茶葉多酚氧化酶同工酶熱穩定性分析

陳盛虎++徐小云++伍夢瑤++黃瑩捷++姚燕妮++黃友誼

摘要：對分離純化得到的龍井43多酚氧化酶同工酶在30～50 ℃下的熱穩定性進行了分析，發現多酚氧化酶同工酶PPOⅡ、PPOⅢ在30 ℃時的熱穩定性最高，隨溫度的升高其熱穩定性下降；多酚氧化酶粗酶的熱穩定在40 ℃時最高，并整體高于多酚氧化酶同工酶的熱穩定性。試驗結果給茶葉生產中維持適當的溫度來控制多酚氧化酶的活性提供了依據。

關鍵詞：茶葉；多酚氧化酶；同工酶；酶活力；熱穩定性

中圖分類號：S571.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）01-0095-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.01.024

Thermal Stability Analysis on Polyphenol Oxidase Isozymes from Camellia sinensis

CHEN Sheng-hu， XU Xiao-yun， WU Meng-yao， HUANG Ying-jie， YAO Yan-ni， HUANG You-yi

（Ministry of Education Key Laboratory of Horticultural Plant Biology/Horticulture and Forestry Science College， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

Abstract：The thermal stabilities of the polyphenol oxidase isozymes purified from Camellia sinensis cv. Longjing No. 43 were analyzed at 30～50 ℃，the results showed that the activities of two polyphenol oxidase isozymes PPOII and PPOIII were the highest under 30 ℃，and decreased with the increasing of temperature. The thermal stability of crude polyphenol oxidase was the highest under 40 ℃， and the overall thermal stability was higher than those of polyphenol oxidase isozymes. The experiment results provide a basis for maintaining appropriate temperature to control the activity of polyphenol oxidase in tea production.

Key words：Camellia sinensis； polyphenol oxidase； isozyme； enzyme activity； thermal stability

多酚氧化酶（Polyphenol oxidase， PPO， EC 1.10.3.1）在茶葉生理代謝及產品加工中具有重要作用。目前對茶葉PPO粗酶[1-3]研究較多，對其同工酶[4-6]也有一些報道，但整體而言對茶葉PPO同工酶的研究相對匱乏[7，8]。除在綠茶[9]中需要快速鈍化PPO外，紅茶加工[10，11]以及固定化酶體外制備茶黃素[12-14]等過程中都需要PPO具有很好的催化活性和熱穩定性。已證實茶葉PPO單一同工酶較粗酶有更高的催化效率[5，7]，并且茶葉PPO基因克隆和外源表達等方面的研究進展[15，16]也使得催化活性高、熱穩定性佳的單一同工酶的工業化利用成為可能。本研究在成功分離純化得到PPO同工酶的基礎上，分析了PPO同工酶的熱穩定性，豐富了對茶葉PPO同工酶的研究，可為生產中控制茶葉PPO的活性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

龍井43號（Camellia sinensis var. Longjing 43）一芽二葉鮮葉于2015年春采自華中農業大學茶學專業教學基地。

試驗儀器：DEAE Sepharose CL-6B（GE Health Bio-Sciences AB公司）； Sephadex G-150（美國PHARMACIA公司）；HH-2型恒溫水浴鍋（江蘇金壇中大儀器廠）；Synergy HT酶標儀（基因有限公司）。所用試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PPO同工酶分離純化 按許雷等[7，17，18]PPO同工酶分離純化方法進行分離純化。取適量茶鮮葉，加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮，5%，W/V）和0.05 mol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液（料液比1∶2），冰浴研磨，4 ℃下浸提12 h，離心、過濾制得粗酶液。對粗酶液進行30%～80%的硫酸銨沉淀，將所得沉淀用適量0.02 mol/L、pH 7.2磷酸鹽緩沖液溶解后，再用4倍體積同樣的緩沖液脫鹽，制得上樣液。將上樣液用DEAE-Sepharose CL-6B材料進行陰離子交換層析，選用含0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mol/L NaCl的0.02 mol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液各2倍柱體積進行梯度洗脫，280 nm下檢測吸收峰并收集、脫鹽、濃縮。再將收集峰用Sephadex G-150材料進行凝膠過濾層析，選用含有0.10 mol/L NaCl的0.02 mol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液等梯度洗脫，280 nm下檢測吸收峰并收集、脫鹽、濃縮。重復上述過程，收集足量樣品，4 ℃保存備用。

