徐州四種市售食用菌的分子鑒定

胡揚楠　張揚　蘭慧芳　殷婷婷　蔣秋改　談思源　曾健康　溫洪宇

摘 要：本文通過擴增食用菌的ITS序列對徐州市售雙孢蘑菇、香菇、杏鮑菇和草菇的分類學地位進行了研究，將4種食用菌的ITS序列與Eztaxon數據庫中真菌模式菌株數據進行比對，選取親緣關系最近物種的ITS序列，采用Clustalx 1.8軟件和MEGA5.0軟件構建分子發育樹。研究結果為雙孢蘑菇、香菇、杏鮑菇和草菇的ITS序列長度分別為677bp、672bp、605bp和643bp；4種食用菌與親緣關系最近物種構建的分子發育樹表明，雙孢蘑菇與模式菌株Agaricus bisporus（登錄號：AJ133385）序列相似性為100%；香菇與模式菌株Lentinula edodes（登錄號：JQ797414）序列相似性為100%；杏鮑菇與模式菌株Pleurotus ostreatus（登錄號：AB733143）序列相似性為100%；草菇與模式菌株Volvariella volvacea（登錄號：AY636049）序列相似性為99%。初步確定雙孢蘑菇為蘑菇屬的Agaricus bisporus；香菇為香菇屬的Lentinula edodes；杏鮑菇為側耳屬的Pleurotus ostreatus；草菇為小包腳菇屬的Volvariella volvacea。

關鍵詞：食用菌；ITS序列；分子鑒定

中圖分類號：S646 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20160912001

我國食用菌種質資源豐富，而傳統食用菌的分類鑒定主要是基于菌絲、孢子和子實體的形態學特征和生理生化特征。真菌形態特征易受到培養條件的影響，許多子實體類型難以獲得，增加了分類鑒定的難度。真菌核糖體基因轉錄間隔區（Internal transcribed spacer，簡稱ITS）是位于真菌核糖體RNA上18S和28S基因之間的片段，其兩側分別是18S RNA基因和28S RNA基因[1]，長度一般為650～750bp。White等于1990年設計了ITS1、ITS4、ITS5 3對可用于大多數擔子菌和子囊菌的特異性鑒定引物[2]，此后ITS序列分析技術在真菌分類和鑒定的研究中得到廣泛應用。如李晶等采用形態學鑒定方法與現代分子生物學技術相結合將1種野生食用菌鑒定為金山巨菇（Tricholoma sp.）[3]，雷瓊等也采用同樣的方法將一種大型食用菌鑒定為硫磺菌（Laetiporus sulphureus）[4]。本研究通過市售食用菌子實體的形態特征進行觀察，結合ITS 序列分析初步確定分類學地位，為食用菌種質資源提供了依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試雙孢蘑菇、香菇、杏鮑菇和草菇購自徐州市銅山新區農貿市場，編號分別為W1、W2、W3和W4。

1.2 子實體形態觀察

取完整子實體，觀察并描述菌蓋、菌褶和菌柄等。

1.3 DNA提取

將新鮮的子實體烘干后粉碎成粉末并過篩，儲存備用。稱取適量樣品粉末，放入研缽中加入液氮碾磨充分破碎細胞，將碾磨碎粉轉入離心管中，樣品DNA的提取方法參照改進的CTAB法[5]進行。提取的總DNA 經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 ITS區段的PCR擴增

采用通用引物ITS1（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -

3'）與ITS4（5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3'）[2]擴增食用菌的ITS序列。PCR反應條件為：94℃預變性5min； 94℃變性40S，55℃退火45S，72℃延伸1min，30個循環；最后72℃延伸10 min。PCR產物4℃條件下保存。取5μL產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 PCR產物的純化和測序

采用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒（上海生工）從瓊脂糖凝膠電泳中回收DNA。具體步驟參照試劑盒說明。經膠回收純化后的PCR產物送至南京斯普金生物科技有限公司完成測序。

1.6 系統發育樹的構建

將測序所得W1，W2，W3，W4 4種食用菌的ITS序列與Eztaxon數據庫中真菌模式菌株數據進行比對，選取親緣關系最近物種的ITS序列，采用Clustalx 1.8軟件和MEGA5.0軟件以Neighbor-Joining法構建分子發育樹[6]，重復取樣1000次[7] 。

