犬用鹽酸特比萘芬噴霧劑處方篩選及含量測定研究

馬軍明，楊柳，杜守穎，譚寧,趙夢迪，王承，白潔，陸洋(北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102)

犬用鹽酸特比萘芬噴霧劑處方篩選及含量測定研究

馬軍明，楊柳，杜守穎，譚寧,趙夢迪，王承，白潔*，陸洋*
(北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102)

對犬用鹽酸特比萘芬噴霧劑進行處方篩選并對鹽酸特比萘芬進行含量測定。以噴霧劑成型性為指標優選出2%月桂氮卓酮(水溶性)，0.35 g/L苯甲酸鈉，10 % Kolliphor?HS 15和適量高純水制成水溶液。采用HPLC法測定該處方中有效成分鹽酸特比萘芬的含量,結果顯示鹽酸特比萘芬在0.0201～0.4026 mg/mL的濃度范圍內線性關系良好，回歸方程為Y=2.652×107X-2.418×104(r=0.9998，n=6)，平均回收率為104.14%，RSD為1.23%。通過采用HPLC法測量有效成分鹽酸特比萘芬的含量穩定，所篩選的處方工藝可行，制備方法簡單方便。

鹽酸特比萘芬；噴霧劑；處方篩選；含量測定

犬類皮膚真菌病又稱癬，是由皮膚真菌(小孢子菌屬和毛癬菌屬)侵入皮膚被毛和爪部，寄生或腐生于表皮，角質，被毛和爪部的角質蛋白組織中所引起的一種真菌性傳染病[1]。今年，犬類疾病遍布全國，尤其伴隨著人們養寵物狗的數量增多，患病犬類的數量也越來越多，因此這類疾病對犬類和犬類主人造成極大壓力和痛苦。鹽酸特比萘芬(Terbinafine hydrochloride)是一個丙烯胺類藥物，對于皮膚類、發和甲的致病性真菌均有廣泛的抗真菌活性。該藥的作用機制是高選擇性抑制真菌角鯊烯環氧化酶，使真菌細胞膜形成過程中角鯊烯環氧化反應受阻，起到抑菌作用；該藥抑制角鯊烯環氧化酶后，其前體角鯊烯在細胞內大量積聚，導致真菌細胞中毒死亡，起到殺菌作用[2]?？诜蚓植渴褂帽酒?能有效治愈須發癬菌或大小孢子菌引起的動物實驗性皮膚感染。本實驗考慮到，近年來國內市場上，治療動物的皮膚病類藥物較少，故本實驗進行了篩選處方制作鹽酸特比萘芬噴霧劑的研究。

1 材 料

1.1 儀器 LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津公司)；BSA224S型電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)；KQ5200DA型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。1.2 試劑與藥品 鹽酸特比萘芬原料藥(濟南明鑫制藥股份樣公司，批號13125510)；鹽酸特比萘芬對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號100563-201402)；純凈水(杭州娃哈哈集團)；甲醇(Fisher，色譜純)；四氫呋喃(Fisher，色譜純)；磷酸(北京化工廠，色譜純)；甲基氫氧化銨(國藥集團化學試劑有限公司)；苯甲酸鈉(北京市旭東化工廠)；Kolliphor?HS 15(4832876E0 德國BASF公司)；月桂氮卓酮(藥用標準,湖北武漢遠成生物科技發展有限公司)。

1.3 實驗動物 中華大蟾蜍，雌雄兼用，30～40 g，由北京閻村新生蟾蜍養殖中心提供。

2 方法與結果

2.1 鹽酸特比萘芬噴霧劑的處方篩選

2.1.1 根據藥物在不同溶劑中的溶解性來篩選溶劑 取鹽酸特比萘芬適量，分別溶于100 mL的高純水、PBS緩沖液、30%PEG-200溶液、30%PEG-400溶液、5% Kolliphor?HS 15[3]溶液、10% Kolliphor?HS 15溶液中，超聲15 min，以溶解性和溶液澄清度、顏色為觀察指標，觀察現象見表1。

