油茶中產多酚內生真菌的篩選

張婷　左雪枝　賴艷

摘 要：植物內生真菌是指生活在健康植物組織內但并不使寄主產生明顯侵染性狀的真菌，其代謝產物與宿主有著相同或者相似的生理活性。本研究利用顏色反應和薄層層析法從油茶14株內生真菌中篩選到一株具有產多酚能力的內生真菌（CO-10）。同時結合核糖體基因居間序列（ITS）的序列相似性分析，確定菌株CO-10屬于曲霉屬真菌。

關鍵詞：顏色反應；薄層層析；多酚；曲霉屬

中圖分類號：S794.4 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20161132031

內生真菌（Endophytic Fungi）是指存在于健康植物的莖干、葉片或葉柄等組織部位中，度過了全部或近全部生活周期而不使宿主表現任何癥狀的一類真菌[1]。內生真菌長期存在于宿主體內，與宿主協同進化，建立了良好的、互惠互利的共生關系。

油茶（Camellia oleifera）是我國特有的木本油料樹種，是一種常綠、闊葉的生態經濟樹種。關于油茶內生真菌的研究剛剛起步，周生亮等[2]用免培養法對油茶葉片中的內生真菌進行研究，通過序列測定和比對確定了12個不同的分類操作單元，分屬于曲霉屬Asperillus、球腔菌科Mycosphaerellaceae、糞殼菌目Sordariales和蠟釘菌目Helotiales。 Zhang等[3]采用傳統方法從江西省林科院油茶園中選取了9株油茶健康植物進行內生真菌的分離。結果顯示油茶內生真菌的種類涉及59個分類單元，其中芒果球座菌G.mangiferae為油茶內生真菌的優勢種，青霉屬Penicillum、鏈格孢屬Alternaria、鐮孢屬Fusarium在油茶不同組織部位也常常出現。雖然這些研究結果均表明油茶的內生真菌種類相當豐富，但有關油茶內生真菌的次生代謝產物研究并未開展。油茶除了主要產品茶油外，還可生成多種生理活性物質，多酚就是其中一種。植物多酚具有抗氧化、延緩機體衰老、抑制糖尿病、高血壓等疾病發生的作用，具有可觀的應用前景[4]?？墒莻鹘y的提取方式工序復雜，耗時耗力，效率不高，對環境污染大，且很難實現工業化連續性產出。鑒于此，我們對油茶內生真菌進行分離，希望能找到一種能產多酚的植物內生真菌，利用生物發酵的方式來替代傳統的化學浸提法，以實現更高效、更節省、更環保、更方便的連續生產。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和試劑

新鮮的油茶組織采自湖北京山，帶回實驗室在24h內進行內生真菌的分離。

1.2 內生真菌的分離純化

按照周希等[5]的方法，將油茶組織洗凈，表面消毒后，切成小塊接種于PDA固體培養基上，在適當條件下培養數天，進行純化接種，將純化的菌株保存于PDA斜面培養基中，備用。

1.3 內生真菌的發酵培養

1.3.1 液態發酵

取出保存的菌種活化，活化后進行液體發酵培養。每個菌種接兩環于PDA液體培養基中，先靜置于28℃恒溫箱中12h左右，然后移至28℃恒溫搖床上150r/min培養3～5d，注意定時觀察。

1.3.2 發酵液的處理

要分離菌和發酵液。對于菌絲生長旺盛已形成大量菌絲球的菌液，直接抽濾，方便快捷；對于菌絲生長不明顯或是沒用形成明顯菌絲體的菌液，可采用離心分離的方法，利用離心機4000r/min離心5min左右即可。

將分離好的發酵液倒入梨形分液漏斗，等體積加入乙酸乙酯加蓋充分振蕩，靜置萃取過夜。分離兩相，取上層清夜，即乙酸乙酯相；將菌體經由120℃烘箱烘干，加滅菌石英砂研磨成粉狀，用適量乙酸乙酯浸提過夜后，4000r/min離心5min分離。將液相與同種菌的發酵液的乙酸乙酯相合并后真空旋轉蒸發蒸干，得到的膏狀物質。用5mL甲醇溶解，分裝到4個1.5mLEP管中，4℃低溫保存備用。

1.4 篩選及鑒定

1.4.1 篩選

用酒石酸亞鐵顏色反應進行初篩，用薄層層析法進行復篩。復篩時，以沒食子酸為標準品，展層劑為苯和乙醇的混合物，展層后噴灑顯色劑（醋酸-亞硝酸鈉-氫氧化鈉）檢測。

1.4.2 菌株的鑒定

鑒定采用分子鑒定，用CTAB法提取真菌的基因組

DNA，擴增反應所用引物為ITS-1（5- TCCGTAGGTG-

AACCTGCGG-3）和ITS-4（5-TCCTCCGCTT-ATTGTATGC-3）[6]。擴增、克隆后送取適量陽性克隆子的菌液送武漢博奧生物技術有限責任公司進行測序。將測定的序列以NCBI GENBANK數據庫中的相似序列比對分析，再用MEGA軟件進行聚類分析，根據聚類分析圖確定分類地位。