2 結果與分析

2.1 子實體形態觀察

食用菌子實體形態見圖1，具體特征如下：

W1：菌蓋近半球形，白色，光滑；菌肉白色，厚；菌褶褐色至黑褐色，密，窄；菌柄近圓柱形，白色，光滑；具菌環，單層，膜質。

W2：菌蓋扁平，邊緣內卷，表面淺褐色至深褐色，邊緣常有毛狀或絮狀鱗片；菌肉白色，稍厚；菌褶白色，密；菌柄中生，白色，彎曲。

W3：菌蓋圓碟狀，淺褐色；菌褶延生，密集，乳白色；菌柄偏生，中實，棒狀，表面平滑，無菌環。

W4：菌蓋近鐘形，中部稍凸起且色深，邊緣完整；菌褶著生于菌蓋下方，稍密；菌柄著生于菌蓋下方中央，白色稍帶黃色。

2.2 系統發育分析

基于ITS基因序列，對W1，W2，W3，W4與親緣關系近的模式菌株進行分子發育學分析，構建的系統發育樹見圖2。結果表明：W1與模式菌株Agaricus bisporus （登錄號：AJ133385）聚為一支，置信度為100%，ITS序列相似性為100%，初步確定食用菌W1為蘑菇屬的雙孢蘑菇Agaricus bisporus；W2與模式菌株Lentinula edodes（登錄號：JQ797414）聚為一支，置信度為100%，序列相似性為100%，初步確定食用菌W2為香菇屬的Lentinula edodes；W3與模式菌株Pleurotus ostreatus（登錄號：AB733143）聚為一支，置信度為100%，序列相似性為100%，初步確定食用菌W3為側耳屬的Pleurotus ostreatus；W4與模式菌株Volvariella volvacea（登錄號：AY636049）聚為一支，置信度為100%，序列相似性為99%，初步確定食用菌W4為小包腳菇屬的Volvariella volvacea。

3 討論

食用菌具有較高的營養價值、藥用價值和市場價值。本文4種食用菌均為徐州市場常見菌類，且具有種植技術成熟，菌體產量高等特點，有較高的食用和經濟價值。食用菌采收以后，組織柔嫩，含水量高，后熟作用強，容易變質，不耐貯藏[8]，徐州地處江蘇北部，擁有便捷的交通運輸業，使得市售食用菌的種類眾多，加之徐州食用菌種植歷史悠久，栽培經驗豐富，發展優勢明顯[9]。加強食用菌種質資源的鑒定和挖掘對于發展食用菌產業具有重要意義。

采用傳統形態學鑒定具有易于觀察和比較優勢，但其主要根據基因的表型進行研究，缺乏多態性指標，且容易受到多種因素的影響，尤其是地域分隔會造成食用菌種內的形態多樣性較高的現象，給種和親緣種的鑒定帶來一定的難度和分歧[3]。本文結合ITS序列分析對常見菌進行分子鑒定，結果表明4種食用菌分別是蘑菇屬的雙孢蘑菇（Agaricus bisporus），香菇屬的香菇（Lentinula edodes），側耳屬的杏鮑菇（Pleurotus ostreatu），小包腳菇屬的草菇（Volvariella volvacea），研究結果系統完善了徐州市常見食用菌的種質資源，為進一步篩選優種、提高產量、優化母種等研究提供了理論基礎。

參考文獻

[1]趙歡，吳衛，鄭有良，等.核糖體DNA ITS序列分析在藥用植物研究中的應用[J]. 時珍國醫國藥，2009（4）：959-962.

[2]White T J， Burns T ， Lee S.Analysis of phylogenetic relationships by amplification and direct sequencing of ribosomal RNA genes[C].PCR protocols： A Guide to Methods and Applications. New York ：Academic，1990，15-22.

[3]李晶，林冬梅，林占熺，等.一種野生食用菌的分子及形態學鑒定[J]. 現代農業科技，2012（8）：110-111， 115.

[4]雷瓊，汪儉，范曉丹，等.1株野生大型食用菌的分子鑒定與同源性分析[J]. 長江大學學報（自科版），2013（35）： 7，52-55，68.

[5]臧金平，連賓，袁生.簡便易行的食用菌菌絲體基因組DNA提取法[J].食品科學， 2005，26（3）：66-68.

[6]Saitou N， Nei M. The neighbor-joining method： a new method for reconstructing phylogenetic tree[J].Molecular Biology and Evolution，1987，4（4）：406-425.

[7]Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies：An approach using the bootstrap[J].Evolution，1985，39（4）：783-791.

[8]葉自新. 蘑菇保鮮及防止其變色的研究[J]. 食品與發酵工業，1982（05）：32-38.

[9]陸正麗，秦越華. 徐州市食用菌產業發展的優勢與策略[J]. 現代農業科技，2008（14）：93，96.

作者簡介：胡揚楠（1993-），女，大學本科，研究方向：食用菌種質資源；溫洪宇，博士，碩士生導師，研究方向：環境微生物學。