1.2.2 PPO同工酶的電泳檢測 PPO同工酶條帶數量采用非變性凝膠不連續垂直板電泳法進行檢測。制備7.5%的分離膠和4%的濃縮膠。分別取PPOⅡ、PPOⅢ、粗酶液40 μL，加10 μL電泳上樣緩沖液混合后于12 000 r/min離心10 min，取20 μL上樣。冰浴條件下電泳，在樣品中溴酚藍遷移至靠近分離膠底部時停止。進行酶特異性反應染色30 min后，脫色至條帶清晰。

1.2.3 PPO同工酶熱穩定性分析 將PPOⅡ、PPOⅢ、粗酶液分別置于恒溫水浴鍋中于30、40、50 ℃下溫浴60 min，每10 min取樣1次，快速冰浴降溫，測定酶活性。以未經過熱處理的酶樣品單位酶活力值記為100%，計算相對酶活力。

1.3 PPO酶活力測定

取酶液10 μL于96孔板中，加入0.1 mol/L、pH 5.6的檸檬酸磷酸鹽緩沖液50 μL和75 μL反應混合液（0.1 mol/L檸檬酸磷酸鹽緩沖液∶0.1%脯氨酸∶1%鄰苯二酚=10∶2∶3，現配現用），置于酶標儀中37 ℃控溫反應30 min，410 nm下每間隔1 min測定1次吸光值，根據30 min連續測定得來的吸光值曲線計算酶活力。將活性測定反應液的吸光值每分鐘增加0.001定義為1個酶活力單位（U）。

1.4 PPO半衰期計算

按袁新躍[19]的方法計算茶葉PPO的半衰期，計算公式：T1/2=0.693/kd，kd=2.303log（E0/E1）/t，其中E0為初始酶活力，E1為保存一段時間后的酶活力，t為PPO在不同溫度下的溫浴時間，本試驗中t=1 h。

1.5 PPO蛋白含量測定

依據Bradford法，使用蛋白質定量試劑盒測定蛋白質含量。

1.6 數據處理

采用Excel 2010和SPSS軟件進行數據統計分析。所有數據均為3次重復試驗的平均值。

2 結果與分析

2.1 茶樹PPO同工酶分離純度鑒定

龍井43號茶樹鮮葉經過勻漿浸提、硫酸銨沉淀、陰離子交換層析和凝膠過濾層析之后，非變性凝膠電泳檢測結果（圖1）表明，從主要含有4條明顯PPO同工酶的粗酶中成功分離得到了第2、3條同工酶，分別記為PPOⅡ、PPOⅢ。從表1可知，PPOⅡ的比活力為1 293.97 U/mg，純化倍數為3.39；PPOⅢ的比活力為684.81 U/mg，純化倍數為1.79。在單位酶活力相近的情況下，粗酶蛋白質含量為1.301 mg/mL，含雜蛋白最多，PPOⅡ蛋白質含量為0.387 mg/mL，純度更高。許雷等[7]同樣利用龍井43號茶樹鮮葉分離得到變性電泳純的PPO同工酶，比活力為648.22 U/mg，純化倍數為1.30，同工酶純度較高，但酶活力下降，且得率很低，不便于后續試驗分析。

2.2 不同溫度熱處理時PPO粗酶相對酶活性的變化

從圖2可以看出，龍井43號PPO粗酶活力在30 ℃熱處理時喪失最少，在第20分鐘時酶活力有明顯回升，此后酶活力持續下降，在第40分鐘時酶活力又有所回升，到60 min時相對酶活仍保留有62.41%，表明PPO粗酶在30 ℃時熱穩定性好。40 ℃處理60 min后，PPO粗酶相對酶活保留有65.71%，在第50分鐘時相對酶活也有明顯回升，表明PPO粗酶在30～40 ℃下較為穩定。在50 ℃下時，PPO粗酶相對酶活快速喪失，10 min后相對酶活僅剩余43.22%，但在第30分鐘時又回升至68.64%，之后又快速下降，至60 min時僅剩19.03%。

2.3 不同溫度熱處理時PPO同工酶PPOⅡ相對酶活性的變化

如圖3所示，龍井43號PPO同工酶PPOⅡ在30 ℃熱處理10 min后，相對酶活為76.05%，在第20分鐘時有明顯回升，此后酶活力持續下降，在第60分鐘時又有少量回升，相對酶活剩余67.64%。在40 ℃和50 ℃處理時，PPOⅡ相對酶活隨熱處理時間延長明顯下降，但40 ℃第50分鐘時相對酶活有少量回升，至60 min時僅剩余28.29%；在50 ℃下處理時相對酶活喪失最為快速，10 min后僅剩余26.49%，此后下降速度變緩，第50分鐘時有極少量回升，在60 min后仍剩余21.57%，表明PPOⅡ在50 ℃熱處理10～60 min之間剩余的酶活保持穩定。

