上海株犬冠狀病毒的分離鑒定及S基因的遺傳進化分析

（山東畜牧獸醫職業學院，山東濰坊 261061）

上海株犬冠狀病毒的分離鑒定及S基因的遺傳進化分析

沈美艷，孫秋艷，李 舫，王彩霞

（山東畜牧獸醫職業學院，山東濰坊 261061）

利用A72細胞（犬纖維肉瘤細胞系）從上海市某寵物醫院臨床表現為急性胃腸炎癥狀的幼犬腹瀉糞便中分離到1株病毒，通過噬斑純化、病毒理化特性檢測以及動物回歸實驗和RT-PCR鑒定，證明所分離到的病毒為犬冠狀病毒（Canine coronavirus，CCV），將其命名為CCV-SHdc株。根據GenBank公布的CCV S基因序列，設計合成4對特異性引物，利用RT-PCR成功擴增獲得CCV-SHdc株S基因序列，同時進行序列測定和核苷酸系統發育進化樹繪制。結果顯示，CCV-SHdc株的S基因序列全長4 364 bp；該毒株與日本分離的CCV 5821株親緣關系最近，處于同一分支，與意大利分離的CCV 23/03和CCV Elmo/02株親緣關系較遠。核苷酸與氨基酸同源性分析表明，CCV-SHdc株與CCV 23/03和CCV Elmo/02株可能屬于不同基因型，已有很多點發生突變，這種突變的累積有可能引起病毒毒力的變化。

犬冠狀病毒；分離鑒定；S基因；RT-PCR；遺傳進化分析

犬冠狀病毒（Canine coroanvires，CCV）是引起犬冠狀病毒病的主要病原[1]，1971年由Binn等[2]首次從腹瀉的德國軍犬中分離到，之后世界各地相繼有報道[3-5]。CCV可感染不同年齡、性別、品種的犬，但以幼犬發病率最高，狼、大熊貓等其它動物也有易感性[6-8]。CCV主要引起犬的急性胃腸炎，臨床上表現為頻繁嘔吐、腹瀉、沉郁、厭食，發病率和死亡率均較高。該病毒既能單獨致病，也能與其他病原發生混合感染，是當前對我國養犬業危害較大的病原。CCV具有高傳染性，其分離鑒定和早期確診對該病的預防控制具有重要意義。

CCV是一類有包膜的單股正鏈RNA病毒，基因組編碼4種結構蛋白。其中，纖突蛋白（S）位于病毒最外層，具有嚴格的細胞感染特異性。S蛋白的N端與宿主細胞表面的受體結合，可使病毒與細胞膜靠近，并參與膜融合。這在病毒侵染細胞的過程中起著至關重要的作用。S蛋白含有的抗原表位是誘導機體產生中和抗體的主要保護性抗原。S蛋白的C端參與病毒粒子的裝配及蛋白的胞內運輸，并在一定程度上決定病毒的致病性，是CCV致病作用的主要成分。因此研究S基因有利于了解冠狀病毒的基因重組、抗原變異、病毒感染細胞機制和基因變化規律。

本研究從上海市某寵物醫院臨床表現為急性胃腸炎癥狀的3月齡幼犬腹瀉糞便中，通過細胞分離培養，成功分離到1株病毒，并通過病毒理化特性檢測、動物回歸實驗和RT-PCR鑒定，確診分離的病毒株為CCV。為研究該毒株與其他CCV的親緣關系，對分離毒株的S基因進行測序，并對分離毒株的遺傳進化進行探討。

1 材料和方法

1.1 細胞及毒株

A72細胞（犬纖維肉瘤細胞系）、MDCK細胞及參考毒株CCV 1-71株，由本實驗室保存。

1.2 試劑

病毒RNA提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司；AMV第一鏈cDNA合成試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 病毒分離

