丙泊酚中/長鏈脂肪乳注射液包封率分析方法的建立

賈國慧+鄭建飛

摘 要 目的：建立丙泊酚中/長鏈脂肪乳注射液包封率的分析方法。方法：利用超濾法分離微乳和游離藥物，采用Agilent的XDB-C18作為色譜分離柱、乙腈-水（7∶3）為流動相、檢測波長275 nm、柱溫25 ℃、流速1.0 ml / min和進樣量5 μl進行色譜分析。結果：本方法重復性考察的RSD為1.14%。日間精密度考察RSD為1.25%。結論：所建立的包封率定量方法，簡便、快速、重復性好，可作為工藝篩選過程中靈敏、高效、有區分力的監測方法。

關鍵詞 包封率 丙泊酚 微乳 超濾

中圖分類號：R944.17 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533（2017）03-0069-03

Establishment of a method for the determination of propofol entrapment efficiency in a medium and long chain of fat emulsion injection

JIA Guohui*， ZHENG Jianfei

（Central Research Institute， Shanghai Pharmaceuticals Holding Co. Ltd.， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for the determination of propofol entrapment efficiency in a medium and long chain of fat emulsion injection. Methods： The microemulsion and free propofol were separated by ultrafiltration and the high performance liquid chromatography was carried out on an Agilent XDB-C18 column using acetonitrile-water （7：3） as a mobile phase at flow rate of 1.0 ml/min， column temperature 25 ℃ and detective wave length of 275 nm. Results： The RSD for repeatability and inter-day precision was 1.14% and 1.25%. Conclusion： This method is simple， steady and reliable and can be used for the determination of propofol entrapment efficiency in a fat emulsion.

KEy WORDS entrapment efficiency； propofol； microemusion； ultrafiltration

丙泊酚中/長鏈脂肪乳注射液為我公司開發的脂肪乳制劑，原研為德國費森尤斯卡比（Fresenius Kabi）公司，其產品2007年在我國上市，商品名竟安，為靜脈注射用麻醉劑。制劑開發中為了獲得與原研一致的藥效、安全性及制劑特性，我們選擇乳劑的粒徑、粒徑分布、包封率、外觀狀態作為考察指標來篩選處方。在這些指標中，反映藥物包封程度的包封率是微乳注射劑重要的質量指標，其檢測方法的建立也是研究工作中的難點。在參考相關文獻的基礎上[1-14]，我們嘗試了透析法[4-6]、葡聚糖凝膠法[4-7]等方案，均未成功。本研究基于丙泊酚微乳溶液中被包封藥物與游離藥物粒徑的區別，建立了超濾離心檢測藥物包封率的方法，經實踐與驗證，所建立的方法操作簡單、數據可靠，區分度好。

1 材料與方法

1.1 材料

安捷倫1100型高效液相色譜儀（美國安捷倫）；梅特勒XP56型百萬分之一天平（瑞士梅特勒）；Sigma 3K15離心機（德國希格瑪）；Millipore Amicon Ultra-4 Ultracel-100k（過濾體積4 ml，NMWL：100 kDal）超濾離心管（德國密理博）；丙泊酚中/長鏈脂肪乳注射液（批號：20090717-1、100804-5S、100804-10S、100804-15S，公司自制）；費森尤斯卡比（商品名竟安，批號：16DC0082）；丙泊酚長鏈脂肪乳注射液（商品名力蒙欣，批號：0808261，西安立邦公司）；工作對照品：丙泊酚原料（Product-No：49340790792， NDC 12502-4934-0）。

1.2 高效液相色譜檢測方法

1）色譜條件 采用Agilent的XDB-C18（4.6 mm×150mm， 5 μm）作為色譜分離柱；乙腈-水（7∶3）為流動相；檢測波長275 nm、柱溫25 ℃、流速1.0 ml /min、進樣量5 μl。

2）樣品制備方法 將超濾離心管（Amicon ultra-4）用50%乙醇水溶液浸泡過夜，待用。取本品0.2 ml于超濾離心管中，加水1.8 ml，20 ℃離心25 min（3 400 g）。下層濾液棄去，上層加水2 ml，機械振蕩3 min。以相同條件再次離心25 min，上層液加水1 ml，機械振蕩3 min后移至10 ml容量瓶中，并用0.40 ml水清洗2次，清洗液全部轉移至10 ml容量瓶中，以四氫呋喃-異丙醇（5∶3）混合液定容。照色譜條件進樣測定，計算濃度C。另取本品0.2 ml于10 ml容量瓶中，加四氫呋喃-異丙醇（5∶3）混合液溶解并定容，進樣測定，計算濃度C0。包封率（%） =C/C0×100%[14]。

2 結果

2.1 方法的建立與優化

微乳為不穩定體系，包封率測定比較困難，為建立切實可行的控制方法，我們嘗試了透析法、葡聚糖凝膠法、超速離心法[8-12]等，結果均不理想。最終，我們在超濾離心法[13]的基礎上，經過反復優化，終于獲得了操作便利、具有區分力的檢測方法。

2.1.1 超濾管的選擇

本品屬于亞微乳范圍，包封藥物平均粒徑小于300 nm，而游離藥物為小分子?；谝陨闲再|及樣品的處理量，我們選擇了Millipore Amicon Ultra-4 Ultracel-100k的超濾離心管，實踐證明所選用的超濾管可有效截留包封藥物且可操作性良好。