2.4 不同溫度熱處理時同工酶PPOⅢ相對酶活性的變化

如圖4所示，龍井43號PPO同工酶PPOⅢ在30 ℃熱處理時相對酶活喪失最少。在40 ℃和50 ℃處理時，PPOⅢ相對酶活隨熱處理時間延長明顯下降，在40 ℃熱處理60 min后相對酶活為46.94%；50 ℃處理時相對酶活快速喪失，10 min后僅剩余44.46%，此后下降速度變緩，至60 min時保留有33.34%。

2.5 不同溫度熱處理對龍井43號PPO酶活力的影響

如圖2、圖3、圖4所示，龍井43號PPO粗酶、PPOⅡ、PPOⅢ等3個酶分別在30～50 ℃溫度下溫浴60 min后，酶活力相比初始酶活力均明顯下降。根據不同溫度下溫浴60 min后酶活力的變化值，計算出龍井43號PPO粗酶、PPOⅡ、PPOⅢ等3個酶分別在30～50 ℃溫度下的半衰期，結果見表2。從表2可以看出，30 ℃下PPO粗酶、PPOⅡ、PPOⅢ的半衰期分別為1.48、1.78、1.38 h，PPOⅡ的熱穩定性顯著高于PPO粗酶和PPOⅢ（P<0.05），PPO粗酶和PPOⅢ之間無顯著差異。40 ℃下PPO粗酶、PPOⅡ、PPOⅢ的半衰期分別為1.65、0.55、0.92 h，PPO粗酶的半衰期最長，PPOⅡ的半衰期最短，三者間表現出極顯著差異（P<0.01）。50 ℃下PPO粗酶、PPOⅡ、PPOⅢ的半衰期分別為0.42、0.45、0.63 h，PPO粗酶和PPOⅡ的酶活力保持時間相近，PPOⅢ酶活力保留時間較長，與前兩者間有極顯著差異（P<0.01），但PPO粗酶與PPOⅡ之間無顯著差異。由以上可知，PPO粗酶在40 ℃時的熱穩定性高于其他溫度；而PPOⅡ和PPOⅢ在30 ℃時的熱穩定性最好。

3 小結與討論

3.1 茶葉PPO酶活力的熱穩定性

整體可見，茶葉PPO酶活力隨熱處理溫度升高和時間延長依次下降，30 ℃下PPO酶活力保留量較多，50 ℃時PPO酶活力即快速喪失。劉琨[20]發現碧螺春鮮葉PPO在30 ℃熱處理時酶活力隨時間延長先升后降，40 ℃時酶活力隨時間延長持續下降，在50 ℃熱處理時酶活力下降趨勢明顯強烈，與本研究結果一致。酶活力的喪失與酶蛋白空間構型的改變有直接關系，熱處理是改變酶蛋白活性中心結構的常見方法[9]。高溫能破壞H鍵或疏水鍵，從而使酶空間構型變化，活力喪失，溫度越高破壞作用越強，酶活力喪失越快。茶葉PPO在30～50 ℃范圍內仍保留酶活力，說明在此溫度范圍內，只有部分PPO構型發生改變。在30 ℃下茶葉PPO酶活力較50 ℃時高，且半衰期較50 ℃時長，說明處理溫度越低，PPO活性中心的構型越穩定。另外茶葉PPO在30～50 ℃范圍內出現多次酶活力回升的現象，可能是PPO酶蛋白空間構型的改變是可逆的，或是形成活性更高的PPO蛋白質構型。

3.2 茶葉PPO同工酶與粗酶的熱穩定性差異

對PPO粗酶、PPOⅡ、PPOⅢ等3個酶樣進行熱穩定性分析后可知，單一條帶的PPOⅡ、PPOⅢ在30～50 ℃熱處理過程中，酶活力值回升次數明顯少于粗酶，且在相同溫度下酶活力的保留量也低于粗酶液，說明單一條帶的PPOⅡ、PPOⅢ熱穩定性較PPO粗酶差，可能是因為未經純化的PPO粗酶中含有較多的雜蛋白或多肽，能對PPO蛋白起保護作用，增強其熱穩定性；而同工酶蛋白較粗酶純，受溫度作用更為直接，活性喪失快。榮紹豐等[21]也發現一些蛋白質和多肽對谷氨酰胺轉胺酶有保護作用，能增強其熱穩定性，該發現支持了這一推論。但在30 ℃時PPOⅡ、PPOⅢ的活性增幅較粗酶明顯，且PPOⅢ在60 min內平均酶活力值較粗酶高，說明在30 ℃時PPO蛋白結構受熱破壞作用不明顯，此溫度下單一條帶同工酶較粗酶催化效率更高。

