五株雞傳染性支氣管炎病毒流行株的分離鑒定

宋新宇+馬爽+李陸梅+趙鵬+竇小龍+王紅+范跟成

摘要：2012年1月-2014年8月，從全國多地出現傳染性支氣管炎發病養雞場（戶）中采集?。ㄋ溃╇u氣管、腎臟和腺胃進行流行病學調查。根據各地分離株與YB160株S1基因分子進化樹分析，篩選出5個代表性的毒株，在SPF雞胚中傳至第5代，分別進行毒價測定、無菌檢驗及對SPF雞的致病力研究。結果，所篩選出的5個流行株在SPF雞胚傳至第5代時，毒價均大于或等于106.1EID50/0.1 mL，菌檢陰性，人工感染試驗接種1日齡SPF雞，可引起試驗雞出現典型傳染性支氣管炎癥狀。

關鍵詞：雞傳染性支氣管炎；分離鑒定；流行株；QX型

中圖分類號：S852.65 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）23-6187-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.046

Abstract：From January， 2012 to April，2014，we did epidemiological investigation by collecting tracheas，kidneys and glandular stomachs of diseased chickens from emerged the infectious bronchitis disease chicken farms（households）. According to the analysis of local isolates and YB160 strains S1 gene molecular evolutionary tree，we sifted five representative strains. We spread the five strains to the fifth generation with SPF chicken embryo，then we did drug price determination，sterile inspection and the pathogenicity study of SPF chicken of each strain. In the results，we found that when the five strains spread to the fifth generation，drug prices were all higher than 106.1EID50/0.1 mL，sterile inspections were all negative，and artificial infections used 1 day-old SPF chicken could cause typical symptoms of infectious bronchitis.

Key words：Avian infectious bronchitis virus； isolation and identification； epidemic strain； QX type

雞傳染性支氣管炎（Infectious Bronchitis，IB）是由冠狀病毒科（Coronavirdae）冠狀病毒屬（Coro-nav irus）的傳染性支氣管炎病毒（Infectious bron-chit is virus，IBV）引起的一種急性高度接觸性傳染性疫病[1，2]。自20世紀30年代在美國暴發以來，現已成為世界各地流行的重要禽病[2]。IBV是單股RNA病毒，該病毒基因可因點突變和重組而發生變異，故傳染性支氣管炎病毒血清型較多[2]。由于IBV的主要中和抗原表位和保護性表位主要由纖突蛋白（S 蛋白）的S1蛋白決定[2，3]，各血清型毒株之間的差異主要是S1基因變異造成的[4]，所以，針對S1基因的研究在IBV的流行病學研究中具有重要代表意義。

由于IBV疫苗的大量使用所帶來的的免疫選擇壓力，大量的流行病學監測結果顯示，近年來國內流行的IBV毒株處于持續不斷的進化當中。QX型毒株是近十多年才開始流行的新的基因型，其原型株QXIBV最早由農業部動物檢驗所于1996年分離自青島某發生腺胃炎的雞群（動物回歸試驗未復制出腺胃炎病變）[5]，但直到2004年該型病毒才被證實在國內廣泛流行，臨床表現主要為腎病變和不同程度的腺胃病變；而包括俄羅斯、荷蘭、比利時、德國、法國等在內的多個歐洲國家也在同一時期發現存在該型毒株的流行。根據韓宗璽等[6]對1995～2009年共計15年間國內可檢索到S1基因全長序列的所有IBV分離株進行的遺傳進化分析，結果顯示國內至少同時流行10個以上基因型的IBV毒株，但QX型（也稱LX4型）為最主要的優勢基因型（54.1%）。根據最近的研究報道，在2009年以后國內分離株中，QX型毒株所占的比重至少在65%以上[7-10]。根據文獻的報道，現有疫苗對QX型毒株交叉免疫保護性較低[11]，因此研制相應血清型的新型疫苗的需求日益迫切。

為滿足市場需求，青島易邦生物工程有限公司與普萊柯生物工程股份有限公司聯合研制了雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯活疫苗（La Sota株+YB160株），為驗證QX型IBV YB160株對當前流行株的交叉保護性，2012-2014年在各地區畜牧獸醫站、動物檢疫站和養殖場配合下進行IBV流行病學調查，根據各地分離株、經典疫苗株與YB160株S1基因分子進化樹分析，從當前主要流行型中，篩選出臨床發病較典型的5個有代表性的毒株CK/CH/SD/QD/2013/1株（簡稱“QD13株”）、CK/CH/SD/2013/2株（簡稱“SD2株”）、CK/CH/GD/2014/1株（簡稱“GD株”）、CK/CH/HLJ/2013/1株（簡稱“HLJ株”）及CK/CH/SX/2014/2（簡稱“SX株”）進行了分離鑒定。

1 材料與方法

1.1 病料

病雞氣管、腎臟和腺胃組織，采自全國多地養雞場（戶）。

1.2 引物

參照GenBank收錄的IBV S1基因序列保守區域設計，由上海英駿公司合成。上游引物IBV-87： 5′-TAT TGA TTA GAG ATG TTG GG-3′；下游引物S1 Oligo3′：5′-CAT AAC TAA CAT AAG GGC AA-3′。

1.3 主要試劑

病毒RNA提取試劑盒購自TIANGEN公司；AMV反轉錄酶、Taq DNA聚合酶及RNA酶抑制劑購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.4 方法