表1 溶劑觀察指標

結果表明，30%PEG-400溶液、10% Kolliphor?HS 15溶液在溶解鹽酸特比萘芬后，溶解性、澄清度以及顏色符合要求。初步篩選，以上兩種溶液為噴霧劑的溶劑。

2.1.2 通過溶劑對黏膜刺激性研究進一步篩選溶劑 由于采用外用給藥形式時，可能應用到由于真菌感染引起的破損皮膚，因此需要考察溶劑對破損皮膚的刺激性。皮膚破損后黏霧暴露，可以借鑒黏膜刺激性的研究方法，考察溶劑的刺激性。采用在體蟾蜍實驗方法，選用文獻公認有嚴重纖毛毒性的去氧膽酸鈉作為陽性對照品，以生理鹽水作為空白對照，分別評價30%PEG-200、30%PEG-400、10% Kolliphor?HS 15溶液的纖毛毒性，結果見圖1。

1．生理鹽水；2． 1%去氧膽酸鈉；3． 30%PEG200；4． 30%PEG400；5． 10%Kolliphor?HS 15與生理鹽水比較，*P<0.05,**P<0.01圖1 各給藥組纖毛持續運動時間

結果表明，給予陽性藥1%去氧膽酸鈉組纖毛持續運動時間與生理鹽水相比有顯著性差異，說明其對纖毛有很大毒性，與文獻報道相符；給予30%PEG-200、10% Kolliphor?HS 15的纖毛持續運動時間與生理鹽水相比沒有顯著性差異，說明其對纖毛作用基本無影響，即無纖毛毒性；而30%PEG-400藥物的纖毛持續運動時間與生理鹽水相比有差異，說明其對纖毛有一定的毒性，不能作為噴霧劑的溶劑。結合溶解度試驗，由于鹽酸特比萘芬在30%PEG-200中難以達到有效的治療濃度，因此選擇10%Kolliphor?HS 15為溶劑[4]。

2.1.2 處方中促透劑與防腐劑的篩選 按照未加促透劑與防腐劑的處方輔料比例配制鹽酸特比萘芬噴霧劑溶液，以10% Kolliphor?HS 15為溶劑，分別選擇1%、2%、3%濃度的氮酮[5]，0.25 g/L、0.3 g/L、0.35 g/L的苯甲酸鈉[6]配組，按照《中國藥典》[7]2015版四部噴霧劑制備準則制備以及藥用輔料常用量進行設計制備噴霧劑溶液，以藥液pH值穩定性和促透效果[8]為指標，結合生產成本考慮，初步篩選處方為6。結果見表2。

表2 篩選數據表

2.3 處方與制備

2.3.1 處方 鹽酸特比萘芬適量， 2%氮酮(水溶性)，0.035%苯甲酸鈉， 10%Kolliphor?HS 15，適量高純水制成鹽酸特比萘芬水溶液。

2.3.2 制備 取10 g Kolliphor?HS 15于適量去離子水中，超聲振蕩使其溶解。向溶液中加苯甲酸鈉溶解后加入鹽酸特比萘芬繼續超聲振蕩溶解，最后在溶解中加入氮酮(水溶性)，待溶解完全，放入干凈的噴瓶中，即可。

2.3.3 性狀 按照處方工藝制備的鹽酸特比萘芬噴霧劑為微黃色透明溶液。

2.3.4 pH值 分別取三批的鹽酸特比萘芬噴霧劑樣品，批號分別為20151101、20151102、20151103,各取兩個樣品測定pH值，結果見表3，三批樣品的pH值均在3.6～4.1之間，符合要求。

表3 測量三批樣品的pH數據

2.4 鹽酸特比萘芬噴霧劑含量測定

2.4.1 色譜條件 參照文獻[9-10]方法，色譜柱：Merck KGaA Hibar-C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-四氫呋喃-四甲基氫氧化銨(60∶20∶20)為流動相，流速1 mL/min，檢測波長280 nm，(取25%四甲基氫氧化銨5.8 mL，加水800 mL，用0.7 mol/mL磷酸溶液調pH值至7.8，加水稀釋至1000 mL)(60∶20∶20)；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫，進樣量20 μL。