2.1.2 測定可行性的考察

基于微乳的特性，推測丙泊酚微乳溶液經過超濾離心后，被包封的丙泊酚因為粒徑大，會截留在離心管的膜上層，而游離的丙泊酚分子量小，會被甩到膜下層或被吸附到超濾膜上。

取125 μg/ml丙泊酚水溶液2 ml（即250 μg）于超濾管中。超濾離心后移出下層濾液（約2 ml）；上層加水2 ml，渦旋混合3 min。上下層液均取出100 μl于HPLC進樣檢測。同法操作，離心3次。平行檢測2份，結果見表1。

由表1試驗結果可知：①超濾膜可吸附大部分的游離丙泊酚，被吸附的游離丙泊酚解吸附量很?。?lt;1%）；②離心2次后，上層幾乎不殘留游離丙泊酚（<1%）；③鑒于包封率檢測為限度檢測，中國藥典微粒制劑指導原則要求大于80%即可[14]，小于1%的游離藥物殘留，對檢測結果的判定影響不大，因此，所設計的測試方法可行。

2.1.3 離心力的選擇

采用20 ℃，25 min條件下對離心力進行篩選，結果見表2。

綜上，選擇離心條件為3 400 g、20 ℃、25 min，可防止離心后取出上層濾物的困難，又能保證游離丙泊酚基本被分離。

2.2 方法驗證

2.2.1 專屬性

考察前處理過程對檢測是否存在干擾。將超濾管采用50%的乙醇溶液浸泡1 h后，加水、空白微乳、樣品，按條件分別處理后，經HPLC檢測，空白不干擾樣品的測定。

2.2.2 溶液穩定性

考察對照品及樣品在配置溶液中的穩定性。分別采用工作對照品及對照品加空白微乳配置約200 μg/ml的溶液，分別考察6～8個時間點至24 h，觀察丙泊酚、丙泊酚加空白微乳在樣品配置溶液（四氫呋喃-異丙醇5∶3）中的穩定性。經考察，它們RSD實測值均小于1%，符合穩定性要求。

2.2.3 線性

取適量工作對照品置量瓶中，用四氫呋喃-異丙醇（5∶3）溶解并稀釋至刻度，制成1.971 mg/ml的溶液作為線性儲備液。精密量取線性儲備液0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 ml，分別置于10 ml容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，制成線性濃度溶液，分別進樣測定。得到線性方程y=0.085 7x–0.092 5 （r=1， n=5）。

2.2.4 重復性檢測

1）日內 平行取6份樣品（批號：20090717-1），它們的包封率分別是92.8%、92.5%、93.7%、90.6%、91.8%和91.9%；RSD為1.14%。

2）日間 對供試品（批號：20090717-1）進行包封率測定，連續3 d，每天平行檢測3份（表3）。

日內與日間測定結果表明，該方法精密度良好。

2.3 多批樣品測定

采用我們所建立的方法，對多批自制及不同廠家市售樣品進行了檢測（表4）。

上述結果表明，所建立的方法可有效檢測樣品的包封率并具有很好的區分力，為制劑的處方工藝研究提供了良好的基礎。同時，數據也表明自制丙泊酚中/長鏈脂肪乳注射液包封率與市售品竟安基本相同，符合要求，且丙泊酚中/長鏈脂肪乳的包封率高于丙泊酚長鏈脂肪乳（力蒙欣）。

3 討論

研究中我們發現，采用葡聚糖凝膠法及Sephadex G25 柱，雖經填料徑高比、流動相種類與洗脫比例等條件的篩選，依然無法使游離與包封藥物有效分離，檢測結果不具區分力；在透析法中，經18 h藥物濃度的檢測，發現游離藥物側的藥物濃度始終無法出現濃度平臺；而在超速離心法中，檢測結果的重現性很難把握。在這些研究的基礎上，最終，我們通過超濾離心法，建立了具有良好區分度的包封率檢測方法。我們推測多種方法未果的原因可能為微乳粒子的穩定性所致。通常，在結構上，微乳是較脂質體更不穩定的體系。游離與包封藥物始終處在動態平衡中，缺少明確的區分界限。在超濾離心方法中，通過快速離心與超濾膜的物理分離，相比其他方法，較好地克服了溶劑或稀釋劑對微乳穩定性的影響，同時通過超濾膜的快速物理阻隔，也避免了兩部分藥物進一步互吸、互溶的問題。

采用所建立的方法，我們通過對不同工藝樣品、不同來源市售樣品的考察，同時結合樣品粒徑、粒徑分布、外觀等指標的綜合分析，證實了本方法的可靠性，從而為制劑工藝的篩選與優化提供了重要的監控手段。本研究因無法獲得完全包封的理想樣品，很難確知超濾膜是否對包封樣品存在吸附。超濾膜上下層游離藥物殘留檢測試驗證明，膜本身存在對游離藥物的吸附，因此，無法通過傳統的回收率試驗對方法的可靠性進行驗證。因此，我們通過設計游離藥物在膜上層的殘留檢測、樣品的重復性檢測和對不同樣品檢測的區分力等對方法的準確度與可用性進行了驗證。

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