將采集的糞便用含15%胎牛血清的DMEM培養液1:4稀釋，9 000 r/min 離心30 min；用0.22 μm的微孔濾膜過濾上清液，將其接種于長滿單層的A72細胞和MDCK細胞；將不出現細胞病變效應（CPE）的病毒連續傳7代，如仍不出現CPE則視為陰性；如有CPE，就繼續傳代，直到CPE穩定；然后進行噬斑試驗，純化病毒。

1.4 噬斑試驗

[9]中的方法進行。

1.5 病毒理化特性試驗

1.5.1 病毒核酸類型的鑒定。用5-BUDR（5-溴脫氧尿核苷）法進行鑒定[10]。

1.5.2 病毒抵抗力的鑒定。將分離的病毒相應處理后，接種A72細胞，進行耐乙醚、耐氯仿、耐胰酶、耐酸、耐熱等試驗[10]。

1.6 病毒TCID50的測定

按Reed-Muench法測定病毒的TCID50。

1.7 動物回歸試驗

取5只3月齡SPF幼犬，隨機分成2組（試驗組3只、對照組2只）。將CCV-SHdc經口接種試驗組幼犬，劑量為10 000 TCID50/只；對照組用同樣的方法和劑量接種無菌細胞培養液。觀察病毒對幼犬的致病性，同時進行病原分離。

1.8 RT-PCR的鑒定

1.8.1 引 物 合 成。 參 照GenBank編 號 為AY796289.1的CCV S基因的核苷酸序列，設 計1對特 異 性 引 物，Primer（Forward）：5'GCAACTAGTTCTGATTTTGTTC 3'；Primer（Reverse）：5'GCGTTAATTAACCTGCAGGGGCTGTGA 3'，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.8.2 RNA的提取。將參考株CCV 1-71、處理后的糞便上清液、第11代細胞培養物、純化病毒和動物回歸試驗中的腸道病料，按照病毒RNA提取試劑盒說明書提取RNA。參考株CCV 1-71作為陽性對照。

1.8.3 cDNA的合成。按照AMV第一鏈cDNA合成試劑盒說明書合成cDNA。

1.8.4 PCR反應。按參考文獻[9]中的方法進行。

1.9 CCV-SHdc株S基因遺傳進化分析

1.9.1 引物合成。參照GenBank中CCV S基因的核苷酸序列，設計4對引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.9.2 RT-PCR擴增。實驗方法同1.8。

1.9.3 目的片段回收及測序。用天根公司生產的瓊脂糖凝膠回收試劑盒，分別回收純化病毒的PCR產物，送往上海杰李生物工程技術有限公司進行測序。

表1 CCV S基因的引物設計

1.9.4 S基因序列分析。將得到的4個S基因片段拼接成完整的S基因序列，應用DNAStar軟件，將拼接完整的S基因序列與GenBank中登錄的9株CCV毒株的完整S基因序列，進行同源性比較，并繪制系統發育進化樹。

2 結果

2.1 CCV分離培養

將處理好的病毒液分別接種A72細胞、MDCK細胞，盲傳至第7代，24 h后觀察到明顯的CPE；48 h后，85%的單層細胞脫落，對照細胞正常。MDCK細胞在盲傳第7代后仍無病毒生長。

2.2 噬斑試驗

CCV-SHdc株在A72細胞上形成的噬斑同參考毒株CCV 1-71形成蝕斑特征相同，蝕斑形態均一，直徑在5 mm左右，外形圓而規則（圖1）。

圖1 CCV 1-71和CCV-SHdc株在A72細胞上形成的噬斑

2.3 病毒理化特性試驗

2.3.1 病毒核酸類型。試驗組的TCID50為10-5.41/0.1 mL，對照組的TCID50為10-5.57/0.1 mL，二者的TCID50的對數差值小于1，表明5-BUDR不能抑制該病毒的增殖，證明該毒株的核酸類型為RNA。