2.4.2 對照品溶液的制備 按照所需濃度精密稱取鹽酸特比萘芬對照品，置50 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，微孔濾膜濾過，取續濾液，作為對鹽酸特比萘芬對照品溶液[9]。

2.4.3 供試品溶液的制備 將不同批次樣品，精密吸取0.25 mL的樣品(相當于鹽酸特比萘酚約2.5 mg)，置25 mL棕色瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。

2.4.4 線性關系考察 按照2.4.2項下對照品配制方法，配制濃度為0.4026 mg/mL的鹽酸特比萘酚對照品。精密取0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10 mL，置于10 mL容量瓶中甲醇稀釋至刻度線，配制濃度分別為0.0201、0.0403、0.0805、0.1610、0.2416、0.3221、0.4026 mg/mL的對照品溶液。取不同濃度對照品溶液，按2.4.1項下色譜條件進樣，以鹽酸特比萘芬吸收峰面積為縱坐標(Y)，進樣濃度(X, mg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程Y= 2.652×107X-2.418×104(r=0.9998，n=6),表明鹽酸特比萘芬在0.0201～0.4026 mg/mL的濃度范圍內線性關系良好。2.4.5 重復性考察 按照2.4.3項下方法，配制成濃度為0.100 mg/mL供試品溶液，6份，按2.4.1項下色譜條件進樣，計算鹽酸特比萘芬含量平均值及RSD值。樣品鹽酸特比萘芬平均含量為0.100 mg/mL，RSD為1.48%，表明樣品重復性良好。

2.4.6 精密度考察 按照2.4.2項下方法，配制濃度為0.100 mg/mL的對照品溶液，按2.4.1項下色譜條件進樣，日內重復進樣6次進行測定，記錄峰面積，計算精密度。計算得峰面積的RSD為0.13%，表明儀器精密度良好。

2.4.7 穩定性考察 按照2.4.3項下方法，配制成濃度為0.100 mg/mL供試品溶液，6份，按2.4.1項下色譜條件分別于0、2、4、8、10、12 h進樣檢測，計算色譜圖和峰面積。計算峰面積的RSD為1.06%，表明供試品12 h內穩定性良好。

2.4.8 加樣回收率實驗 按照2.4.2項下方法，配制已知鹽酸特比萘芬含量0.25 mg/mL的溶液，從中精密吸取10 mL共6份，加入到50 mL容量瓶中，再精密量取0.25 mL鹽酸特比萘芬樣品6份，分別加入容量瓶中，甲醇稀釋到刻度，搖勻，制成加樣回收液。按2.4.1項下色譜條件進樣測定，計算回收率及RSD值，結果見表4。

表4 供試品加樣回收率實驗結果

2.4.9 色譜圖 鹽酸特比萘芬噴霧劑陰性對照溶液、對照品溶液及樣品處理液的色譜圖，見圖2，鹽酸特比萘芬的保留時間為12.5 min左右，理論塔板數為11788。陰性對照品為按照鹽酸特比萘芬噴霧劑處方，不添加鹽酸特比萘芬藥物而制備。2.4.10 樣品含量測定 配制3批噴霧劑溶液，按照2.4項下方法制得鹽酸特比萘芬供試品與對照品溶液；按2.4.1色譜方法測定，三批樣品的含量分別99.02%、99.03%、100.45%，均符合規定[11]。

A:陰性對照溶液; B:對照品溶液; C:樣品處理液圖2 鹽酸特比萘芬噴霧劑色譜圖

3 討論與小結

本品是針對寵物犬類研究的一種藥品，這從對動物的抗真菌類外用制劑藥物來說是一個創新與突破。根據文獻報道，鹽酸特比萘芬劑型有很多，一般有乳膏劑、栓劑、凝膠、搽劑等，但這些都屬于長效性的藥物，對于寵物犬來說，這些劑型在給藥方面會很困難。而采用噴霧給藥，與其他劑型相比較，藥物直接到達作用部位，給藥時與給藥部位無直接的機械摩擦，從而減少了對皮膚的損傷或刺激，具有使用方便，吸收快，噴霧均勻等優勢[12]。