3.3 茶葉PPO同工酶的熱穩定性在生產上的應用

酶蛋白在反應溫度條件下分子結構的穩定性是其發揮催化作用的關鍵，探明茶葉PPO及其同工酶在不同溫度條件下的熱穩定性，可為其實際應用提供理論依據。內源PPO在植物生理代謝及茶葉加工中的重要作用已無需贅言，外源PPO在紅茶發酵及茶黃素制備等方面應用前景亦十分廣闊[10，19]。在實際生產中，紅茶發酵和體外酶促制備茶黃素等過程反應溫度均在30 ℃左右，這與PPO粗酶、PPOⅡ和PPOⅢ在30 ℃時熱穩定性高是相一致的。由此可見，在紅茶生產中進行鮮葉萎凋和渥紅發酵以及體外樣化制備茶黃素等，均需注意控制溫度，維持PPO酶活性，促進氧化過程的進行。

參考文獻：

[1] ？譈MIT ？譈 M，SELIN N Y，■ENER A. Exraction， partial purification and characterisation of polyphenol oxidase from tea leaf（Camellia sinensis）[J]. GIDA，2011，36（3）：137-144.

[2] RAJANNA L， RAMAKRISHNAN M. Isozyme studies on some selected Camellia clones[J].International Journal of Engineering Science and Technology，2010，2（12）：6918-6921.

[3] 李榮林，方輝遂.一個世紀以來茶多酚氧化酶研究的進展[J].福建茶葉，1997（4）：10-14.

[4] JYOTSNABARAN H， PRODIP T，BHADURI A N.Isolation and characterization of polyphenol oxidase from Indian tea leaf（Camellia sinensis）[J].The Journal of Nutritional Biochemistry，1998，9（2）：75-80.

[5] TAKEO T，URITANI I.Tea leaf polyphenol oxidase part II. Purification and properties of the solubilized polyphenol oxidase in tea leaves[J].Agricultural and Biological Chemistry，1966， 30（2）：155-163.

[6] TAKEO T，BAKER J E. Changes in multiple forms of polyphenol oxidase during maturation of tea leaves[J].Phytochemistry，1973，12（1）：21-24.

[7] 許 雷，張書芹，陳盛虎，等.茶樹多酚氧化酶同工酶的分離純化[J].華中農業大學學報，2015，34（6）：114-118.

[8] 張書芹.龍井43號多酚氧化酶同工酶質譜鑒定與酶性質研究[D].武漢：華中農業大學，2014.

[9] 胡振長.綠茶殺青中多酚氧化酶活性變化的研究[J].食品科學，1988（2）：6-10.

[10] 譚振初，毛清黎，賈海云，等.利用外源天然酶提高紅碎茶品質研究初報[J].福建茶葉，1990（2）：18-21.

[11] 屠幼英.紅茶萎凋過程中多酚氧化酶生化特性的變化[J].茶葉科學簡報，1990（4）：16-19.

[12] 屠幼英，方 青，梁惠玲，等.固定化酶膜催化茶多酚形成茶黃素反應條件優選[J].茶葉科學，2004（2）：129-134.

[13] 吳紅梅.多酚氧化酶酶源篩選及酶法制取茶色素研究[D].合肥：安徽農業大學，2004.

[14] 谷記平.茶黃素酶促氧化制備技術的研究[D].長沙：湖南農業大學，2004.

[15] 劉敬衛.茶樹多酚氧化酶的基因克隆與原核表達[D].武漢：華中農業大學，2009.

[16] 王乃棟.茶多酚氧化酶基因的克隆及其工程菌的構建[D].山東泰安：山東農業大學，2012.

[17] 許 雷.茶樹多酚氧化酶的提取、分離純化及其部分酶性質研究[D].武漢：華中農業大學，2014.

[18] 許 雷，張書芹，徐小云，等.龍井茶樹多酚氧化酶蛋白提取方法的優化[J].食品安全質量檢測學報，2015（4）：1237-1242.

[19] 袁新躍.樹脂固定化多酚氧化酶及其催化茶多酚形成茶黃素的研究[D].北京：中國農業科學院，2009.

[20] 劉 琨.茶葉多酚氧化酶酶學特性及紅外對其活力與構象的影響[D].江蘇無錫：江南大學，2013.

[21] 榮紹豐，高紅亮，常忠義，等.一些蛋白質和多肽對谷氨酰胺轉胺酶熱穩定性的影響[J].食品工業科技，2006（12）：95-97.