2.3.2 病毒抵抗力。病毒抵抗力的試驗結果表明，分離的病毒株均耐酸、耐胰酶，對乙醚、氯仿、熱較敏感，符合RNA病毒的特性。

2.4 病毒TCID50的測定CCV-SHdc第11代培養物的TCID50為10-5.57/0.1 mL。

2.5 動物回歸試驗

在接種28 h后，試驗組幼犬出現精神沉郁、厭食、嘔吐、腹瀉；接種48 h后，腹瀉加重，糞便呈灰白或淡黃色，并帶有腥臭氣味，體重下降，脫水；第7天，實驗組幼犬死亡1只，剖檢發現腸管擴張變薄，充滿液體，小腸壁變薄，腸黏膜充血、出血，腸系膜淋巴結腫大；第10 天，犬全部死亡，說明分離病毒株的毒力較強。應用RT-PCR方法檢測試驗組糞便處理液，結果CCV均為陽性，對照組為陰性。

2.6 RT-PCR的鑒定

CCV-SHdc毒株病料處理液、純化病毒、第11代細胞培養物和動物回歸試驗中的腸道病料均能擴增出與參考株CCV 1-71相同的553 bp目的片段（圖2），從而確定該株病毒為CCV。對照組的犬腸道病料擴增結果為陰性。

圖2 RT-PCR鑒定結果

2.7 S基因遺傳進化分析

2.7.1 遺傳進化分析。將CCV-SHdc株S基因序列與GeneBank中登錄的9株CCV毒株（基因登錄號分別為CCV1-71：AY 796289.1；CCV-V1：AY390342.1；K378：X77047.1；23/03：AY307021.1；Elmo/02：AY307020.1；5821：AB017789.1；CCV-6：A22882.1；V54：A22886.1；GP：AY436637.1）的相應完整S基因序列，繪制核苷酸系統發育進化樹。結果顯示，CCV-SHdc株與日本分離的CCV 5821株親緣關系最近，處于同一分支，與意大利分離的CCV 23/03和CCV Elmo/02株親緣關系較遠（圖3）。

圖3 CCV-SHdc分離株S基因進化樹分析

2.7.2 核苷酸與氨基酸同源性分析。CCV-SHdc株 與 23/03、5821、Elmo、GP、K378、V54、1-71、CCV-6和CCV-V1株的核苷酸序列同源性分別為38.3%、99.5%、36.4%、90.6%、90.4%、76.6%、90.7%、49.8%和90.6%，氨基酸序列同源性分別為43.7%、98.5%、44.2%、91.9%、91.7%、4.2%、92.3%、6.3%和92.1%（表2）。

表2 CCV-SHdc株與CCV毒株S基因核苷酸和氨基酸序列的同源性比較

3 討論

CCV通過其表面纖突和易感細胞表面的特異性受體結合可侵入易感細胞。由于CCV纖突較大，在理化因素的作用下極易脫落，所以本實驗在對采集的糞便病料進行初步處理時，采用了含10%胎牛血清的DMEM進行稀釋，這樣可以提高分離CCV的成功率。Binn等[11]在首次從腹瀉的軍犬糞便中成功分離到CCV的過程中，采用犬腎原代細胞，并向培養液中添加多聚葡萄糖等營養成分。Keenan等[12]采用同樣方法分離獲得成功。Binn等[13]建立了對CCV極為敏感的犬纖維瘤傳代細胞系，即A72細胞；Carmichael等[13]采用該細胞系相繼分離到CCV。

CCV在適應細胞之前，培養很不穩定，也不易產生細胞病變。因此，本實驗選擇了最為敏感的傳代細胞系A72細胞來分離CCV，而且盡可能的盲傳多代，直到CPE穩定后，才對病毒進行其它鑒定。初次分離的CCV在MDCK細胞上很難生長，所以A72細胞是分離CCV病毒的最適生長細胞，可對分離到的病毒株做出初步鑒定。由于糞便中病毒種類較雜，TGEV（豬傳染性胃腸炎病毒）、FCV（貓冠狀病毒）等也能在A72細胞上生長，所以本實驗采用噬斑克隆進行病毒純化。不同病毒在同種細胞上形成的蝕斑特征不一樣，同一種病毒在同一種細胞上形成蝕斑特性一般比較穩定，因此根據分離株與CCV參考株相同的噬斑特征，可以提高病毒的檢出率。