在溶劑篩選上，本研究選擇黏膜刺激性低的10% Kolliphor?HS 15作為有效成分的溶劑，與其他溶劑相比，其優勢在于其生物相容性好、增溶能力強、穩定性高、粘度低，同時具有毒性低的特點。

經皮制劑通常需要加入促透劑促進有效成分透皮吸收。月桂氮卓酮(簡稱氮酮)是一種新型高效、無毒、無刺激性的透皮吸收促進劑，能改變皮膚角質層結構，促進藥物吸收，對親水性和疏水性成分均有較好的促滲作用，是目前國內外常用的滲透促進劑。研究表明，氮酮對于多數制劑的促進作用優于其他化學滲透劑，外用藥物制劑中單用氮酮在1%～6%濃度時促滲作用較好；另外，氮酮對一些細菌、真菌也有抑制作用[13]。

噴霧劑長時間放置會滋生細菌，需要加入防腐劑。苯甲酸鈉是目前最常用的防腐劑，性質穩定、易溶解水，對多種細菌、霉菌及酵母菌都具有防腐作用。苯甲酸鈉屬于酸性防腐劑，在酸性條件下防腐效果較好，而鹽酸特比萘芬噴霧劑pH值在3.7～4.1，所以本實驗選用苯甲酸鈉作為防腐劑，符合藥典要求[11]。

該制劑試應用于犬類真菌性疾病，我們對2只患有體癬的犬采用噴霧劑治療4周,觀察皮膚表面患病處明顯改善有效率100%。治療8周，觀察皮膚患病處大部分好轉。對于治療犬的癬類疾病療效差異，需要根據患病動物的病情而定。

鹽酸特比萘芬噴霧劑的應用可降低治療真菌性癬類疾病的痛苦，減輕人們對治療寵物犬類疾病帶來的生活壓力。對治療動物皮膚病，提供新路，而且本品都是采用較為廉價的藥物輔料制成，從生產成本的角度考慮亦有重要意義。

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[3] 祁星星,李暢,孫春萌，等.一種以Kolliphor?HS 15為增溶劑的參麥注射液的穩定性和安全性研究[J].中國新藥雜志,2014, 23(21): 2536-2541.

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(編輯：李文平)

Prescription-screening and Determined the Content of Hydrochloride Terbinafine Sprays for Dogs

MA Jun-ming，YANG Liu，DU Shou-ying，TAN Ning，ZHAO Meng-di，WANG Cheng，BAI Jie*，LU-Yang*
(SchoolofChinesePharmacyBeijngUniversityofTCM，Beijing100102,China)

The present experiment focused on the dogs with hydrochloride terbinafine sprays which the prescription was screening and the content of hydrochloride terbinafine was going to be determined. Forming the spray which was based on the index of its formability, the prescription were made up of laurocapram(water-soluble), sodium benzoate, 10% Kolliphor?HS 15 and purity water that formulated the aqueous solution. Then the active ingredient content of terbinafine hydrochloride was determined by HPLC. The content determination of hydrochloride terbinafine concentration in the range of 0.0201～0.4026 mg/mL had a good linear relationship, the regression equation wasY=2.652×107X- 2.418×104(r=0.9998,n=6), the average rate of recovery was 104.14%,RSDwas 1.23%.The active ingredient content of hydrochloride terbinafine was stable by HPLC. The screened prescription was feasible, and the formulation process of preparation was simple.

terbinafine hydrochloride；spray agent；prescription-screening；content determination

2016-09-03

A

1002-1280 (2017) 02-0049-05

S859.79

北京市科技新星計劃資助(xx2015A048)；2015年青年骨干教師專項(2015-JYB-QNJSZX004)

馬軍明，碩士研究生，從事中藥制劑新劑型與新技術研究。

白潔，E-mail：baijie22811@163.com；陸 洋，E-mail：landocean28@163.com