正交設計優化濁點萃取—光度法測定野生食用菌中的銅

張水花+畢春麗+付延英

摘要：探討了以二乙基氨基二硫代甲酸鈉為絡合劑，非離子表面活性劑TritonX-100為萃取劑，測定4種食用野生菌中銅含量的濁點萃取-光度法聯用的新方法。在單因素試驗基礎上，采用L16（45）優化萃取條件，詳細探討溶液的pH值、絡合劑和非離子表面活性劑的用量、萃取溫度和時間對濁點萃取效率的影響。在最優條件下，銅的線性范圍0.0～0.5 μg/mL，線性回歸方程為D=0.130 6C+0.000 43（r=0.999 1），檢出限為0.48 μg/mL（n=11），相對標準偏差RSD<3.4%（n=5），樣品加標回收率在99.26%～101.15%。該方法操作簡單、環保、分析速度快、結果準確，將該方法用于4種野生菌中銅含量測定，結果令人滿意。

關鍵詞：濁點萃??；野生菌；分光光度法；銅

中圖分類號： TS207.5+1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）01-0186-03

云南省野生食用菌資源豐富，產量占全世界食用菌一半以上，占中國食用菌的2/3。食用野生菌常常含有利于人類身體健康的物質，在改善人類身體亞健康、防止重大疾病的發生方面起著重要的作用[1-2]，如蕎面菌的子實體提取物對小白鼠肉瘤180及艾氏癌的抑制率為90%，奶漿菌有健胃、止咳平喘、祛痰等功效。此外，野生菌還具有味道鮮美的特點，備受人們喜愛。近年來，國內外學者偏重于研究野生菌抗氧化清除自由基延緩衰老、免疫調節、抗腫瘤、降血脂的作用[3-5]，但野生菌中的微量元素可通過與蛋白質和其他有機基團結合，形成酶、激素、維生素等生物大分子，發揮著重要的生理生化功能，而到目前為止關于野生菌中的微量元素研究卻鮮見報道。因此，野生菌中微量元素的研究不可忽視，該研究不僅可以確定其營養水平，還能為野生菌進一步開發和應用奠定化學基礎。食品中銅含量測定的現行國家標準方法有原子吸收光譜法和二乙基氨基二硫代甲酸鈉分光光度法。但運行成本低、操作簡單的二乙基氨基二硫代甲酸鈉分光光度法在操作中使用了四氯化碳有機溶劑，對人體的身體健康有害，對環境也不友好。因此，對食品中銅含量測定新方法的研究不容忽視。濁點萃取法是近年來出現的一種新型環保的液-液萃取技術，目前在微量、痕量及復雜樣品的分類分析中已有研究并取得了滿意的結果[6-9]，但用于萃取并測定食用野生菌中微量銅的研究尚未見報道。本研究探討了以二乙基氨基二硫代甲酸鈉為絡合顯色劑，非離子表面活性劑TritonX-100為萃取劑的濁點萃取-分光光度法測定野生食用蕎面菌、奶漿菌、紅蠟蘑、銅綠菌中微量銅的可行性，在單因素試驗的基礎上采用正交法優化萃取測定試驗條件，并將最佳條件下測定的結果與國標方法測定的結果進行對比。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

新鮮的奶漿菌、銅綠菌、紅蠟蘑、蕎面菌均購自云南省曲靖市當地農貿市場，將塊菌洗凈，低溫干燥再在105 ℃下烘干后粉碎并過40目篩，得到干燥菌粉備用。

硫酸銅，二乙基二硫代氨基甲酸鈉，TritonX-100，鹽酸，氫氧化鈉，硝酸，氨水，氯化銨，以上試劑均為分析純。所有玻璃儀器在使用前均用稀硝酸浸泡，實驗室用水為二次蒸餾水。

UV-1810紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；pHS-3C精密酸度計（上海虹益儀器儀表有限公司）；HH-306型恒溫水浴鍋（樂清市姚奧特儀表有限公司）；TDL-5-A低速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 濁點萃取測定方法 準確移取一定量的試樣于 10 mL 的具塞刻度離心管中，分別依次加入4 mL氨-氯化銨緩沖液，1.5 mL 0.4%二乙基二硫代氨基甲酸鈉，2.0 mL 10% TritonX-100，加水稀釋至刻度，恒溫水浴一定時間后以 4 000 r/min 離心分離，分相后冰水浴5 min移去水相層，用二次蒸餾水稀釋富膠束相定容至3 mL，靜止后用紫外分光光度計在440 nm處測定其吸光度值。

1.2.2 樣品預處理 采用GB/T5009.13—2003中的試樣處理方法對樣品進行處理，準確稱取約5 g（精確到0.000 1 g）菌粉樣品于瓷坩堝中，加5 mL硝酸放置0.5 h后小火蒸干，繼續加熱炭化，移入馬弗爐中，500 ℃灰化1 h，取出冷卻，再加入1 mL硝酸浸濕灰分，小火蒸干，再移入馬弗爐中，500 ℃灰化0.5 h，冷卻后取出用1 ∶1的硝酸溶解灰樣，并轉入 100 mL 容量瓶中用二次蒸餾水稀釋至刻度，搖勻備用（同時做空白試驗）。