由于糞便中常存在類似CCV的病毒粒子，因此電鏡檢查的結果并不理想，所以本實驗沒有采用電鏡，而是通過病毒理化特性進行病毒的形態學鑒定，證實該病毒是一種有囊膜、對熱比較敏感的RNA病毒，符合CCV理化特性。為了深入研究分離病毒的致病性，采用動物回歸試驗，發現攻毒組動物出現特征性的CCV臨床癥狀和病理剖檢變化，由此證實分離毒株對犬有致病性，為深入開展該病毒的致病機理奠定了基礎。本實驗最后采用RT-PCR方法鑒定分離毒株，排除了細小病毒感染的可能，結合序列測定和分析，確證分離的病毒為CCV。

核苷酸系統發育進化樹表明，CCV-SHdc株與意大利分離的CCV 23/03和CCV Elmo/02株親緣關系最遠，核苷酸同源性為38.3%和36.4%，氨基酸的同源性為43.7%和44.2%；與5821、GP、K378、1-71和CCV-V1株核苷酸同源性在90.4%～99.5%之間，氨基酸的同源性在91.7%～98.5%之 間。CCV 23/03和CCV Elmo/02株與其他毒株核苷酸同源性分別在36.5%～38.3%和35.8%～38.3%之間，氨基酸的同源性分別在4.5%～44.6%和4.2%～44.4%之間，因此CCV 23/03和CCV Elmo/02株在系統發育進化樹上處于獨立同一分支。由此說明CCV-SHdc株與CCV 23/03和CCV Elmo/02株可能屬于不同的基因型，CCV 23/03和CCV Elmo/02株屬于同一基因型。目前CCV仍只有1個基因型，但也曾有新基因型CCVⅠ型存在的報道。CCV-SHdc株與荷蘭分離的CCV-6和CCV-V54株核苷酸同源性分別為76.6%和49.8%，氨基酸的同源性分別為4.2%和6.3%，由此說明CCV-SHdc株S基因已有多點發生突變。CCV-6和CCV-V54株都是強毒株，這種突變的累積有可能引起病毒毒力的變化[14]。這個問題有待進一步研究。

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（責任編輯：朱迪國）

Isolation and Identi fi cation of Canine Coronavirus Shanghai Strain and Phylogenetic Analysis of S Gene

Shen Meiyan，Sun Qiuyan，Li Fang，Wang Caixia
（Shandong Vocational Animal Science and Veterinary College，Weifang，Shandong 261061）

A strain of virus was isolated by A72 cells from feces of a diarrhea puppy with clinical manifestation of acute gastroenteritis in a pet clinic in Shanghai city. Through identi fi cation experiments containing plaque puri fi cation，detection of physicochemical properties，animal regression test，and RT-PCR method，the virus strain was con fi rmed as canine coronavirus（CCV）and named CCV-SHdc. Based on the sequence of S gene of CCV published in GenBank，4 pairs of primers were designed to ampli fi ed S gene by RT-PCR. Then sequencing the ampli fi ed gene and drawing a phylogenetic tree. Results indicated that the length of S gene of CCV-SHdc was 4 364 bp. It was closest to strain CCV 5821 that isolated from Japan，belonging to the same one clade，however，it has a farther relationship with CCV 23/03 and CCV Elmo/02 of Italy strain. Analysis of amino acid homology and nucleotide sequence homology indicated genotype of CCV-SHdc strain may be different from strains of CCV 23/03 and CCV Elmo/02. CCV-SHdc strain had multipoint mutation，the accumulation of which would lead to virulence change

canine coronavirus；isolation and identi fi cation；S gene；RT-PCR；phylogenetic analysis

S852.65

B

1005-944X（2017）03-0097-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.03.025

山東省濰坊市科學技術發展計劃（2015GX054）

李 舫