2 結果與分析

2.1 油茶內生真菌的分離結果

油茶組織塊在接著3d后，組織塊邊緣就有菌絲長出，隨著培養時間的延長，長出的菌絲種類逐漸增多，在每一次觀察到有新菌絲長出時，都及時進行了轉接、純化，最后共得到14株形態不同的內生真菌菌株，這14株內生真菌菌株的編號及菌落特征如表1所示。

2.2 篩選結果

經過酒石酸亞鐵顏色反應初篩顯示僅CO-10反應后呈現藍色，提示可能含有多酚類物質。復篩結果如圖1所示，對初篩出的菌株發酵提取物和沒食子酸標準樣對照進行薄層層析，發現檢測樣品有一個與標準樣遷移率相同的斑點，說明樣品中可能含有茶多酚。

2.3 分子鑒定

菌株CO-10提取基因組DNA后，對其進行PCR擴增，得到長度約為630bp的擴增片段。以鏈格孢屬菌株（Alternaria sp.）為外群，按照NJ（neighbor-joining）法所構的聚類分析圖如圖2所示。CO-10與曲霉屬的菌株聚為一支，自信值為100，從而判斷CO-10屬曲霉屬Aspergillus.

3 討論

內生真菌存在于植物體內，通常能產生與植株相同或相似的次生代謝產物，張海龍等[7]從銀杏中篩選出了2株具有產黃酮化合物能力的內生真菌，徐慧超等[8]從甘草中篩選出了一株內生真菌RE7，從其發酵液中分離得到了甘草次酸；吳曉民等[9]從珍貴藥用植物高山紅景天中得到了一株可產紅景天苷的內生真菌G5；正是由于內生真菌能夠產生各種各樣的抗腫瘤、抗氧化、抗菌等作用的生理活性物質，引起了無數研究者的熱情。

本研究利用常規的組織分離法分離來自湖北京山油茶樣品中的內生真菌，油茶組織經過嚴格消毒后共分離到14株形態不一的內生真菌，說明在油茶的不同組織部位均有內生真菌分布。對分離到的內生真菌進行液體培養，濃縮發酵液，并用極性有機溶劑萃取。由于多酚中的羥基與鐵離子螯合可生成藍紫色的絡合物，因此用酒石酸亞鐵進行顏色反應初篩，初篩結果顯示CO-10可能具有產多酚物質的能力。多酚類物質的種類很多，在復篩中以沒食子酸做標準品，檢測CO-10的代謝物種是否有與沒食子酸結構相似的物質存在，層析結果顯示在CO-10的層析斑點中具有與沒食子酸一樣遷移率的斑點，說明菌株CO-10能產生與沒食子酸結構相似的多酚類物質。

分子鑒定已成為真菌分類的一種有力的和必不可少的方法。在DNA標記中，ITS區域是最常用于物種鑒定的，它被認為是真菌的條形碼，已成功地鑒定了70%的真菌[10]。本研究對菌株CO-10的分子鑒定結果顯示其屬于曲霉屬Aspergillus，在陳可可等[11]的研究中發現曲霉屬真菌能控制后發酵過程，能改變普洱茶中茶多酚的組成與含量，但是對于其具體作用機制并未作出明確解釋。結合本研究結果，推測其原因可能是由于曲霉屬真菌具有產多酚類物質的能力，也可能是由于曲霉屬真菌能夠產多酚形成過程中的一些酶類，從而促進了物質向某一特定方向的轉化過程。

內生真菌作為一種新開發的微生物資源，具有微生物生長和繁殖快速、培養簡便、成本低廉等優點，且能產生豐富的代謝產物，有望突破植物資源缺乏、再生周期長等限制，成為天然活性化合物生產的新途徑。因此，在后續的研究中，還需測定菌株CO-10產多酚類物質的能力，并選取一定的方法提高其產量，加快育種工作。

參考文獻

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[2]Zhou SL，Yan SZ，Wu ZY，et al.Detection of endophytic fungi within foliar tissues of Camellia oleifera based on rDNA ITS sequences[J].Mycosystem，2013，32（5）：819-830.

[3]張林平，張揚，王舒，等.油茶不同部位的內生真菌組成及多樣性分析[J].林業科技開發，2013，27（6）：101-105.

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[7]張龍海，李善春，盧維浩，等.銀杏內生真菌多樣性與產黃酮類物質真菌的分離和鑒定[J].土壤，2015，47（1）：135-141.

[8]徐慧超，孫婷媛，翟李欣，等.產甘草次酸內生真菌RE7的鑒定及抑菌活性研究[J].中國新藥雜志，2016，25（1）：102-117.

[9]吳曉民，任謂明，楊信東，等.高山紅景天內生真菌的分離及產紅景天苷菌株的篩選[J].時珍國醫國藥，2014，25（11）：2769-2772.

[10]Chen J，Zhang LC，Xing YM，et al. Diversity and taxonomy of endophytic Xylariaceous Fungi from medicinal plants of Dendrobium （Orchidaceae）[J].PLOS ONE，20138（3）：e58268.

[11]陳可可，張香蘭，朱宏濤，等.曲霉屬真菌在普洱茶后發酵中的作用[J].云南植物研究，2008，30（5）：624-628.

作者簡介：張婷（1980-），女，碩士，講師，主要從事：微生物資源利用研究。