1.4.1 病毒的分離 無菌采集發病雞氣管、腎臟和腺胃，用無菌生理鹽水勻漿制成20%懸液，每毫升加入2 000 U青、鏈霉素，反復凍融3次，3 000 r/min離心15 min，取上清除菌后經尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，0.2 mL/胚，置37 ℃孵育觀察，孵化144 h，收集雞胚液。

1.4.2 分離病毒免疫原基因（S1）的RT-PCR擴增 取各組病料收獲的感染雞胚液進行S1基因的RT-PCR擴增，序列測定。并用MEGA5.05軟件進行序列比較和分析。

1.4.3 雞胚傳代及毒價測定 根據分離病毒免疫原基因序列比較和分析結果，選取5株代表毒株，分別尿囊腔內接種10日齡SPF雞胚，每胚接種0.1 mL，37 ℃孵育，培養36 h。棄去24 h內死亡雞胚，無菌收集雞胚液。按此方法連續傳代至第5代，并測定第5代的病毒含量。

1.4.4 無菌檢驗 取5株代表毒株連續傳代至第5代，分別按2010年版《中國獸藥典》附錄進行檢驗。

1.4.5 分離病毒第5代對SPF雞的致病力 ①人工感染試驗。用5株代表毒株第5代毒分別滴鼻接種1日齡SPF雞10只，104.0EID50/只，置負壓隔離器內飼養觀察14 d。②病理學觀察。將人工感染試驗病、死雞剖檢，觀察病變。

2 結果與分析

2.1 病毒分離結果

將無菌采集的病雞氣管、腎臟和腺胃制備20%的懸液，接種10日齡SPF雞胚，每胚尿囊腔接種0.2 mL，37 ℃孵化144 h，收集尿囊液并進行HA測定，同時觀察雞胚的變化。連續盲傳3～5代，各代尿囊液HA效價呈陰性，接種后部分雞胚出現早期死亡，死亡雞胚全身出血明顯，未死雞胚發育受阻，呈明顯的侏儒胚、蜷縮胚變化。

2.2 分離株S1基因RT-PCR擴增及分子進化樹分析結果

分離株S1基因RT-PCR擴增均可見到清晰的1.7 kb左右大小的條帶，與引物設計的預期結果相符。從進化樹看，當前IBV主要流行QX型。序列比對結果見圖1。

2.3 5株代表毒株的傳代及毒價測定

QD13株、SD2株、GD株、HLJ株及SX株在SPF雞胚中傳至第5代，5株分離毒均可致雞胚典型病變，死亡雞胚全身出血明顯，未死雞胚可見發育受阻，呈明顯的侏儒胚、蜷縮胚變化。分別取QD13株、SD2株、GD株、HLJ株及SX株第5代毒種測定病毒含量，結果顯示QD13株、SD2株、GD株、HLJ株及SX株第5代病毒含量分別為106.3、106.1、106.3、106.3和106.1EID50/0.1 mL。

2.4 無菌檢驗

按2010年《中國獸藥典》附錄進行檢驗。結果5株分離毒均無菌生長，無菌檢驗合格。

2.5 對SPF雞的致病力

2.5.1 人工感染試驗 用分離病毒QD13株、SD2株、GD株、HLJ株及SX株第5代各接種10只1日齡SPF雞，104.0EID50/只。接種后3～5日，開始發病，病雞精神沉郁、閉眼、羽毛蓬亂、采食和飲水急劇減少、拉黃白色或黃色或綠色稀便，伴有呼吸癥狀、呼吸有啰音。發病中后期消瘦衰竭死亡，在發病后5～7d處于死亡高峰，發病后期雞只表現發育極不整齊，大小不均。5株病毒接種的SPF雞發病率為80%～100%，死亡率為40%～60%（表1）。

2.5.2 病理觀察 人工感染試驗雞的病理變化基本相同。剖檢病雞和死雞，均極度消瘦，泄殖腔周圍有糞便粘污；雞腎臟腫大，有尿酸鹽沉積，可見明顯“花斑腎”；氣管黏膜潮紅或出血；個別雞腺胃腫大。其他器官在肉眼上未見明顯變化。

3 討論

1）近年來國內流行的IBV毒株處于持續不斷的進化當中。根據2012-2014年期間國內IBV流行病學調查結果，QX型已成為國內IBV主要流行基因型[13]。與Han等[6]、張小榮[12]報道的相一致。

2）2012-2014年間，我們進行IBV流行病學調查中共分離到69株IBV流行株。根據IBV S1基因的發表序列設計并合成一對可擴增IBV全長S1基因的寡核苷酸引物，兩引物間跨度約1.7 kb。RT-PCR擴增分離毒S1基因獲得了與預期大小相一致的目的條帶，證明分離毒符合雞傳染性支氣管炎病毒的特性。由于分離株太多，全部進行系統鑒定用時太長，故根據各地分離株、經典疫苗株與YB160株S1基因分子進化樹分析，僅從當前主要流行型（QX型）中，篩選出5株分布在不同區域的（山東、廣東、黑龍江及陜西）發病的臨床較典型IBV，S1基因同源性有一定差異的代表性毒株進行系統鑒定，作為流行株免疫保護試驗攻毒用毒株。

3）將這5株毒在SPF雞胚中傳至第5代后，毒價均可達106.1EID50及以上，人工感染試驗接種1日齡SPF雞，可引起試驗雞80%～100%發病，死亡率可達40%～60%。

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