 ℃均能引起琥珀蠶血淋巴過氧化氫酶CAT活性升高。其中38 ℃高溫處理停止后，CAT酶活性在3 h達到1個峰值（最高值達到 108.15 U/mL），隨后開始逐漸減弱，在12 h接近對照。而 4 ℃ 低溫處理停止后，CAT酶活性在3 h出現降低，并低于對照，隨后開始逐漸升高，在6 h達到1個峰值（最高值 88.68 U/mL），然后再逐漸降低至接近對照。

3 結論與討論

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）是昆蟲體內重要的2種保護酶[5]，兩者在維護生物體內自由基代謝平衡過程中發揮了重要的作用，并在一定程度上影響生物的抗逆能力[6-7]。CAT的主要功能是參與活性氧代謝過程，它可以催化H2O2分解為H2O和O2，避免羥自由基的產生，防止其進一步氧化而破壞生物大分子[8]。SOD能催化超氧陰離子自由基發生歧化反應，將其歧化為H2O2和O2，H2O2再經過CAT作用轉化為水和氧氣，從而達到清除超氧陰離子自由基的目的，維持細胞和機體的正常生理活動[9]。

在對家蠶和柞蠶等的研究表明，高溫或低溫脅迫均能引起蠶體自由基的過量積累，而蠶體內的SOD和CAT在清除自由基過程中發揮了重要作用[10-12]。夏潤璽等測定了低溫和高溫條件下，柞蠶血淋巴CAT活性變化，研究結果表明，4 ℃ 低溫處理柞蠶，其血淋巴CAT活性先下降，然后持續升高，并高于對照，處理時間越長，CAT上升幅度越大；用高溫40、43、46 ℃分別處理柞蠶幼蟲，均能引起柞蠶血淋巴CAT活性升高[10-11]。袁燕萍等比較了高溫36 ℃沖擊對家蠶抗氧化酶活性的影響，結果表明，高溫沖擊48～72 h，5齡家蠶幼蟲中腸組織SOD和CAT活性均有一定程度的升高，并且隨沖擊時間的的延長其活性顯著增加[12]。另外，吳蕾等研究了溫度、光照周期和光照波長等環境因子對農業害蟲西藏飛蝗抗氧化酶活性的影響，結果表明，在低溫處理下，SOD和CAT活性隨溫度的降低均出現升高趨勢，在5 ℃條件下，均顯著高于對照；在高溫脅迫下，各部位的SOD和CAT活性均呈現先升高后降低的現象，超過35 ℃后兩者的活性呈現下降趨勢，當溫度升高到45 ℃時，SOD和CAT活性均低于對照[13]。

室內飼養琥珀蠶幼蟲的最適溫度為26～32 ℃，溫度過高或過低均不利于琥珀蠶幼蟲的生長發育，甚至造成死亡[14]。本研究結果表明，琥珀蠶在38 ℃高溫處理停止后，相對于 26 ℃ 飼養的對照組，SOD和CAT活性均呈現出先升高的趨勢，達到1個峰值，隨后逐漸減弱，最終與對照組持平。在測定的時間范圍內，SOD與CAT活性上升幅度均高于低溫4 ℃處理組。這暗示38 ℃高溫脅迫誘導蠶體產生的自由基可能高于低溫4 ℃處理組，自由基濃度的持續升高，進一步引起保護酶SOD和CAT的活性升高。

低溫4 ℃刺激停止后，琥珀蠶血淋巴SOD也是先出現上升趨勢，隨著時間的推移，逐漸下降，最終恢復到對照組酶活水平；而CAT活性先出現急劇下降，隨后升高達到1個峰值后，再逐漸減弱，在12 h時接近對照。4 ℃低溫刺激琥珀蠶，其CAT酶活先出現下降趨勢，分析認為很有可能是低溫4 ℃脅迫導致琥珀蠶機體自身營養代謝水平減弱甚至短暫失調，在一定程度上阻礙了CAT的合成。

本研究結果顯示：高溫38 ℃和低溫4 ℃脅迫均能引起琥珀蠶血淋巴SOD和CAT活性在一定時間范圍內出現先上升后減弱的趨勢。保護酶SOD和CAT起清除自由基的作用，其活性隨著自由基濃度的變化而變化[6]。不論是高溫還是低溫等逆境刺激對蠶體都會或多或少造成一定的損傷，打破正常的生理活動，引發蠶體產生過量自由基。在這種情況下，蠶體需要大量保護酶用來清除過量的自由基，維持機體正常的生命代謝活動。隨著時間的推移，蠶體生理機能逐漸趨于正常，產生的自由基濃度逐漸降低，保護酶活性也開始下降，

兩者最終維持一個動態平衡。

參考文獻：

[1]Hugon T，Jenkins F. Remarks on the silk worms and silks of Assam[J]. J Asiatic Soc Bengal，1837，6：21-38.

[2]Sarmah M C，Rahman S，Barah A. Traditional practices and terminologies in Muga and Eri culture[J]. Indian Journal of Traditional Knowledge，2010，9（3）：448-452.

[3]Tikader A，Vijayan K，Saratchandra B. Muga silkworm，Antheraea assamensis（Lepidoptera：Saturniidae）-an overview of distribution，biology and breeding[J]. European Journal of Entomology，2013，110（2）：293-300.

[4]鐘 健，董占鵬，江秀均，等. 琥珀蠶的生物學特性[J]. 應用昆蟲學報，2013，50（3）：800-806.

[5]Felton G W，Summers C B. Antioxidant systems in insect[J]. Archives of Insect Biochemistry and Physiology，1995，29（2）：187-197.

[6]方允中，鄭榮梁. 自由基生物學的理論與應用[M]. 北京：科學出版社，2002：231-238.

[7]Lesser M P. Oxidative stress in Marine environments：biochemistry and physiological ecology[J]. Annual Review of Physiology，2006，68（1）：253-278.

[8]Zhao Lin Chuan，Shi Liang En. Metabolism of hydrogen peroxide in univoltine and polyvoltine strains of silkworm （Bombyx mori）[J]. Comparative Biochemistry and Physiology，2009，152（4）：339-345.

[9]Wang Y，Oberley L W，Murhammer D W. Antioxidant defense systems of two Lepidopteran insect cell lines[J]. Free Radical Biology & Medicine，2001，30（11）：1254-1262.

[10]夏潤璽，李健男，曹慧穎，等. 低溫條件下柞蠶血淋巴過氧化氫酶（CAT）活性的變化[J]. 沈陽農業大學學報，2002，33（4）：278-280.

[11]夏潤璽，曹慧穎，劉 限，等. 高溫條件下柞蠶血淋巴過氧化氫酶活性的變化[J]. 蠶業科學，2009，35（2）：415-417.

[12]袁燕萍，趙林川，魏廣衛，等. 家蠶品種7532和大造在高溫沖擊下中腸抗氧化酶活性的變化[J]. 蠶業科學，2010，36（4）：692-696.

[13]吳 蕾. 環境脅迫對西藏飛蝗成蟲取食生長和抗氧化酶系統的影響[D]. 雅安：四川農業大學，2010：1-71.

[14]鐘 健. 琥珀蠶的生物學特性及人工馴養關鍵技術研究[D]. 北京：中國農業科學院，2011：1-53.鐘鴻干，馬 軍，姜芳燕，等. 2種養殖模式下斑石鯛肌肉營養成分及品質的比較[J]. 江蘇農業科學，2017，45（1）：155-158.