1.2.3 試驗研究方法 考察試驗過程中溶液的酸度、萃取平衡時間、平衡溫度、Triton X-100用量、絡合劑用量等5個因素對測定效果的影響，然后在單因素試驗基礎上，采用正交試驗L16（45）設計方法優化測定方法，試驗因素及水平見表1，試驗方案及數據處理見表2，試驗數據方差分析結果見表3。

2 結果與分析

2.1 測定波長的選擇

按照試驗方法以試劑空白為參比，在360～600 nm波長范圍內掃描得到銅絡合物的吸收光譜（圖1），選擇最大吸收波長為440 nm為測定波長。

2.2 單因素試驗

2.2.1 pH值對萃取效果的影響 絡合劑二乙基氨基二硫代甲酸鈉的穩定性與溶液酸度密切相關，酸性條件下，二乙基氨基二硫代甲酸鈉易分解為二硫化碳，而堿性條件下又容易水解，因此，體系的酸度直接影響著絡合反應的順利進行及萃取效率。本試驗考察不同pH值對銅萃取率的影響，發現隨著pH值的增大，萃取效果先增大后減小，溶液酸度pH值為 8.0～9.0時，對銅的萃取效果最好（圖2）。

2.2.2 平衡時間和溫度對萃取效果的影響 通常來講，較高的溫度有利于反應快速達到平衡，但過高的溫度又會影響絡合物的穩定性。因此，適宜的平衡溫度對萃取效果、效率影響較大。在保證萃取完全的條件下，選擇較短的平衡時間可以直接提高分析效率。為此，考察平衡溫度與時間對體系吸光度的影響（圖3、圖4），由圖3可知，平衡溫度為70～80 ℃，萃取效率最高，由圖4可知平衡15 min萃取效果最好。

2.2.3 TritonX-100用量對萃取效果的影響 非離子表面活性劑TritonX-100的用量不僅決定了銅富膠束相體積的大小，同時還會影響萃取分相過程。試驗考察了TritonX-100用量對萃取效果的影響（圖5），發現加入量小于2.0 mL時萃取不完全從而降低萃取效果，加入量大于2.0 mL時，萃取效果沒有十分明顯的變化。

2.2.4 絡合劑用量對萃取效果的影響 二乙基二硫代氨基甲酸鈉（DDTC）對銅離子具有較高的生產常數，且生成物二乙基二硫代氨基甲酸銅具有疏水好的特點，是一種理想的絡合劑，它除了能與試樣中的銅離子生成絡合物到膠束相中之外，還起到顯色的作用。用量過少導致絡合不完全從而使吸光度偏低，用量過多則會造成浪費，導致成本過高。本試驗考察DDTC用量在0.5～2.5 mL時對萃取效率的影響（圖6）。由圖6可知，用量為1.5 mL時萃取效率最好。

2.3 正交試驗

由表2、表3的分析結果可知，溶液的pH值、萃取平衡溫度、 平衡時間、非離子表面活性劑TritonX-100用量、二乙基二硫代氨基甲酸鈉用量等5個影響因素中，各因素影響程度順序是溶液的pH值>平衡溫度>二乙基二硫代氨基甲酸鈉用量>非離子表面活性劑TritonX-100用量>平衡時間。方差分析表明，溶液的pH值與平衡溫度對測定結果有顯著影響。優化工藝條件為：溶液的pH值為8.0，萃取溫度為 70 ℃，萃取時間為20 min，TritonX-100（體積分數為10%）的用量為 2.0 mL，二乙基氨基二硫代甲酸鈉（0.4%）為 1.5 mL。

2.4 分析特性

在最優試驗條件下以不同濃度（0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μg/mL）銅標準溶液按照試驗方法進行測定，結果顯示，在0～0.5 μg/mL范圍內，吸光度與銅濃度之間存在良好的線性關系，線性回歸方程為D=0.130 6C+0.000 43，相關系數r=0.999 1，檢出限為0.48 μg/mL（n=11）。

2.5 樣品分析

在最佳試驗條件下分別測定蕎面菌、奶漿菌、紅蠟蘑、銅綠菌中的銅，并進行加標回收試驗（表4），由表4可知，樣品加標回收率在99.26%～101.15%，相對標準偏差均小于 3.40%。對照國標法與本試驗方法測定的結果（表5），可知本試驗所用測定方法可靠。

3 結論

建立二乙基氨基二硫代甲酸鈉為絡合劑、非離子表面活性劑TritonX-100為萃取劑測定4種食用野生菌中銅含量的濁點萃取-光度法聯用的新方法。得出最佳試驗條件為pH值8.0，萃取溫度70 ℃，萃取時間20 min，TritonX-100（體積分數為10%）的用量2.0 mL，二乙基氨基二硫代甲酸鈉（0.4%）1.5 mL，在最優條件下，銅的線性范圍0～0.5 μg/mL，線性回歸方程為D=0.130 6C+0.000 43（r=0.999 1），檢出限為0.48 μg/mL（n=11），相對標準差RSD<3.4%（n=5），樣品加標回收率在99.26%～101.15%。研究結果表明，該方法與現行國標法相比更環保，操作簡單、分析速度快、結果準確。將該方法用于4種野生菌中銅含量測定，結果令人滿意。本研究的測定結果可以為4種野生菌進一步開發和應用奠定化學基礎。

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